CN102070753B - 一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物及其作为固相萃取剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物及其作为固相萃取剂的应用，属于分析化学与材料科学技术领域。采用大隆作为模版分子，同功能单体在溶剂中混匀，混匀后在4℃以下保存24h形成预聚体；然后在常温下加入交联剂和引发剂，用波长为260nm的紫外光引发聚合24h，得到球形颗粒聚合物；用有机溶剂甲醇/乙酸浸泡，清洗除杂质，真空干燥，得到大隆分子印迹聚合物。本发明的制备方法简便、快速，对结构相似物大隆、溴敌隆有很好的吸附性能；建立的固相萃取方法，操作简单，对目标物选择性吸附，有效去除基体杂质，提高了分离精度，降低了检测限，适用于法庭科学领域生物样本(血液)中抗凝血鼠药大隆、溴敌隆的提取分离。

Description

一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物及其作为固相萃取剂的应用

技术领域

本发明涉及一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物及其作为固相萃取剂的应用，属于分析化学与材料科学技术领域。

背景技术

近年来，大隆、溴敌隆等抗凝血鼠药引发的投毒、自杀、误服等刑事案件屡见不鲜，生物样本中大隆、溴敌隆的分析检验至关重要。但由于司法鉴定领域毒物分析检材复杂多样、杂质干扰严重等，在腐败生物样本(如体液、毛发或脏器组织)中的高效分离、提取仍然是目前法医毒物分析工作者们研究的热点和难点。

近年来开发的分子印迹术，为法医毒物分析毒物的提取、分离提供了新思路和新途径。分子印迹聚合物(MIPs)具有预定性、识别性、实用性三大特点，对目标分子的空间结构具有“记忆”效应，能够高选择性识别复杂样品中的印迹分子，这些特点使得MIPs能够成为非常有吸引力的特异性吸附材料，已在分离领域有广泛的应用研究。分子印迹固相萃取(MISPE)技术是将分子印迹聚合物作为固相萃取剂，集分子印迹技术与固相萃取技术于一体，为样品的采集、富集和分析提供了极大的方便，克服了生物或环境样品体系复杂、预处理手续繁杂等不利因素，适用于腐败生物样本中目标物的提取分离、净化。

有关大隆分子印迹聚合物的制备及其在样本前处理中的应有还未见相关文献报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决已有技术中复杂样本中大隆等抗凝血鼠药提取分离困难的问题，提出一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物及其作为固相萃取剂的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明的一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物的制备方法为：

1)采用大隆作为模版分子，同功能单体在溶剂中混匀，混匀后在4℃以下保存24h形成预聚体；然后在常温下加入交联剂和引发剂，在4℃以下、用波长为260nm的紫外光引发聚合24h，得到球形颗粒聚合物；

功能单体为丙烯酰胺，溶剂为二甲基亚砜；交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯TRIM，引发剂为偶氮二异丁腈；功能单体、模板分子和溶剂的摩尔比为4∶1∶20；交联剂的体积用量为溶剂的1.6％，引发剂的摩尔用量为模版分子的4％；

2)用有机溶剂甲醇/甲酸浸泡步骤1)得到的球形颗粒聚合物并搅拌2h，球形颗粒聚合物中的模板分子溶解在有机溶剂甲醇/甲酸中，然后离心分离去除有机溶剂甲醇和乙酸；甲醇与甲酸的体积比为9∶1；

3)重复步骤2)2次以上；

4)经步骤3)清洗后的球形颗粒聚合物中加入乙醇，洗涤除去甲酸；

5)重复步骤4)2次以上；

6)经步骤5)清洗后的球形颗粒聚合物中加入丙酮，以除去细小颗粒，然后真空干燥，得到大隆分子印迹聚合物。

本发明的一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物作为固相萃取剂的应用，具体步骤为：

1)大隆分子印迹固相萃取柱的制备：

将制备的大隆分子印迹聚合物溶于甲醇中制成悬浮液，搅拌均匀后缓慢注入带有20μm筛板的聚乙烯空固相萃取柱中，真空抽吸使大隆分子印迹聚合物在空固相萃取柱中分布均匀，然后在大隆分子印迹聚合物上方装入20μm筛板，大隆分子印迹聚合物与甲醇的比50mg∶5mL；

2)制备样品：

取血液1mL，用2mL甲醇沉淀混旋，用6mL去离子水稀释，离心，取清液；

3)大隆分子印迹固相萃取方法：

依次用1mL甲醇、1mL甲醇/水混合溶剂活化大隆分子印迹固相萃取柱，然后将步骤2)制备的样品上固相萃取柱，然后再用2mL甲醇/水混合溶剂洗涤，最后用2mL甲醇/甲酸混合溶剂洗脱，收集洗脱液，在空气流下挥干，然后用200μL的甲醇溶解残渣，最后用LC、LC-MS分析；

甲醇/水的体积比为3∶7，甲醇/甲酸的体积比为9∶1。

有益效果

本发明的制备方法简便、快速，对结构相似物大隆、溴敌隆有很好的吸附性能，具有高度专一性和吸附选择性，为复杂基质中抗凝血鼠药大隆、溴敌隆的快速筛查、提取分离提供新手段，具有广阔的应用前景，有望实现工业化生产并投入实际应用；建立的分子印迹固相萃取方法，操作简单，对目标物选择性的吸附，对复杂基质中目标物的提取分离起到净化作用，有效去除基体杂质，提高了分离精度，降低了检测限，适用于法庭科学领域腐败生物样本中抗凝血鼠药大隆、溴敌隆的提取分离。

具体实施方式

以下的实施案例在于详细说明本发明，而非限制本发明。

实施例

一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物的制备方法为：

1)在50mL玻璃试管中放入大隆131.8mg(0.25mmol)和71mg丙烯酰胺(1mmol)，然后用20.0ml二甲基亚砜溶解混匀、密封后放入冰箱内自行聚合24h，冰箱温度在4℃以下；然后在常温下加入320μL(1mmol)三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和1.64mg偶氮二异丁腈(0.01mmol)，充分混匀并通氮气10min后放入到紫外灯箱内，在4℃以下、用波长为260nm的紫外光引发聚合24h，得到球形颗粒聚合物；

2)用有机溶剂甲醇/甲酸浸泡步骤1)得到的球形颗粒聚合物并搅拌2h，球形颗粒聚合物中的模板分子溶解在有机溶剂甲醇/甲酸中，然后离心分离去除有机溶剂甲酸；甲醇与甲酸的体积比为9∶1；

3)重复步骤2)2次；

4)经步骤3)清洗后的球形颗粒聚合物中加入乙醇，洗涤除去甲酸；

5)重复步骤4)4次；

6)经步骤5)清洗后的球形颗粒聚合物中加入丙酮，以除去细小颗粒，然后真空干燥，得到大隆分子印迹聚合物。

非印迹聚合物的制备除不加模板分子外，其余条件与上述一致。

大隆分子印迹聚合物的吸附效率的测定：

分别称量50mg已制备好的大隆分子印迹聚合物与非印迹聚合物，分别置于10mL含10μg大隆二甲基亚砜溶液中，浸泡24h，离心取上清液，采用LC测定吸附后溶液浓度分别为0.05μg/mL、0.64μg/mL；根据公式(1)计算大隆分子印迹聚合物和非印迹聚合物对大隆的吸附效率。

$E=\frac{C_0-C_i}{C_0}\×100\%$ $k=\frac{E_{\mathrm{MIP}}}{E_{\mathrm{NIP}}}---\left(1\right)$

式中：C₀-吸附前大隆浓度(μg/mL)，C_i-吸附后大隆浓度(μg/mL)；

k为表观吸附效果；E_MIP为大隆分子印迹聚合物对大隆的吸附效率，E_NIP为非印迹聚合物对大隆的吸附效率；

E_MIP＝95％，E_NIP＝35.7％，k＝2.66。

通过上述方法经过对浓度分别为1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL的大隆水溶液进行吸附，得出每克大隆分子印迹聚合物吸附大隆最大饱和吸附量为：36.3nmol。

大隆分子印迹聚合物的选择性的测定：

分别称量50mg已制备好的大隆分子印迹聚合物和非印迹聚合物，分别置于10mL含有1μg溴敌隆、1μg大隆的水溶液中，浸泡24h，离心取上清液，采用LC-MS测定吸附后溶液中大隆浓度、溴敌隆浓度；根据公式(1)计算大隆分子印迹聚合物和非印迹聚合物对大隆、溴敌隆的吸附效率；

分别称量50mg已制备好的大隆分子印迹聚合物和非印迹聚合物，分别置于10mL同时含有1μg溴敌隆、1μg大隆的甲醇溶液中，浸泡24h，离心取上清液，采用LC-MS测定吸附后溶液中大隆浓度、溴敌隆浓度；根据公式(1)计算大隆分子印迹聚合物和非印迹聚合物对大隆、溴敌隆的吸附效率；

分别称量50mg已制备好的大隆分子印迹聚合物和非印迹聚合物，分别置于10mL同时含有1μg溴敌隆、1μg大隆的乙腈溶液中，浸泡24h，离心取上清液，采用LC-MS测定吸附后溶液中大隆浓度、溴敌隆浓度；根据公式(1)计算大隆分子印迹聚合物和非印迹聚合物对大隆、溴敌隆的吸附效率；

上述的HPLC/MS色谱条件：Waters Symmetry C18柱(2.1mm×150mm×5μm)毛细管温度：280℃，毛细管电压：-45V，补偿电压-20kV；辅助气30arb，喷雾电压5.0kV，扫描方式：负离子MS/MS扫描方式，扫描范围：90-600，大隆母离子：523.0，碰撞能量：45％；溴敌隆母离子：527.2，碰撞能量：39％；流动相：甲醇∶水(0.1％甲酸)＝80∶20，5min。

测试结果如表1所示：

表1印迹聚合物和非印迹聚合物的吸附率及印迹效果

大隆分子印迹聚合物作为固相萃取剂的应用，具体步骤为：

1)大隆分子印迹固相萃取柱的制备：

将制备的50mg大隆分子印迹聚合物溶于5mL甲醇中，搅拌均匀后缓慢注入带有20μm筛板的聚乙烯空固相萃取柱中，真空抽吸使大隆分子印迹聚合物在空固相萃取柱中分布均匀，然后在大隆分子印迹聚合物上方装入20μm筛板；

2)制备样品：

取健康人空白血1mL于15mL塑料离心管中三等份，然后均加入1.0μg大隆、1.0μg大隆，用2mL甲醇沉淀蛋白混旋，用6mL去离子水稀释，离心分离，取清液；

取健康人空白血1mL于15mL塑料离心管中三等份，然后均加入0.5μg大隆、0.5μg溴敌隆，用2mL甲醇沉淀蛋白混旋，用6mL去离子水稀释，离心分离，取清液；

取健康人空白血2mL于15mL塑料离心管中三等份，然后均加入0.05μg大隆、0.05μg溴敌隆，用2mL甲醇沉淀蛋白混旋，用6mL去离子水稀释，离心分离，取清液；

3)大隆分子印迹固相萃取方法：

依次用1mL甲醇、1mL甲醇/水混合溶剂活化大隆分子印迹固相萃取柱，分别将步骤2)制备的样品上固相萃取柱，然后再用2mL甲醇/水混合溶剂洗涤，最后用2mL甲醇/甲酸混合溶剂洗脱，收集洗脱液，在空气流下挥干，然后用300μL的甲醇溶解残渣，过液相专用滤膜，最后用LC-MS分析计算大隆、溴敌隆的回收率，其结果如表2所示；甲醇/水的体积比为3∶7，甲醇/甲酸的体积比为9∶1。

表2MISPE提取空白血添加大隆、溴敌隆回收率表

UPLC-MS条件：

BEH C18柱(2.1mm×50mm×1.7μm)，流动相：A-乙腈B-0.1％氨水，梯度洗脱：0-0.095min，A90％、B10％，0.95-2.0min，A10％、B90％，2.20-3.20min，A90％、B10％，运行5min；离子源温度：150℃，毛细管电压：-2.70KV；脱溶剂气流速：600L/h，喷雾电压5KV，扫描方式：MRM模式，大隆扫描离子对520.21＞134.93，520.21＞78.83；溴敌隆扫描离子对520.21＞249.81，520.21＞92.93。

RSD％为同一浓度下三个样品的回收率的相对相差。

通过上述方法步骤2)中经过对大隆、溴敌隆各自浓度在1～50ng/mL之间空白血5mL，经步骤3)进行LC-MS分析，得到大隆分子印迹固相萃取对大隆、溴敌隆的最低提取检测限(S/N＝3/1)均为10ng/mL。

上述的LC/MS色谱条件：Waters Symmetry C18柱(2.1mm×150mm×3.5μm)；毛细管温度：285℃，毛细管电压：-20KV，补偿电压-20KV；鞘气流速：30ml/min，喷雾电压5KV，扫描方式：负离子扫描MS/MS方式，扫描范围：90-600，大隆母离子：523.0，碰撞能量：45％；溴敌隆母离子：527.2，碰撞能量：39％；流动相：甲醇∶水(0.1％甲酸)＝80∶20，5min。

Claims (2)

1.一种抗凝血鼠药大隆分子印迹聚合物，其特征在于其制备方法为：

1）采用大隆作为模版分子，同功能单体在溶剂中混匀，混匀后在4℃以下保存24h形成预聚体；然后在常温下加入交联剂和引发剂，在4℃以下、用波长为260nm的紫外光引发聚合24h，得到球形颗粒聚合物；功能单体为丙烯酰胺，溶剂为二甲基亚砜；交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯TRIM，引发剂为偶氮二异丁腈；功能单体、大隆和溶剂的摩尔比为4:1:20；交联剂的体积用量为溶剂的1.6%，引发剂的摩尔用量为模版分子的4%；

2）用有机溶剂甲醇/乙酸浸泡步骤1）得到的球形颗粒聚合物并搅拌2h，球形颗粒聚合物中的模版分子溶解在有机溶剂甲醇/乙酸中，然后离心分离去除有机溶剂甲醇和乙酸；甲醇与乙酸的体积比为9:1；

3）重复步骤2）2次以上；

4）经步骤3）清洗后的球形颗粒聚合物中加入乙醇，洗涤除去乙酸；

5）重复步骤4）2次以上；

6）经步骤5）清洗后的球形颗粒聚合物中加入丙酮，以除去细小颗粒，然后真空干燥，得到大隆分子印迹聚合物。

2.一种如权利要求1所述的大隆分子印迹聚合物作为固相萃取剂的应用，其特征在于具体步骤为：

1）大隆分子印迹固相萃取柱的制备：

将制备的大隆分子印迹聚合物溶于甲醇中，搅拌均匀后缓慢注入带有20μm筛板的聚乙烯空固相萃取柱中，真空抽吸使大隆分子印迹聚合物在空固相萃取柱中分布均匀，然后在大隆分子印迹聚合物上方装入20μm筛板，大隆分子印迹聚合物与甲醇的比50mg:5mL；

2）制备样品：

取血液1mL，用2mL乙腈沉淀混悬后，用8mL去离子水稀释，离心，取清液；

3）大隆分子印迹固相萃取方法：

依次用1mL甲醇、1mL甲醇/水混合溶剂活化大隆分子印迹固相萃取柱，然后将步骤2）制备的样品上固相萃取柱，然后再用2mL甲醇/水混合溶剂洗涤，最后用2mL甲醇/甲酸混合溶剂洗脱，收集洗脱液，在空气流下挥干，然后用200μL的甲醇溶解残渣，过液相专用滤膜后，用LC或LC-MS分析；

甲醇/水的体积比为3:7，甲醇/甲酸的体积比为9:1。