CN102033111A - 反相高效液相色谱法分离多黏菌素e甲磺酸钠及其类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用烷基键合硅胶填充柱成功分离及分析多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的方法。本发明方法的特征是液相色谱条件为：以烷基键合硅胶填充柱为固定相，流动相为有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂。其中以Optimapak公司的C18烷基键合硅胶填充柱为固定相，乙睛与0.05％三氟乙酸水溶液梯度(体积比20∶80～50∶50)洗脱时，达到了好的分离效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种色谱分离分析方法，具体是一种分离分析多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的高效液相色谱(HPLC)方法，属于药物分析领域。
背景技术
很多严重的感染是由具有很强耐药性的绿脓假单胞菌引起的，而多黏菌素类药物对该类感染的致病菌具有较好的抑制效果。自从硫酸多黏菌素类化合物于1947年从不同种类的多黏芽孢杆菌提取得到，就被应用于体外抗菌实验中。但由于其毒副作用较大，应用并未得到普遍推广。而以其作为原料合成的多黏菌素E甲磺酸钠则较其毒性低，且抑菌效果不减。而目前，国内尚无对该类药物的分析方法，因此，对该类药物的分析研究成为当前一项具有重要意义的工作。
发明内容
本发明的目的在于填补目前国内对于多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的分离及分析方法的空白，提供一种能准确的分离分析多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的高效液相色谱方法，从而对该类药物进行分离分析研究。
本发明方法的特征是液相色谱条件为：以烷基键合硅胶填充柱为固定相，流动相为有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂。
当以烷基键合硅胶填充柱为固定相时，优化条件为C18烷基键合硅胶填充柱。更优为OptimapakC18烷基键合硅胶填充柱。
当流动相为有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂时，有机溶剂可以为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮，或上述两种及两种以上有机溶剂的混合物等，酸可以为盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺酸、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸或上述两种及两种以上酸的混合物等，混合溶剂组成的体积比为有机溶剂∶酸的水溶液3∶97～80∶20。优化条件为：流动相中有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂体积比为15∶85～50∶50。更优化条件为：在10～20分钟内，混合溶剂组成的体积比(乙腈∶三氟乙酸水溶液)在15∶85～60∶40内线性变化，其中三氟乙酸的体积浓度为0.05％～1％。等度洗脱的优化条件为混合溶剂中乙腈∶三氟乙酸水溶液体积比为20∶80～45∶55。
下面通过以下的实验研究对本发明做进一步说明。
1.分离目标
分离目标为合成多黏菌素E甲磺酸盐过程中所产生的多黏菌素E甲磺酸盐及其类似物，多肽硫酸盐结构式见附图1，多黏菌素E甲磺酸盐的结构式见附图2。
2.多黏菌素E甲磺酸钠供试品溶液制备
多黏菌素E甲磺酸钠极易溶于水，因此确定了标准品的制备首先选用水溶解，然后以适量的乙腈定容。优选流动相来溶解标准品。
3.高效液相色谱条件
(1)色谱柱选择确定
选用烷基键合硅胶固定相为分离介质进行试验，比较了Agela公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Agilent公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Waters公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Shimadzu公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Optimapak公司C18、C8、C4烷基键合硅胶柱等。确定了C18柱有较好的分离效果，以Optimapak公司C18烷基键合硅胶填充柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)为优，因此选用Optimapak公司C18柱。
(2)检测方法确定
多黏菌素E甲磺酸钠具有紫外吸收，因此可用紫外检测器检测。样品分别溶于水、该方法采用的流动相来测定其紫外光谱，数据见表一。对比这两个波长检测的HPLC谱图，以波长214nm波长图谱的吸收更明显，因此确定：用紫外检测法波长选用212～216nm。此外，还可用蒸发光散射检测器来检测。
表一多黏菌素E甲磺酸钠紫外光谱数据
(3)流动相的选择确定
多黏菌素E甲磺酸钠是一种肽盐，结构复杂，性质易变，因此选择合适的流动相使其得到较好的分离又保持目标物质的性质不变是方法的关键。
根据多黏菌素E甲磺酸钠的理化性质和经验，我们选用甲醇-水、乙腈-水、异丙醇-水溶剂系统分别进行等度洗脱对比筛选。色谱柱为Optimapak公司C18柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温。结果表明，混合溶剂乙腈-水具有更好的分离能力和结果，因此选用乙腈-水溶剂系统作为流动相。
选用乙腈-水溶剂系统进行梯度洗脱对比筛选。色谱柱为Optimapak公司C18柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温。对比研究数据及其分析结果，见表二[表中所描述色谱柱规格均为(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)]。
表二流动相(梯度)对比筛选试验评价结果(一)
| NO | 色谱条件 | 吸收峰参数 | 结果评价 |
| 1 | 在0-10min内，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比从30∶70线性变为45∶55，Optimapak色谱柱 | 保留时间：1.946分离度：1.210对称因子：0.951理论塔板数：3408 | 保留时间短，具有一定的分离效果 |
| 2 | 在0-10min内，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比从20∶80线性变为50∶50，Optimapak色谱柱 | 保留时间：4.403分离度：1.610对称因子：0.993理论塔板数：4745 | 保留时间适中，分离度较好 |
| 3 | 梯度0-10min，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比从20∶80线性变为50∶50，Shimadzu色谱柱 | 保留时间：2.783分离度：1.302对称因子：0.925理论塔板数：1405 | 保留时间较短，具有一定的分离效果 |
| 4 | 在0-10min内，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比从30∶70线性变为45∶55，Waters色谱柱 | 保留时间：2.734分离度：1.235对称因子：0.984理论塔板数：1357 | 保留时间适中，具有一定分离效果 |
| 5 | 在0-10min内，乙腈-水体积比从30∶70线性变为45∶55，Agela色谱柱 | 保留时间：6.116分离度：1.556对称因子：0.990理论塔板数：1477 | 保留时间适中，分离效果好。 |
| 6 | 等度洗脱0-15min，乙腈-三氟乙酸水溶液35∶65Optimapak色谱柱 | 保留时间：2.152分离度：1.214对称因子：0.966理论塔板数：2055 | 保留时间略短，分离效果较好。 |
| 7 | 等度洗脱0-15min，甲醇-乙腈-三氟乙酸水溶液10∶29∶61 | 保留时间：2.453分离度：1.231 | 保留时间略短，分离效果较好。 |
| 对称因子：0.894理论塔板数：2018 |
用优化的实验2梯度洗脱条件来进行分析测试，即色谱条件为：梯度变化时间为0-10min，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比由20∶80线性变为乙腈-三氟乙酸水溶液50∶50，结果见表三。
结果表明：流动相以乙腈-三氟乙酸水溶液组成的混合溶剂具有好的分离效果，三氟乙酸的适宜浓度为0.05％～0.1％。优选乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液组成的混合溶剂作为流动相。
表三优选流动相分析结果
| 色谱条件 | 吸收峰参数 | 结果评价 |
| 乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液体积比从20∶80线性变为50∶50(条件2) | 保留时间4.403分离度1.610 | 保留时间适中，吸收峰形对称，达到基线分离。 |
4测试实例
供试品溶液的配置：取多黏菌素E甲磺酸钠对照品精密称取0.1g，置10mL容量瓶中，量取0.05％三氟乙酸水溶液8.0mL于该容量瓶中，摇匀，溶解后以乙腈(色谱纯)定容。摇匀，即得1.0mg/mL供试溶液。
以同样的方法配制1.0mg/mL多黏菌素E硫酸盐供试液。
多黏菌素E甲磺酸钠分解样品由多黏菌素E甲磺酸钠测试溶液放置2天后得到。实例1)多黏菌素E硫酸盐的分离
多黏菌素E1、E2硫酸盐的测定采用色谱条件如下：色谱柱为Optimapak公司C18柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温，进样体积5μL。等梯度变化时间0-10min，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比从20∶80线性变为50∶50，三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.05％。试验结果见附图3，表明此方法具有好的分离效果。
实例2)多黏菌素E甲磺酸钠样品的分离
多黏菌素E1、E2甲磺酸钠的测定采用色谱条件如下：色谱柱为Optimapak公司C18柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温，进样体积5μL。等梯度变化时间0-10min，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比从20∶80线性变为50∶50，三氟乙酸水溶液的浓度为0.05％。试验结果见附图4，表明此方法具有好的分离效果。实例3)多黏菌素E甲磺酸钠分解样品的分离
多黏菌素E1、E2甲磺酸钠分解样品的测定采用色谱条件如下：色谱柱为Optimapak公司C18柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温，进样体积5μL。等梯度变化时间0-10min，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比从20∶80线性变为50∶50，三氟乙酸水溶液的浓度为0.05％。试验结果见附图5，表明此方法具有好的分离效果。
实例4)多黏菌素E甲磺酸钠样品的等度分离(1)
多黏菌素E1、E2甲磺酸钠的测定采用色谱条件如下：色谱柱为Optimapak公司C18柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围2.0～8.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温，进样体积7μL。等度时间15min，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比为35∶65，三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.08％。试验结果见附图6，表明此方法具有较好的分离效果。实例5)多黏菌素E甲磺酸钠样品的等度分离(2)
多黏菌素E1、E2甲磺酸钠的测定采用色谱条件如下：色谱柱为Agela公司VenusilHILICC18柱(150×4.6mmi.d，5μm，pH范围1.0～10.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温，进样体积5μL。等度时间15min，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比为35∶65，三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.08％。实验结果见附图7，表明此方法具有较好的分离效果。实例6)多黏菌素E甲磺酸钠分解样品的等度分离
多黏菌素E1、E2甲磺酸钠分解样品的测定采用色谱条件如下：色谱柱为Agilent公司XBDC18柱(250×4.6mmi.d，5μm，pH范围1.0～10.0)，检测波长212～216nm，流速1.0mL/min，温度为室温，进样体积6μL。等度时间15min，乙腈-三氟乙酸水溶液体积比为35∶65，三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.1％。实验结果见附图8，表明此方法具有较好的分离效果。
附图说明：
图1：多黏菌素E多肽硫酸盐结构式
图2：多黏菌素E甲磺酸钠多肽硫酸盐结构式
图3：多黏菌素E1、E2硫酸盐分离色谱图
图4：多黏菌素E1、E2甲磺酸钠分离色谱图
图5：多黏菌素E1、E2甲磺酸钠分解样品的分离色谱图
图6：多黏菌素E1、E2甲磺酸钠样品等度分离色谱图
图7：多黏菌素E1、E2甲磺酸钠样品等度分离色谱图
图8：多黏菌素E1、E2甲磺酸钠分解样品等度分离色谱图
本发明的有益效果和技术创新在于：
(1)经过系统的比较，建立了一种测定多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的高效液相色谱方法，可用于类似结构和化学性质的物质的分离，为该类新药进一步深入研发和申报工作创造了不可或缺的条件。
(2)分析方法具有耗时短，操作简单，方法可靠等技术特点。
本发明可直接应用于该类新药的研究和质量控制工作中。
具体实施方式：
以上的具体实例可进一步说明本发明及其应用，但并不构成对本发明权利要求所保护的范围的限制。
Claims (6)
1.一种分离多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的高效液相分析方法，其特征是以烷基键合硅胶填充柱为固定相，以有机溶剂和水组成的混合溶剂为流动相，进行等度或梯度洗脱，用紫外检测器或蒸发光散射检测器进行检测。
2.如权利要求1所说高效液相色谱方法，其特征是利用烷基键合硅胶填充柱为固定相，优化条件为以已知的各类型商品化碳18烷基键合硅胶填料为固定相，优化的固定相填料粒径为1.5～10μm，更优为的optimapak碳18烷基键合硅胶填料。分析柱柱长为3～50cm，更为优化的柱长为15～25cm。
3.如权利要求1所说高效液相色谱方法，其特征是有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂，其中有机溶剂可以为：乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮，或上述两种及两种以上有机溶剂的混合物；酸可以为：盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺酸、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸或上述两种及两种以上酸的混合物。
4.如权利要求1所说高效液相色谱方法，其特征在于流动相所用水为脱盐水，流动相经0.45μm的滤膜过滤。所用高效液相色谱的操作条件为：色谱柱：optimapak碳18烷基键合硅胶填充柱[(150～250)×(2.1～4.6)mmi.d，2～10μm]，流速为：0.2～1.0ml/min，检测波长为：205～225nm，PH为1.0～10.0，温度为0～60℃。更优化为：色谱柱：optimapak碳18烷基键合硅胶填充柱[(150～250)×(2.1～4.6)]mmi.d，2～5μm)，流速为：0.8ml/min，检测波长为：214nm，PH为1.5～8，温度为常温。
5.如权利要求1所说高效液相色谱方法，其特征为梯度洗脱条件为：梯度变化时间为5～80分钟，混合溶剂组成的体积比为有机溶剂∶酸水溶液3∶97～80∶20；线性洗脱条件为有机溶剂∶酸水溶液15∶85～50∶50。混合溶剂中酸的质量浓度为0.01％～5％。更为优化的洗脱条件为：梯度变化时间为：10～20分钟，混合溶剂组成的体积比为乙腈∶三氟乙酸水溶液15∶85～60∶40，三氟乙酸的浓度为0.05％～1％。
6.如权利要求3所说高效液相色谱方法，其特征为在上述的混合溶剂中也可以添加表面活性剂，如二乙胺、三乙胺、季铵盐、磺酸盐等。
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