CN103713056A

CN103713056A - 一种同时分析检测动物组织中残留兽药组分的方法

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Publication number: CN103713056A
Application number: CN201310607159.5A
Authority: CN
Inventors: 倪梅林; 钟莺莺; 葛晓鸣; 湛嘉; 俞雪钧
Original assignee: NINGBO ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU TECHNICAL CENTER OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA
Current assignee: NINGBO ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU TECHNICAL CENTER OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-11-25
Also published as: CN103713056B

Abstract

本发明公开了一种同时分析检测动物组织中残留兽药组分的方法：动物组织样品经过50%乙腈+乙醇匀浆、超声提取，正己烷净化，乙腈+乙醇进一步沉淀，浓缩后用UPLC-MS/MS在负离子模式下，进行多反应监测(MRM)测定，根据标准曲线和外标法定量，检测计算得到动物组织中46种残留兽药组分的含量。本发明方法可用于18种喹诺酮类药物、22种磺胺类药物以及氨苯砜、苯乙醇胺A、阿莫西林、金刚烷胺、金刚乙胺、乙氧基喹啉等目前常用到的兽药，可一次性同时快速准确检测，扩大了本方法的应用范围。

Description

一种同时分析检测动物组织中残留兽药组分的方法

一、技术领域

本发明涉及一种动物组织中常用兽药残留分析检测的方法，尤其是涉及动物组织中残留的18种喹诺酮类药物、22种磺胺类药物、2种抗病毒药、1种β内酰胺类，1种砜类抗菌药，1种喹恶啉类，1种β-激动剂类药物新型快速通用多组分同时分析检测方法。

二、背景技术

18种喹诺酮类药物（包括吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、奥比沙星、双氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西诺沙星、恶喹酸、萘啶酸、氟甲喹）；22种磺胺类药物（磺胺、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺二甲异嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧苄胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯哒嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹恶啉）；氨苯砜、苯乙醇胺A、金刚烷胺、金刚乙胺、阿莫西林、乙氧基喹啉是目前常用到的兽药，普遍应用于各种禽类、水产，在动物的感染性疾病预防中具有重要的地位。但是不合理的使用容易造成耐药菌的增加，同时残留药物可能对人体健康造成潜在的危害，所以必须按时停药以保证动物性产品质量安全，同时按照兽药国家标准和专业标准的规定，对动物组织中这些兽药进行检测分析。但是由于各种兽药的物理化学性质不同，差异较大，加上检测样品中其他成分的干扰，对动物组织中多种兽药残留同时快速分析检测构成很大的困难。

这些药物日常使用率极高,并且在日常检测中检出阳性比例非常高。但是很多药物目前没有国标方法，例如氨苯砜、苯乙醇胺、金刚烷胺、金刚乙胺等。目前现有的国家标准方法中，也需要采用多个不同的方法对这些化合物进行检测，操作步骤复杂，需要使用固相萃取柱等，检测成本高，因此需要开发一种通用的检测方法用于日常样品的检测。

三、发明内容

本发明针对现有技术、方法存在的不足，提供一种动物组织中兽药残留多组分同时快速分析检测的新方法，此种方法采用UPLC-MS/MS进行多反应监测(MRM)测定，既能保证分析效果，又能简化前处理操作流程，便于日常检测。

本发明采用的技术方案是：

一种同时分析检测动物组织中残留兽药组分的方法，所述方法为：动物组织样品经过50%乙腈+乙醇匀浆、超声提取，正己烷净化，乙腈+乙醇进一步沉淀，浓缩后用UPLC-MS/MS在负离子模式下，进行多反应监测(MRM)测定，根据标准曲线和外标法定量，检测计算得到动物组织中46种残留兽药组分的含量。具体包括以下步骤：

（1）制备样品溶液：每5g捣碎后的动物组织样品按照以下方法处理得到样品溶液：

称取5g捣碎后的动物组织样品于离心管中，加入6mL2.0mmol/L乙酸铵水溶液，9mL体积比4：1的乙腈+乙醇混合液，高速充分匀浆，混匀后超声提取5min，离心，取上清液A，剩余残渣加入15mL体积比4：1的乙腈+乙醇混合液，超声提取5min，离心、取上清液B与上清液A合并，得提取液，加入15mL正己烷，混匀后离心，得下层清液体，取其中7.5mL，经0.22μm滤膜过滤到带刻度的离心管中，40℃水浴下氮气吹至1～1.2mL，加入200μL DMSO后，用2.0mmol/L乙酸铵水溶液定容至1.5mL刻度线，得样品溶液；

（2）将步骤（1）所得的样品溶液经超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测，得样品溶液的超高效液相色谱图，色谱条件为：以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径≤5μm；梯度洗脱：流动相A为含体积分数0.1%的甲酸的甲醇溶液，流动相B为含体积分数0.1%的甲酸的水溶液；色谱柱温度为40℃；进样量10μL，流速为0.3μL/min；质谱条件为：ESI正负离子同时扫描模式，毛细管电压分别为3.5kV和3.0kV，源温145℃，去溶剂气温度：450℃；去溶剂气氮气流速：900L/h；锥孔气氮气流速：50L/h；碰撞气体：氩气3.3×10^-3mba；多反应监测（MRM）模式检测；

（3）绘制标准曲线：取吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、奥比沙星、双氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西诺沙星、恶喹酸、萘啶酸、氟甲喹、磺胺、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺二甲异嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧苄胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯哒嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹恶啉、氨苯砜、苯乙醇胺A、金刚烷胺、金刚乙胺、阿莫西林、乙氧基喹啉的标准品，配制成不同浓度的混合的标准工作液，按照步骤（2）相同条件进行测试，得标准工作液的超高效液相色谱图，分别对各个标准品，按照其浓度和峰面积，绘制标准曲线，分别得到上述46种标准品的标准曲线；

（4）根据步骤（2）中样品溶液的超高效液相色谱图中各待测成分的峰面积及其对应的标准品的标准曲线，计算出样品溶液中各待测成分的浓度，以公式（1）计算得到动物组织样品中各待测成分的含量：

X=（1.5×C/7.5×30）/M=6×C×M×100%......（1）

X——动物组织样品中待测成分的含量，单位μg/kg

C——根据标准曲线得到样品溶液中待测成分的浓度，单位ng/mL

M——动物组织样品的质量，单位g。

所述步骤（2）中，所述梯度洗脱的程序优选如下表1所示：

表1

所述步骤（1）中，所述高速充分匀浆通常是以20000r/min的转速高速匀浆1～2min。

所述步骤（1）中，所述的离心通常是以4500r/min的转速离心5min。

本发明具有以下有益效果：

1、喹诺酮类药物和磺胺类药物测定低限为1.0～5μg/kg，标准添加曲线线性良好(回归系数R>0.99)，平均回收率范围在87.6%～131.2%，RSD范围在4.0%～16.2%。苯乙醇胺A的测定低限为0.1μg/kg，氨苯砜、金刚乙胺、金刚烷胺的测定低限为1.0μg/kg，阿莫西林和乙氧基喹啉检测限分别为4和10μg/kg。标准添加曲线线性良好(回归系数R>0.99)。氨苯砜的平均回收率在83.1%～113.7%，变异系数在10.1%～13.0%；金刚乙胺的平均回收率在76.2%～104.8%，变异系数在22.5%～39.7%；苯乙醇胺A的平均回收率在87.9%～111.0%，变异系数在10.0%～30.3%；阿莫西林的平均回收率在80.3%～112.2%，变异系数在13.0%～25.2%；金刚烷胺的平均回收率在90.8%～107.7%，变异系数在17.9%～28.0%；乙氧基喹林的平均回收率在91.4%～105.6%，变异系数在3.6%～17.8%。

2、样品前处理分析简单易行，不需要固相萃取等净化方式，在大大提高检测效率的同时降低了昂贵的成本消耗。

3、本方法可用于18种喹诺酮类药物、22种磺胺类药物以及氨苯砜、苯乙醇胺A、阿莫西林、金刚烷胺、金刚乙胺、乙氧基喹啉等目前常用到的兽药，可一次性同时快速准确检测，扩大了本方法的应用范围。

四、附图说明：

图1为本发明动物组织中残留多组分兽药同时快速分析检测方法流程图。

五、具体实施方式

本实施例是对动物组织中18种喹诺酮类药物、22种磺胺类药物、氨苯砜、苯乙醇胺A、阿莫西林、金刚烷胺、金刚乙胺、乙氧基喹啉残留量同时进行分析。

1、材料

1.1使用的仪器：超高效液相色谱-串联质谱联用仪。（美国WATERS公司）；冷冻离心机(美国SIGMA公司)。超纯水器MILLI-Q（美国MILLI PORECO公司）。旋涡混合仪Votexgenie-2型（德国）。超声波清洗仪250LH型（KUDOS公司。）

1.2使用的试剂：甲醇、乙酸、乙腈、乙醇（均为HPLC级）。2.0mmol/L乙酸铵水溶液：在1000mL水中，加入0.154g乙酸铵，超声混合。乙腈+乙醇：4：1，V/V。

1.3使用的标准品：纯度≥95％，购自Dr.Ehrenstorfer,Sigma。

2、动物组织中残留多组分兽药同时快速分析检测方法（流程图如图1所示）

2.1通用型快速前处理（提取与净化）

称取捣碎后的鱼肉样品5g(精确到0.01g)于50mL离心管中，加入6mL水，9mL乙腈+乙醇（体积比4：1），以20000r/min高速充分匀浆约1min，混匀后超声提取5min，再以4500r/min的转速离心5min，上清液转移至另一50mL试管。在残渣中加入15mL乙腈+乙醇（体积比4：1），重复提取一次，合并上清液，得提取液，加入15mL正己烷，混匀后离心5min，得下层清液体，取其中7.5mL，经0.22μm滤膜过滤器到15mL刻度离心管中，40℃水浴下氮气吹至1.2mL左右，加入200μL DMSO后，用2.0mmol/L乙酸铵水溶液定容至1.5mL刻度线，收集于2mL自动进样器样品瓶中，供LC-MS/MS测定。

2.2、配制标准工作液

A、喹诺酮与磺胺类标准储备液：1.0mg/mL:分别称取10.0mg奥比沙星、恶喹酸、氟甲喹，用二甲亚砜溶解后，用甲醇定容至10mL，称取10.0mg诺氟沙星用50%乙腈定容至10mL，其他成分均称取10.0mg，用甲醇定容至10mL，该溶液在-18℃保存可使用12个月。

B、氨苯砜、苯乙醇胺A、阿莫西林、金刚烷胺、金刚乙胺、乙氧基喹啉标准储备液1.0mg/mL：称取10.0mg，用乙醇定容至10mL。

标准工作液：分别吸取50μL各成分的标准储备溶液放入100mL容量瓶中，分别用甲醇定容至刻度，浓度为500ng/mL。

标准工作液1：分别吸取苯乙醇胺A标准储备溶液25μL、阿莫西林1000μL、其余各250μL标准储备溶液放入25mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，苯乙醇胺A和阿莫西林浓度为1.0、40μg/mL，其余成分的浓度均为10.0μg/mL。

标准工作液2：吸取100μL标准工作液1放入10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，苯乙醇胺A和阿莫西林浓度为10和400ng/mL，其余成分的浓度均100ng/mL。

标准工作液3：吸取200μL标准工作液1放入10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，苯乙醇胺A和阿莫西林浓度为20和800ng/mL，其余成分的浓度均200ng/mL。

标准工作液4：吸取2000μL标准工作液1放入10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，苯乙醇胺A和阿莫西林浓度为200和8000ng/mL，其余成分的浓度均2000ng/mL。

2.3超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定（UPLC-MS/MS）：

ａ）色谱柱：T3C₁₈(2.1mm×100mm，1.8μm)。

ｂ）流动相A：甲醇(含0.1%甲酸)，在1000mL甲醇中，加入1mL甲酸，超声混合。

流动相B：水(含0.1%甲酸)，在1000mL水中，加入1mL甲酸，超声混合。

ｃ）色谱柱温度：40℃。

ｄ）进样量：满环进样（10μL）。

ｅ）去溶剂气温度：450℃。

ｆ）去溶剂氮气流速：900L/h。

ｇ）锥孔气氮气流速：50L/h。

ｈ）碰撞气体：氩气3.3×10-3mba。

i）ESI正负离子同时扫描模式，毛细管电压分别为3.5kV和3.0kV，源温145℃。

梯度洗脱的程序如下表所示：

2.4浓度计算方法和检测限

分别对各个标准品，按照标准工作液中的浓度和测得的峰面积，绘制标准曲线，分别得到上述46种标准品的标准曲线；

根据样品溶液测得的超高效液相色谱图中各待测成分的峰面积及其对应的标准品的标准曲线，计算出样品溶液中各待测成分的浓度，

样品中待测物的含量根据计算公式（1）计算得到，结果保留到小数点后1位。

X=（1.5×C/7.5×30）/M=6×C×M×100%...（1）

X——动物组织样品中待测成分的含量，单位μg/kg

M——动物组织样品的质量，单位g

3.分组方案

46种药物的UPLC-MS/MS保留时间、特征离子、锥孔电压如下表2所示。

表2：

所有上述化合物回收率范围在75%～135%，精密度范围在3%～40%。其中95%的化合物回收率范围在85%～135%，精密度范围在3%～16%。上述化合物均满足分析要求。

喹诺酮类药物和磺胺类药物测定低限为1.0～5μg/kg，标准添加曲线线性良好(回归系数R>0.99)，平均回收率范围在87.6%～131.2%，RSD范围在4.0%～16.2%。苯乙醇胺A的测定低限为0.1μg/kg，氨苯砜、金刚乙胺、金刚烷胺的测定低限为1.0μg/kg，阿莫西林和乙氧基喹啉检测限分别为4和10μg/kg。标准添加曲线线性良好(回归系数R>0.99)。氨苯砜的平均回收率在83.1%～113.7%，变异系数在10.1%～13.0%；金刚乙胺的平均回收率在76.2%～104.8%，变异系数在22.5%～39.7%；苯乙醇胺A的平均回收率在87.9%～111.0%，变异系数在10.0%～30.3%；阿莫西林的平均回收率在80.3%～112.2%，变异系数在13.0%～25.2%；金刚烷胺的平均回收率在90.8%～107.7%，变异系数在17.9%～28.0%；乙氧基喹林的平均回收率在91.4%～105.6%，变异系数在3.6%～17.8%。

4、检测结果：

根据步骤2.4计算得到鱼肉样品中待测成分的含量，如下表3所示，喹诺酮类药物和磺胺类药物残留较高,其它物质较少。

Claims

1.一种同时分析检测动物组织中残留兽药组分的方法，其特征在于所述方法为：动物组织样品经过50%乙腈+乙醇匀浆、超声提取，正己烷净化，乙腈+乙醇进一步沉淀，浓缩后用UPLC-MS/MS在负离子模式下，进行多反应监测测定，根据标准曲线和外标法定量，检测计算得到动物组织中46种残留兽药组分的含量；所述残留兽药组分为吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、单诺沙星、洛美沙星、奥比沙星、双氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西诺沙星、恶喹酸、萘啶酸、氟甲喹、磺胺、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺二甲异嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧苄胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯哒嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹恶啉、氨苯砜、苯乙醇胺A、金刚烷胺、金刚乙胺、阿莫西林或乙氧基喹啉。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（2）将步骤（1）所得的样品溶液经超高效液相色谱-串联质谱联用仪检测，得样品溶液的超高效液相色谱图，色谱条件为：以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径≤5μm；梯度洗脱：流动相A为含体积分数0.1%的甲酸的甲醇溶液，流动相B为含体积分数0.1%的甲酸的水溶液；色谱柱温度为40℃；进样量10μL，流速为0.3μL/min；质谱条件为：ESI正负离子同时扫描模式，毛细管电压分别为3.5kV和3.0kV，源温145℃，去溶剂气温度：450℃；去溶剂气氮气流速：900L/h；锥孔气氮气流速：50L/h；碰撞气体：氩气3.3×10^-3mba；多反应监测模式检测；

X=（1.5×C/7.5×30）/M=6×C×M×100%......（1）

X——动物组织样品中待测成分的含量，单位μg/kg

M——动物组织样品的质量，单位g。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，所述梯度洗脱的程序如下表所示：

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述高速充分匀浆通常是以20000r/min的转速高速匀浆1～2min。