CN102565228B

CN102565228B - 一种检测磺胺类药物残留的方法

Info

Publication number: CN102565228B
Application number: CN 201110458304
Authority: CN
Inventors: 严坤平; 朱宏莉; 陈超
Original assignee: SHAANXI BEIMEI GENE CO Ltd
Current assignee: Xi'an blood oxygen Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2011-12-31
Filing date: 2011-12-31
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2031-12-31
Also published as: CN102565228A

Abstract

本发明提供了一种检测磺胺类药物残留的方法。该方法中采用的洗脱液由以下三种溶液组成：A:0.05-0.3%（体积百分比）的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.005-0.03 mol/L盐溶液。以体积百分比计，洗脱液中三种溶液的起始配比为：A：55%—66%；B：4%—15%；C：25—35%；使用液相色谱仪，在分离分析物的过程中，调整洗脱液的配比，即逐渐增大乙腈在洗脱液中的比例，最终配比的乙腈占洗脱液总体积不超过50%。本发明的检测方法减少了样品的净化程序；可快速分离检测多种磺胺类药物残留；同样条件下，还可分离多种氟喹诺酮类药物。

Description

一种检测磺胺类药物残留的方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种反相高效液相色谱法分离样品中残留抗生素的方法。

背景技术

磺胺类药物和氟喹诺酮类药物是一类抗生素化合物，他们被广泛应用于治疗家畜、家禽或者鱼类等的疾病，过多或者无控制的使用会导致肉类食品中有过多的抗生素残留，同时也会给环境带来抗生素残留，从而造成食品安全问题或者环境问题，经常性食用这些有大量抗生素残留的食品，会导致过敏反应、抗生素耐受甚至癌症。因此日常需要灵敏而快速的检测方法。

目前已经有很多方法被发展起来，比如高效液相色谱串联质谱、气相色谱串联质谱、毛细管电泳，尺寸排阻发、分子印迹聚合物法，但是这些方法通常需要将样品净化后才能进行分析，净化样品的方法包括：液-液萃取、固相萃取、固相微萃取等。

也有不用样品净化而直接进行分离检测的方法（M. Gratacós-Cubarsí et al, Anal. Bioanal. Chem., 2006, 385: 1218-1224），该方法直接将组织在乙腈中匀浆，取上清液浓缩后定容，然后直接进行色谱分析。但是该方法分离的磺胺类药物种类均比较少，不能用于多种抗生素的检测。

发明内容

本发明提供了一种检测磺胺类药物残留的方法，以解决现有技术在一次色谱分析中分离磺胺类药物种类较少或检测步骤繁琐等技术问题。

为解决以上技术问题，本发明提出的技术方案如下：

一种检测磺胺类药物残留的方法，包括以下步骤：

（1）对样品组织处理得到含有分析物的浓缩液，定容得到待检测液；

确定洗脱液组分：洗脱液来自三种溶液的混合，所述三种溶液分别是A：0.05-0.3%的有机酸溶液、B：乙腈、C：0.005-0.03 mol/L的盐溶液；所述有机酸采用甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、草酸中的任意一种或多种；所述盐溶液采用乙酸铵、乙酸钠、草酸铵、草酸钠、氯化铵、亚硫酸铵溶液中的任意一种或多种；

（2）配制洗脱液，将洗脱液混入待检测液一起通过反相色谱柱，实现分析物的分离；

以体积百分比计，洗脱液中三种溶液的起始配比为：A：55%—66%；B：4%—15%；C：25—35%；

使用液相色谱仪，在分离分析物的过程中，调整洗脱液的配比，即逐渐增大乙腈在洗脱液中的比例，最终配比的乙腈占洗脱液总体积不超过50%；

（3）对分离出的残留磺胺类抗生素对应的峰面积进行积分，依据对标准品制作的标准曲线进行定量计算，得出残留的含量；

所述对标准品制作的标准曲线也是依照以上步骤（1）至步骤（3），采用相同的试剂以及参数，在相同实验条件下得出的。

上述步骤（2）中，最好使洗脱液混入待检测液一起通过反相色谱柱的流速维持在0.6-1.2ml/min。

上述（步骤（2）中）逐渐增大乙腈比例的过程中，乙腈的变化速率不超过1.5%/min。

上述步骤（1）中所述的三种溶液分别选择A:0.07-0.2%的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.007-0.02 mol/L的盐溶液，效果较佳。

上述步骤（1）中所述的三种溶液分别选择A:0.09-0.13%的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.009-0.013 mol/L的盐溶液，效果更佳。

本发明还可以采用另一种方案，操作方法同上，只是洗脱液在配比终浓度与上述方案一致的情况下，采用其它形式的配制方式（比如将乙腈与盐溶液混合作为一种溶液）。

本发明具有以下优点：

1、减少了样品的净化程序。大多数样品都需要进行类似固相萃取或者固相微萃取的过程，从而净化样品，去除部分干扰杂质，使得在液相色谱分离时不干扰分析物，而本发明无需净化程序，也能够进行分离检测。

2、可分离多种磺胺类药物残留。现有技术方法仅分离少量的磺胺类药物，本发明可分离十几种以上的磺胺类药物。

3、可分离多种氟喹诺酮类药物残留。同样条件下（只需要在步骤（1）样品组织处理的操作中，采用公知的相应试剂排除磺胺类抗生素，得到对应氟喹诺酮类药物的待测分析物即可），还可分离多种氟喹诺酮类药物。

4、分析物无主要干扰物干扰，仅有少量面积较小干扰物干扰，基本不影响分析物定性和定量。

5、分析速度快。一次色谱分离过程约/40min完成，可以满足日常快速定量检测的需求。

附图说明

附图1是采用实施例1的方案对磺胺类药物标准品的分离图。

其中，分离的标准品分别为：1：磺磺胺醋酰；2：磺胺嘧啶；3：磺胺噻唑；4：磺胺吡啶；5：磺胺甲基嘧啶；6：磺胺二甲嘧啶；7：磺胺甲氧哒嗪；8：磺胺对甲氧嘧啶；9：磺胺甲氧嘧啶；10：磺胺氯哒嗪；11：磺胺邻二甲氧嘧啶；12：磺胺甲基异恶唑；13：磺胺二甲异恶唑；14：磺胺间二甲氧嘧啶；15：磺胺苯吡唑。

附图2是猪肉中添加抗生素后采用实施例1的方案提取样品的分离图。数字标识同图1。

附图3是猪肉中未添加抗生素采用实施例1的方案提取样品的分离图。通过与图2对比，标准品能够和含量较高的杂质分离，未能分离的少量杂质对定量和定性基本不产生影响，而且各磺胺类药物分离度良好。

附图4是牛肉中添加抗生素后采用实施例1的方案提取样品的分离图数字标识同图1。

附图5是牛肉中未添加抗生素采用实施例1的方案提取样品的分离图。通过与图4对比，标准品能够和含量较高的杂质分离，未能分离的少量杂质对定量和定性基本不产生影响，而且各磺胺类药物分离度良好。

附图6是牛奶中添加抗生素后采用实施例1的方案提取样品的分离图。数字标识同图1.

附图7是牛奶中未添加抗生素采用实施例1的方案提取样品的分离图。标准品能够和含量较高的杂质分离，未能分离的少量杂质对定量和定性基本不产生影响，而且各磺胺类药物分离度良好。

具体实施方式

本发明所提出的高效液相色谱法中分离磺胺类药物的流动相，由以下三种溶液组成：A:0.05-0.3%（体积百分比）的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.005-0.03 mol/L盐溶液。这三种溶液较佳的浓度范围是：A:0.07-0.2%（体积百分比）的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.007-0.02 mol/L盐溶液；更佳的浓度范围是：A:0.09-0.13%（体积百分比）的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.009-0.013 mol/L盐溶液。洗脱液（即所述流动相）在配比终浓度一致的情况下，也可以是其它形式的配比组合。所述有机酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、草酸等的任一种。所述盐溶液包括乙酸铵、乙酸钠、草酸铵、草酸钠、氯化铵、亚硫酸铵溶液的任一种。构成洗脱液的这三种溶液的起始比例（体积百分比）限定为：A：55%—66%；B：4%—15%；C：25—35%；洗脱方式的特点是随着时间的延长增大乙腈的比例，相应地，水所占比例逐渐降低（通过减少其他两种溶液的比例），在分离分析物的过程中（最后一个分析物被洗脱出来截止），乙腈的最终比例不超过50%。

申请人经过大量研究发现，在上述流动相条件下磺胺类药物的保留时间对于乙腈浓度变化较为敏感，减小乙腈的浓度，磺胺类药物的保留时间显著延长，而样品中基质干扰物（含量杂质）的保留时间则延长较少，因此可以将主要干扰物和分析物分离开来，从而无需分析样品的净化过程；并且在分离分析物的过程中，逐渐增大乙腈在洗脱液中的比例，控制最终配比的乙腈占洗脱液总体积不超过50%，能够实现快速地将多种磺胺类抗生素分离开进行定量检测。

以下选取几种有代表性的样品对象举例说明本发明的技术方案。

具体实施例1：猪肉中磺胺类抗生素残留的分离检测

取5g猪肉组织，加入20mL乙腈后进行匀浆，匀浆后离心力10,000×g离心5min，回收上清，在旋转蒸发仪上蒸干，用0.5mL乙腈进行溶解，重复洗涤，然后用氮气将样品吹干，最终用1mL乙腈溶解样品（也可采用其他公知的有机溶剂定容），0.45μm滤膜过滤后进行色谱分析定量。

色谱分离条件：高效液相色谱仪；反相色谱柱（4.6 mm I.D.×250mm）；流速：0.8mL/min；温度：室温；洗脱液：A: 0.1% 甲酸溶液；B：乙腈; C: 0.01mol/L乙酸铵溶液；检测波长为270nm（采用了磺胺类药物的最大吸收波长来测定，以提高灵敏度）；分离时的梯度比例如下表所示：

表1 分离磺胺类药物时的色谱梯度比例

完成分离后，对分离出的残留磺胺类抗生素面积进行积分，依据标准品制作的标准曲线进行定量计算，得出残留的含量。这里所说的标准品制作的标准曲线，也应当采用与以上样品测试过程相同的色谱分离条件（尤其是起始比例和乙腈变化梯度）。

具体实施例2：牛奶中磺胺类抗生素残留的分离检测

取0.45 mL牛奶，加入0.5 mL三氯乙酸(1g/mL) 将其中蛋白质沉淀，然后离心力10,000×g离心5min，回收上清，用乙腈重新定容至5mL（也可采用其他公知的有机溶剂定容），0.45μm滤膜过滤后进行色谱分析定量。

色谱分离条件：高效液相色谱仪；反相色谱柱（4.6 mm I.D.×250mm）；流速：0.8mL/min；温度：室温；洗脱液：A: 0.06% 乙酸溶液；B：乙腈; C: 0.015mol/L乙酸钠溶液；检测波长为270nm，分离时的梯度比例如下表所示：

表2 分离磺胺类药物时的色谱梯度比例

以上两个实施例依照本发明的方案选择了几种有代表性的试剂和适当的具体参数，分离出了十几种磺胺类药物残留；仅有少量面积较小干扰物干扰，基本不影响分析物定性和定量。一次色谱分离过程约40min完成，可以满足日常快速定量检测的需求。

关于洗脱液的配制，参照实施例1和实施例2的操作，申请人还在浓度范围0.05-0.3%（体积百分比）内选择了甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、草酸中的任意一种或多种；在浓度范围0.005-0.03 mol/L内选择了乙酸铵、乙酸钠、草酸铵、草酸钠、氯化铵、亚硫酸铵溶液中的任意一种或多种；最终实验结论基本满足预期，不在此赘述。较佳的浓度参数范围为A：0.07-0.2%（体积百分比）的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.007-0.02 mol/L盐溶液。更佳的浓度参数范围为A：0.09-0.13%（体积百分比）的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.009-0.013mol/L盐溶液。

实际上，洗脱液在配比终浓度一致的情况下，采用其它形式的配制方式比如将乙腈与盐溶液混合作为一种溶液，同样能够实现本发明目的。

本领域技术人员应当能够选取本发明确定的技术方案中的其他试剂和具体参数进行应用操作，并达到本发明预期的技术效果；不必局限于上述具体实施例。

Claims

1.一种检测磺胺类药物残留的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，洗脱液混入待检测液一起通过反相色谱柱的流速维持在0.6-1.2ml/min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：逐渐增大乙腈比例的过程中，乙腈的变化速率不超过1.5%/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的三种溶液分别是A:0.07-0.2%的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.007-0.02mol/L的盐溶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的三种溶液分别是A:0.09-0.13%的有机酸溶液；B：乙腈； C: 0.009-0.013mol/L的盐溶液。