CN103940932A

CN103940932A - 一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法

Info

Publication number: CN103940932A
Application number: CN201310016583.2A
Authority: CN
Inventors: 李剑勇; 杨亚军; 刘希望; 张继瑜; 李冰; 周绪正; 刘玉荣; 魏小娟; 牛建荣
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2014-07-23

Abstract

本发明公开了一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法。该方法以流感病毒的特效药物奥司他韦（OS）为模板分子，以丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶为功能单体，合成非共价的奥司他韦分子印迹聚合物（OS-MIP），以此为固定相湿法装填液相色谱柱，对中草药及复方的有效成分群进行亲和筛选，通过质谱鉴定有亲和性的化合物成分，再通过体外的抗病毒实验对化合物的活性进行验证，从中药中发现和模板分子具有相同抗流感病毒活性的化合物。本发明可被借鉴用于筛选鉴定其他活性的化合物，从而缩短药物实体的筛选过程，加快替代药物的研发过程，特别是在非生物学药物筛选方法中具有重要的实际意义和广阔的应用前景。

Description

一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法

技术领域

本发明涉及活性化合物的筛选鉴定方法，特别是涉及一种从中药中分离筛选鉴定与预定模板分子活性相似化合物的非生物学方法。

背景技术

基于化学合成的新药研发越来越困难，经费投入呈几何级数增加，研发周期也越来越长。因此，越来越多的新技术用于药物的筛选与开发，如组合化学方法：快速生产建立包含成千上万化合物的库；高通量药物筛选技术：采用各种快速高效的筛选检测方法去发现药物前体；基因组学、蛋白组学、代谢组学、ADMETox：将药效学、代谢机理和毒性的研究提前到药物发现这第一环节来进行；虚拟筛选和高内涵筛选技术：基于化学信息学和化学生物学进行药物前体筛选；分子印迹技术：用于中药成分及有关化合物的分离纯化。

分子印迹技术（molecularly imprinting technology，MIT）也称为分子烙印技术，是源于人们对抗体-抗原或酶专一性的认识，合成对模板分子具有特定识别能力的聚合物的技术，是近二十年来出现且发展迅猛的一种高选择性分离技术。由于MIT模仿了生物界的锁匙作用原理，使制备的具有记忆功能的分子印迹聚合物（molecular imprinting polymers，MIPs）拥有极高的选择性，及很好的物理和化学稳定性，能够抵抗很强的机械作用力，在高温、高压、酸、碱、高浓度离子及有机溶剂等各种恶劣条件下也能保持其原有的特性。在许多相关领域，如手性拆分、固相萃取、膜分离、模拟抗体的免疫分析、人造酶体系、化学或生物传感器、催化剂、组合化学筛分、药物筛选等，得到了越来越广泛的应用。

中药作为我国悠久的传统疾病防控药物，许多中药及其复方对病毒性疾病有着良好的预防与治疗作用。但中药及其复方中包含的化合物结构类型多样，是天然的组合化学库，而且各成分含量悬殊，许多成分未知，导致从中分离纯化有效成分费时费力，而且容易丢失微量的有效成分。

基于分子识别原理，利用MIPs制成亲和色谱柱，利用色谱分离技术的高速高效性和质谱测定技术的高灵敏度和独有的混合解析能力，在线连接HPLC-MS，理论上可以直接从中药复杂体系中分离、筛选出有效成分并进行直接鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法。该方法是一种基于分子印迹、液相色谱和质谱联用技术分离筛选鉴定与模板分子活性类似的化合物的非生物学方法，可以从中草药及其复方制剂的有效成分群中，筛选鉴定得到与模板分子活性相似的化合物。

本发明可以用于从其他成分复杂的体系中，筛选鉴定与已知药物活性类似的化合物。

一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法，其步骤包括：

a. 奥司他韦分子印迹聚合物及其液相色谱柱的制备

以奥司他韦（模板分子）0.1 mmol、功能单体0.69 mmol、乙二醇二甲基丙烯酸酯（交联剂）5 mmol、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基吡啶作为功能单体、甲苯作为致孔剂、15 mg偶氮二异丁腈作为引发剂，60 ℃油浴热引发聚合反应，所得质地坚硬的白色块状聚合物，对其进行研磨筛分，收集粒径在25～45 μm之间的颗粒，在索氏提取器中，采用甲醇：乙酸体积比为90 : 10对其进行洗脱，以除去模板分子奥司他韦；50℃减压干燥，在2000 psi的压力下，湿法装填150 mm×4.6 mm的液相色谱柱，将该色谱柱接入色谱仪，以合适的流动相对其进行洗脱、平衡，直至出现较为平稳的基线。

b. 奥司他韦分子印迹液相色谱柱（OSMIP-LC）对OS和其他化合物的亲和分离

色谱条件：Agilent 1200 LC，OS-MIP自制液相色谱柱(150 mm × 4.6 mm, 25-45 μm)，柱温30℃；流动相为甲醇-乙腈-甲酸（体积比为75 : 25 : 0.01），流速为0.075 ml/min，数据采集软件为MassHunter，压力约170 bar。

质谱条件：Agilent 6410A QQQ电喷雾(ESI)串联四级杆质谱仪，喷雾器压力30 psi，毛细管电压+4000 V，N₂流速10 L/min，温度350 ℃，采集周期为200 ms，模式Scan。

c. 基于奥司他韦分子印迹聚合物与液相色谱、质谱联用，分离筛选鉴定与模板分子活性相似的抗病毒中药有效成分。

上述筛选鉴定所得的抗病毒中药与模板分子的母体结构相同，或完全不同

实验表明，制备的奥司他韦非共价分子印迹聚合物，理化性质稳定，重现性好，可以从中草药及其复方制剂的有效成分群中，利用质谱和色谱技术对化合物的成分进行鉴定，发现筛选到亲和性与模板分子相似的化合物苦参碱，以及亲和性更强的化合物为槐定碱。体外抗H9N2亚型禽流感病毒的活性实验结果表明，亲和性与模板分子相似的化合物苦参碱，其具有与模板分子奥司他韦相似的抗H9N2亚型禽流感病毒的活性；而亲和性较模板分子更强的化合物槐定碱及其他化合物，在体外则没有抗H9N2亚型禽流感病毒的活性。

本发明的优点和产生的有益效果是：

我国中草药资源丰富，是天然的化合物库。可以以此活性类似化合物的筛选鉴定方法为依托，合成某些活性化合物的分子印迹聚合物，结合液相色谱和质谱联用技术，从中草药及其复方、甚至微生物的发酵液的化学成分群中，筛选鉴定得到与模板分子活性类似的化合物。特别是对于医学临床中没有备选药物，或者毒副作用较大的药物，以及采用常规生物学筛选方法而危险较大的化合物，可以采用此技术；对于发现新的活性类似的药物实体，可以加快药物筛选的过程。综上所述，本发明所涉及的技术将在药物研发领域，具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1 OSMIP-LC对混合物的分离效果；其中a为总离子流图，b为37.7 min时的提取质谱图，c为147.8 min时的提取质谱图。

图2 连翘苷石油醚提取部分的亲和筛选图谱；其中a为总离子流图，b为31.2 min时的提取质谱图。

图3 鸭跖草乙酸乙酯提取部分的亲和筛选图谱；其中a为总离子流图，b为34.2 min时的提取质谱图。

图4 炎毒热清氯仿提取部分的亲和筛选图谱；其中a为总离子流图，b为134.5 min时的提取质谱图，c为41.3 min时的提取质谱图。

图5 不同化合物标准品在OSMIP-LC柱上的色谱特性；其中a为苦参碱，b为氧化苦参碱，c为槐定碱，d为氧化槐定碱。

图6 化合物活性预期保留时间差异的趋势图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用方法未特殊说明处，均为常规方法。

1. 奥司他韦分子印迹聚合物及其液相色谱柱的制备

采用均匀设计法优化聚合物制备过程中的参数，奥司他韦（模板分子）0.1 mmol、功能单体0.69 mmol、乙二醇二甲基丙烯酸酯（交联剂）5 mmol、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基吡啶作为功能单体、甲苯作为致孔剂、15 mg偶氮二异丁腈作为引发剂，60 ℃油浴热引发聚合反应，所得质地坚硬的白色块状聚合物，对其进行研磨筛分，收集粒径在25～45 μm之间的颗粒，在索氏提取器中，采用甲醇-乙酸（90 : 10，V/V）对其进行洗脱，以除去模板分子奥司他韦；50℃减压干燥，在2000 psi的压力下，湿法装填150 mm×4.6 mm的液相色谱柱，将该色谱柱接入色谱仪，以合适的流动相对其进行洗脱、平衡，直至出现较为平稳的基线。

2. 奥司他韦分子印迹液相色谱柱（OSMIP-LC）对OS和其他化合物的亲和分离

色谱条件：Agilent 1200 LC，OS-MIP自制液相色谱柱（150 mm × 4.6 mm, 25-45 μm），柱温30℃；流动相为甲醇-乙腈-甲酸（体积比为75 : 25 : 0.01），流速为0.075 ml/min，数据采集软件为MassHunter，压力约170 bar。

混合物样品中含有阿司匹林、连翘苷、绿原酸，以及模板分子OS，在上述的色谱和质谱条件下，自制的OSMIP-LC柱，可以实现其他成分与模板分子的有效分离（见图1）。而对于模板分子之外的成分，则不能实现其相互之间的有效分离。从图1的总离子流图（TIC）和质谱图中可以看出，阿司匹林、连翘苷和绿原酸在OSMIP-LC柱上的保留时间是一致的，均为37 min左右；而模板分子OS保留时间为150 min左右。以上实验结果说明，自制的OS-MIP液相色谱柱，对模板分子有良好的选择性与亲和性，而对模板分子以外的其他化合物没有选择性，可以用于混合物中模板分子及其结构类似物的分离筛选。

3. OSMIP-LC对中草药及其复方制剂化学成分群的亲和筛选

（1）OSMIP-LC对单味中草药分部位提取物的亲和筛选

图2和图3分别显示了OSMIIP-LC对单味中草药分部位提取物的亲和筛选结果。

从图2和图3中的总离子流图上可以看出，连翘苷、鸭跖草的分部位提取物的保留时间均在30～40 min之间；质谱图中显示，成分较为复杂。以上结果说明，上述分部位提取物中的成分，与自制的OS-MIP之间没有亲和性；自制的OSMIP-LC柱对这些成分亦不能实现有效地分离。

（2）对中药复方制剂分部位提取物的亲和筛选

选取临床上对畜禽病毒性疾病疗效确切的中药复方制剂炎毒热清等，采用不同极性的溶剂进行分部位提取化学成分群，旋转蒸发除去溶剂，以甲醇溶解残渣，采用0.22 μm有机系滤膜过滤，滤液密封低温保存，备用。

对复方制剂的分部位提取物，采用OSMIP-LC-MS联用技术，对其进行亲和筛选、分离。在中药复方炎毒热清的氯仿提取物中，得到了如下的图谱（图4）。

在TIC图上，出现了两个明显的色谱峰，其中没有亲和性的成分，保留时间在30～40 min之间，化合物成分较为复杂，其中含有连翘苷[M + Na]⁺557.20。有亲和性的成分，保留时间在130～150 min之间，而模板分子OS的保留时间为150 min，说明自制的分子印迹聚合物对该成分有亲和性。质谱图上该化合物的分子量为248.30，图上显示的离子分别为[M + H]⁺249.30、[M + Na]⁺271.20、[2M + Na]⁺519.40。

4. 被筛选出化合物的成分鉴定

根据中药及复方制剂中组方的中药成分，查询相关文献，认为分子量为248.20的化合物为苦参碱或槐定碱。对鉴定出的化合物进行OSMIP-LC-MS验证。

称取苦参碱和槐定碱，以及他们的氧化物氧化苦参碱和氧化槐定碱标准品适量，色谱甲醇溶解，0.22 μm微孔滤膜滤过，在前述的色谱、质谱条件下进样。结果如下。

图5分别显示了苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和氧化槐定碱4种化合物，在自制OSMIP-LC柱上的色谱特性。上述的4幅TIC图中，各化合物在自制色谱柱上的保留时间为超过150 min，均较模板分子OS的保留时150 min长。说明自制的色谱柱对此4种化合物有一定的亲和性。在自制OSMIP-LC柱上，苦参碱的保留时间为170 min，氧化苦参碱为240 min，槐定碱为310 min，氧化槐定碱为210 min；而中草药复方制剂炎毒热清，有亲和性的成分，其保留时间约为140 min（见图4），结合分子量，因而判定该成分为苦参碱；然而由于复方制剂中其他成分的相互干扰，而引起目标成分（图4，140 min）与其标准品的保留时间之间有差异（图5a，170 min）。

分子印迹聚合物，是根据模板分子的结构定制的吸附材料，对模板分子及其结构类似物的亲和性较强。因而推测，在分子印迹色谱柱上，亲和性与模板分子相似的化合物，其在结构上与模板分子相似，应该具有和模板分子相似的活性。

OS是目前治疗流感的特效药物，以OS为模板分子合成分子印迹聚合物，并以此制备液相色谱柱，用以从中药及其复方制剂中亲和筛选分离与其结构相似的，具有抗病毒活性的化合物，结合质谱联用技术对筛选出的化合物进行成分鉴定。为了验证这一筛选、分离、鉴定一体化技术的适用性和有效性，对筛选出的化合物苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐定碱、连翘苷、绿原酸等进行体外抗禽流感病毒实验。

5. 对筛选鉴定出的化合物进行体外抗禽流感病毒的活性检测

选取苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐定碱、连翘苷、绿原酸，同时以阿司匹林、奥司他韦、双黄连注射液、炎毒热清注射液（中药复方）等作为对照药物。

实验所用的毒株为鸡H9N2亚型禽流感病毒，实验用的细胞为犬肾细胞（MDCK）。先行测定所选取药物对细胞的最大无毒浓度，然后在37 ℃条件下将一定浓度的H9N2病毒培养液与细胞吸附1 h后，弃去病毒液，加入含有不同浓度药物的细胞维持液（不含血清），37 ℃ 5% CO₂培养，分别在24、48、72 h观察细胞的病变情况并检测各个浓度下细胞培养上清液是否有血凝现象。结果见表1。

表1 各药物体外抗鸡H9N2禽流感病毒活性的实验结果

从实验结果中可以看出，苦参碱和奥司他韦在体外具有较强的抗鸡H9N2禽流感病毒的活性；槐定碱、连翘苷、双黄连复方仅在上述浓度范围内具有血凝抑制活性；而氧化苦参碱、氧化槐定碱、绿原酸和阿司匹林，以及炎毒热清注射液（中药复方）等，在体外没有活性。实验中，除了奥司他韦之外，苦参碱相比于其他对照药物，在上述的浓度范围内，能够同时降低H9N2亚型禽流感病毒的细胞病变作用，和抑制病毒的血凝现象。奥司他韦是流感病毒神经氨酸酶的特异性抑制剂，为目前医学临床中的一线抗流感病毒药物。

6. 化合物在自制分子印迹色谱柱上的保留时间与体外活性的相关性分析

在自制的OSMIP-HPLC柱上保留时间较长的化合物，其空间结构与模板分子相似，能够与OSMIP中的OS空穴中的相关部位，形成非共价键，从而表现出与自制的OSMIP有一定的亲和性，故而推测其具有和模板分子相似的生物活性。

实验中，从复方制剂中筛选、分离、鉴定出苦参碱和自制的色谱柱有一定的亲和性，而且其保留时间与模板分子的相似，体外的抗病毒实验也进一步证明，苦参碱在所选的药物中，具有较好的抗病毒活性；而氧化苦参碱，以及槐定碱、氧化槐定碱，虽然保留时间较模板分子OS和苦参碱有明显延长，但是仅有槐定碱具有一定的血凝抑制活性。然而在对照药物中，连翘苷、绿原酸以及阿司匹林等，在印迹色谱柱上的保留时间很短，而且相同，说明与色谱柱没有亲和性，绿原酸和阿司匹林没有相应的抗流感病毒活性，然而连翘苷却具有一定的血凝抑制活性。鉴于此，对实验结果进行进一步的统计分析。

化合物在自制OSMIP-HPLC柱上保留时间的长短，是化合物与色谱柱有无亲和性的反映，有亲和性的表示为“1”，没有亲和性的表示为“0”；化合物具有抑制细胞病变和/或血凝抑制活性，均认为具有抗流感病毒的活性，表示为“1”，没有抗病毒活性的表示为“0”。因而实验中的数据可进行如下的分类，见表2。双黄连在抗病毒实验中作为对照，具有一定的抗病毒活性；然而未对其进行亲和筛选。因而在统计分析中，复方制剂的结果，没有包括在内。

表2 实验数据分类结果

采用SAS 8.2 for Windows对化合物与自制色谱柱之间的亲和性，和体外抗病毒活性评分之间进行对应的χ²检验，结果表明P=0.462，R=0.500，表明差异不显著，说明化合物在色谱柱上亲和性与其在体外抗病毒作用不相关。

体外抗流感病毒实验结果显示，苦参碱和模板分子一样，相比于其他化合物具有良好的血凝抑制活性和抑制细胞病变程度的活性；同时，亲和分离的实验结果也表明，苦参碱在OS-MIP色谱柱上的保留时间与OS的保留时间的比较接近，即苦参碱与该色谱柱的亲和性与模板分子的接近。而其他化合物的活性与OS的差异很大，保留时间与模板分子的差别亦比较大。因此，采用半定量的数据，对化合物的活性重新分类，活性最强的OS和苦参碱定义为“3”，槐定碱和连翘苷仅有血凝抑制活性定义为“1”，没有任何活性的依然定义为“0”。结果见表3。

表3 化合物的保留时间与体外活性

化合物	保留时间	与模板分子保留时间的差异	活性
				奥司他韦(模板分子)	150 min	——	3
阿司匹林	37 min	113 min	0
				绿原酸	37 min	113 min	0
连翘苷	37 min	113 min	1
				苦参碱	170 min	20 min	3
氧化苦参碱	240 min	90 min	0
				槐定碱	310 min	160 min	0
氧化槐定碱	210 min	60 min	0

以化合物的活性为纵坐标，以其与模板分子保留时间的差异为横坐标绘散点图，得到图6所示的结果。

趋势图结果表明，化合物在分子印迹色谱柱上的保留时间与模板分子的差异愈小，其活性与模板分子的愈接近。

奥司他韦（OS）是医学临床中抗流感病毒的特效药。实验中，以OS为模板分子合成了OSMIP；并以此制备了OSMIP-LC柱，从中草药复方制剂分部位提取的成分群中，筛选出有亲和性的化合物苦参碱；苦参碱在体外对鸡H9N2禽流感病毒有一定的抑制和杀灭活性。

实验结果分析表明，化合物在OSMIP-LC柱上保留时间与模板分子OS越接近，其活性与OS越相似。

本发明以苦参碱体外抗禽流感病毒活性的发现为例，提供了一种非生物学分离筛选鉴定抗病毒中药有效成分的方法，筛选鉴定出的化合物可以和模板分子是不同类别的化合物。医学临床中没有备选药物，或者毒副作用较大的药物，以及采用常规生物学筛选方法而危险较大的化合物，可以采用此方法，发现新的活性类似的药物实体，从而加快药物筛选的过程。因而本发明所涉及的技术将在药物研发领域，具有较大的实用价值和广阔的应用前景。

Claims

1.一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法，其步骤包括：

a. 奥司他韦分子印迹聚合物及其液相色谱柱的制备

以0.1 mmol奥司他韦为模板分子、0.69 mmol功能单体、5 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基吡啶作为功能单体、甲苯作为致孔剂、15 mg偶氮二异丁腈作为引发剂，60 ℃油浴热引发聚合反应，所得质地坚硬的白色块状聚合物，对其进行研磨筛分，收集粒径在25～45 μm之间的颗粒，在索氏提取器中，采用甲醇-乙酸，甲醇-乙酸体积比为90 : 10，对其进行洗脱，以除去模板分子奥司他韦；50 ℃减压干燥，在2000 psi的压力下，湿法装填150 mm × 4.6 mm的液相色谱柱，将该色谱柱接入色谱仪，以合适的流动相对其进行洗脱、平衡，直至出现较为平稳的基线；

液相色谱条件：Agilent 1200 LC，OS-MIP自制150 mm × 4.6 mm, 25-45 μm液相色谱柱，柱温30℃；流动相为甲醇-乙腈-甲酸，甲醇 : 乙腈 : 甲酸体积比为75 : 25 : 0.01，流速为0.075 ml/min，数据采集软件为MassHunter，压力约170 bar；

质谱条件：Agilent 6410A QQQ电喷雾串联四级杆质谱仪，喷雾器压力30 psi，毛细管电压+4000 V，N₂流速10 L/min，温度350 ℃，采集周期为200 ms，模式Scan；

2.根据权利要求1所述一种非生物学筛选抗病毒中药有效成分的方法，其特征在于：筛选鉴定所得的抗病毒中药与模板分子的母体结构相同，或完全不同。