CN109444318B - 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法 - Google Patents

一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109444318B
CN109444318B CN201811467424.3A CN201811467424A CN109444318B CN 109444318 B CN109444318 B CN 109444318B CN 201811467424 A CN201811467424 A CN 201811467424A CN 109444318 B CN109444318 B CN 109444318B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacitracin
mobile phase
high performance
liquid chromatography
performance liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811467424.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109444318A (zh
Inventor
张含智
秦峰
刘浩
闻宏亮
赵敬丹
裘亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Original Assignee
SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL filed Critical SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority to CN201811467424.3A priority Critical patent/CN109444318B/zh
Publication of CN109444318A publication Critical patent/CN109444318A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109444318B publication Critical patent/CN109444318B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/89—Inverse chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/64—Electrical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种分析杆菌肽组分的高效液相色谱(HPLC)方法，其将杆菌肽样品或杆菌肽锌样品在溶剂中溶解后，各组分直接通过HPLC‑UV经反相色谱柱进行分析测定；其中，流动相A选自甲酸铵溶液、乙酸铵溶液、甲酸溶液或乙酸溶液；流动相B选自乙腈、甲醇或含有甲酸或乙酸的有机溶剂，以梯度条件洗脱，各组分通过紫外可见光检测器、二极管阵列检测器或质谱检测器进行分析测定。本发明所涉及的方法适用于分析杆菌肽类如原料药、制剂、软膏剂等样品中的组分，杆菌肽A、杆菌肽B1/B2/B3均与相邻有关物质实现了较好的分离，适合于定性定量分析。本发明具有成本低、分析过程简单高效、快捷、重复性好等优点，方便用于产品的质量控制。

Description

一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分析杆菌肽组分的高效液相色谱(HPLC)方法。
背景技术
杆菌肽(bacitracin，结构通式见图1)是由枯草杆菌和地衣芽孢杆菌产生的一系列抗菌肽的混合物，其抗菌谱与青霉素相似，能强烈抑制革兰氏阳性菌，主要用于治疗耐青霉素的葡萄球菌感染。杆菌肽具有特殊的抑菌机理，会干扰细菌细胞壁的合成，同时在肽聚糖的合成中抑制磷脂受体的再生，使得其具有抗菌谱广、不易产生耐药性等特性。在药用过程中添加锌离子以增强活性。
由于是发酵产品，杆菌肽成分较多，组分之间结构相似且复杂，目前在《欧洲药典》9.0版、《英国药典》2017版及《美国药典》40版中规定了杆菌肽的主要组分为杆菌肽A，有效活性组分为杆菌肽A、B1/B2/B3，另外还存在杆菌肽C、E、F、H等。其中杆菌肽F是杆菌肽A链端的噻唑啉环自发氧化产生的无抗菌活性的组分，结构式见图1中框中所示，是《欧洲药典》9.0版、《英国药典》2017年版、《美国药典》40版中指定严格控制的杂质。由于杆菌肽组分较多，对其分离具有较大的难度，《美国药典》40版、《欧洲药典》9.0版采用高效液相色谱法(磷酸氢二钾/乙腈/甲醇体系)分析杆菌肽组分，但分离效果不佳，如图2所示，色谱峰之间相互重叠，已知组分杆菌肽B1与B2、C2与C3未能实现基线分离，同时本方法不适合直接用于质谱分析。文献(Rapid Commun Mass Spectrom,2003,17(12):1366-1379)采用甲醇/乙腈/0.1mol/L乙酸铵溶液(pH 6.0)/水(58:5:10:27，v/v/v/v)流动相体系，未能明显改善组分之间的分离(如B1与B2，图3中峰10与峰11所示)。文献(Electrophoresis,2001,22(7):1356-1362)采用胶束电动毛细管电泳实现了对杆菌肽组分之间的有效分离，是对液相方法的有益补充，但对色谱峰的归属是基于对文献(JAntibiot,1995,48,233-242)中峰定位的推测。《中国药典》2015年版中没有有关物质及组分检查项，缺少全面控制杆菌肽质量的关键一环。
因此，目前急需一种分析过程简单且能有效控制杆菌肽质量的分析方法。
发明内容
为了解决现行药典(《欧洲药典》9.0版、《英国药典》2017版及《美国药典》40版)及文献中杆菌肽分离效果差、柱效低等问题，本发明提供一种简单、灵敏，适合杆菌肽组分的HPLC方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱(HPLC)方法，其将杆菌肽样品或杆菌肽锌样品在溶剂中溶解后，各组分直接通过HPLC-UV经反相色谱柱进行分析测定；其中，流动相A选自甲酸铵溶液、乙酸铵溶液、甲酸溶液或乙酸溶液；流动相B选自乙腈、甲醇或含有甲酸或乙酸的有机溶剂，以梯度条件洗脱。
为了进一步优化上述高效液相色谱方法，本发明采取的技术措施还包括：
进一步地，所述杆菌肽组分包括主要组分、其他组分和有关物质；其中，所述主要组分为杆菌肽A，所述其他组分包括杆菌肽B、杆菌肽C、杆菌肽E、杆菌肽F、杆菌肽H、杆菌肽I中的至少一种，所述有关物质包括杆菌肽的氧化产物、差向异构化产物、水解产物、硫酸化产物中的至少一种。
进一步地，所述杆菌肽B包括杆菌肽B1、杆菌肽B2、杆菌肽B3；所述杆菌肽C包括杆菌肽C1、杆菌肽C2、杆菌肽C3；所述杆菌肽H包括杆菌肽H1、杆菌肽H2、杆菌肽H3；所述杆菌肽I包括杆菌肽I1、杆菌肽I2、杆菌肽I3。
进一步地，上述高效液相色谱方法中分析的杆菌肽组分包括主要组分、其他组分和有关物质；其中，主要组分为杆菌肽A，其他组分包括杆菌肽B、杆菌肽C、杆菌肽F；有关物质主要包括杆菌肽氧化产物、差向异构化产物、水解产物、硫酸化产物；其中，所述杆菌肽B包括杆菌肽B1、杆菌肽B2、杆菌肽B3；所述杆菌肽C包括杆菌肽C1、杆菌肽C2、杆菌肽C3。
本领域技术人员可知的是，上述有关物质还可包括其他无抗菌活性的成分或杂质。
进一步地，所述杆菌肽样品包括杆菌肽原料药、注射剂及软膏剂；所述杆菌肽锌样品包括杆菌肽锌原料药、注射剂及软膏剂。
进一步地，用于溶解所述杆菌肽样品的溶剂包括但不限于水、乙腈、甲醇、异丙醇或其混合溶剂，优选水和乙腈的混合溶液，更优选为水：乙腈＝77:23(v/v)。
进一步地，用于溶解所述杆菌肽锌样品的溶剂包括含有乙二胺四乙酸二钠的水溶液、乙腈、甲醇、异丙醇或其混合溶剂，优选为含有乙二胺四乙酸二钠的水溶液(40g/L，pH经氢氧化钠溶液调至7.0(也可采用其他pH调节剂))。
进一步地，所述杆菌肽样品或杆菌肽锌样品溶解后的终浓度为0.1mg/mL-20mg/mL，优选为1mg/mL。
进一步地，含有甲酸或乙酸的有机溶剂包括含有甲酸或乙酸的甲醇、乙醇、异丁醇或乙腈等。
进一步地，上述高效液相色谱方法中，所述流动相A为甲酸铵溶液，所述流动相B为乙腈。
进一步地，所述甲酸铵溶液的浓度范围在5mmol/L-100mmol/L，优选浓度为50mmol/L。
进一步地，所述甲酸铵溶液的pH范围经酸溶液调整至2-6，优选pH为4.5。
进一步地，用于调节甲酸铵溶液的pH的酸溶液为甲酸、乙酸或盐酸，也可为本领域常规使用的其他合适的酸溶液。
进一步地，所述流动相A与流动相B的梯度洗脱比例(体积分数)为：0min(流动相B的比例：15％-25％)—30min(流动相B的比例：25％-35％)—40min(流动相B的比例：35％-45％)—50min(流动相B的比例：35％-45％)—51min(流动相B的比例：15％-25％)—58min(流动相B的比例：15％-25％)。优选为0min(流动相B的比例：23％)—30min(流动相B的比例：30％)—40min(流动相B的比例：40％)—50min(流动相B的比例：40％)—51min(流动相B的比例：23％)—58min(流动相B的比例：23％)。
进一步地，所述反相色谱柱的填料为十八烷基(C18)键合的硅胶基质、八烷基(C8)键合的硅胶基质或四烷基键合的硅胶基质，色谱柱柱长5-30cm，直径1-10mm，填料粒径1-10μm。优选为C18反相色谱柱，柱长25cm，直径4.6mm，填料粒径5μm。
进一步地，经过所述反相色谱柱的流速为0.5-1.5ml/min，优选为1ml/min。
进一步地，所述反相色谱柱的进样体积为1-100μl，优选为20μl。
进一步地，色谱柱柱温为20℃-40℃。优选为30℃。
进一步地，所述分析测定采用的检测器选自紫外检测器、二极管阵列检测器或者质谱检测器。
进一步地，所述紫外检测器、二极管阵列检测器的检测波长为180-380nm。优选为254nm。
进一步地，所述HPLC方法，可直接采用质谱作为检测器来分析杆菌肽中的组分。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明中公开了一种分析杆菌肽组分的HPLC方法，通过半制备液相色谱技术收集已知组分杆菌肽A、B1/B2/B3、C1/C2/C3、F(采用《美国药典》40版中杆菌肽液相分析方法)，在本发明所述的色谱系统中将以上组分进行明确的定位。本发明可以弥补现行药典的分析缺陷，同时具有成本低，分析过程简单、快捷、重复性好等优点，对产品工艺改进及质量控制水平提高具有一定的借鉴意义。其具体有益效果如下：
(1)本发明所述的高效分析杆菌肽组分的HPLC方法，杆菌肽A、杆菌肽B1/B2/B3及杆菌肽C1/C2/C3、杆菌肽F均与相邻物质分离良好，且好于目前已公布的药典方法(《欧洲药典》9.0版、《英国药典》2017版及《美国药典》40版)及文献中的液相色谱方法(J Antibiot,1995,48,233-242；J Pharm Biomed Anal,2001,24,977-982；Rapid Commun MassSpectrom,2003,17(12):1366-1379；J Pharm Biomed Anal,2012,70,619-623)；
(2)通过制备已知杆菌肽组分(杆菌肽A、杆菌肽B1/B2/B3、杆菌肽C1/C2/C3、杆菌肽F，采用《美国药典》40版中杆菌肽项下的相关液相分析方法，以上组分有其各自的相对保留时间)，在本发明中公布的HPLC方法中进行定位，可以确保与药典方法组分之间的对应性；
(3)药典方法采用非挥发性盐溶液(磷酸盐)作为流动相，不能进行质谱分析，存在局限性，本发明中的方法可实现HPLC-MS联用直接分析杆菌肽中的组分；
(4)毛细管电泳方法(Electrophoresis,2001,22(7):1356-1362)对杆菌肽各组分的定位是基于已有文献的推测，本发明对各组分有明确定位；
(5)方法重复性好，柱效高，对不同的杆菌肽样品测定结果稳定可靠；适合于杆菌肽组分的定性定量分析，易于推广。
附图说明
图1为杆菌肽组分的结构通式。
图2为本发明一对比例中杆菌肽样品通过《美国药典》40版中的分析方法获得的典型色谱图。
图3为本发明一对比例中根据文献(Rapid Commun Mass Spectrom,2003,17(12):1366-1379)所述方法获得的杆菌肽的典型色谱图；其中峰10为杆菌肽B1、峰11为杆菌肽B2。
图4为本发明一对比例中根据文献(Electrophoresis,2001,22(7):1356-1362)所述方法获得的杆菌肽的毛细管电泳图。
图5为本发明一实施例中分析USP杆菌肽锌对照品的典型色谱图。
图6为本发明一实施例中分析EP杆菌肽锌对照品的典型色谱图。
图7为本发明一实施例中分析中检院杆菌肽对照品的典型色谱图。
具体实施方式
本发明涉及一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法，其将杆菌肽样品或杆菌肽锌样品在溶剂中溶解后，各组分直接通过HPLC-UV经反相色谱柱进行分析测定；其中，流动相A选自甲酸铵溶液、乙酸铵溶液、甲酸溶液或乙酸溶液；流动相B选自乙腈、甲醇或含有甲酸或乙酸的有机溶剂，以梯度条件洗脱。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明中涉及的杆菌肽组分，以杆菌肽A、杆菌肽B、杆菌肽C、杆菌肽F等物质的分离为具体实施案例，但本发明也可以推广至其他杆菌肽如杆菌肽E、杆菌肽H、杆菌肽I等。本发明涉及的样品，以杆菌肽及杆菌肽锌为具体实施案例，但也可适用于其他杆菌肽制剂中。本发明所涉及的杆菌肽组分的结构式如图1所示。
对比例1
本对比例采用按照《美国药典》40版中杆菌肽的相关分析方法。
一、仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。
USP杆菌肽锌对照品(批号：R048CO)。
二、实验条件
选择Diamonsil Plus C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以磷酸氢二钾、磷酸二氢钾-甲醇-乙腈为流动相，流速为1ml/min；柱温为30℃；进样量为20μl；检测波长为254nm。在组分制备过程中，进样量调整为100μl。
三、USP杆菌肽对照品样品溶液配制及分析(采用《美国药典》40版中的分析方法)
精密称取USP杆菌肽锌对照品20mg，置10ml量瓶中，加乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)溶液(40g/L，pH经氢氧化钠溶液调至7.0)溶解并定量稀释至刻度，摇匀。经HPLC-UV分析，其典型色谱图见图2所示，通过相对保留时间对杆菌肽A、B1/B2/B3、C1/C2/C3、F进行定位，杆菌肽B1与B2、杆菌肽C3与相邻物质未实现基线分离，该方法不适合对杆菌肽进行定性定量分析。
通过提高杆菌肽锌溶液的浓度(15mg/ml)及进样量(100μl)，分别收集已知组分或有关物质(杆菌肽A、B1/B2/B3、C1/C2/C3、F)的馏分，经氮气吹扫去除溶剂，得到各组分的浓缩溶液，即杆菌肽A、B1/B2/B3、C1/C2/C3、F的制备溶液。
对比例2
本对比例采用文献(Rapid Commun Mass Spectrom,2003,17(12):1366-1379)中所述的方法对杆菌肽组分进行分析，其典型色谱图如图3所示。
对比例3
对比例采用文献(Electrophoresis,2001,22(7):1356-1362)中所述的方法获得杆菌肽的毛细管电泳图，其结果如图4所示。
实施例1
本实施例为将杆菌肽或杆菌肽锌溶解后，在甲酸铵-乙腈为分离体系的HPLC-UV系统中经反相色谱柱分离，各组分通过紫外可见光检测器或二极管阵列检测器进行分析测定。
一、仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。
USP杆菌肽锌对照品(批号：R048CO)、EP杆菌肽锌对照品(批号：Batch3.0)、中国食品药品检定研究院杆菌肽对照品(中检院，批号：130320-200709)。
二、实验条件
以50mmol/L甲酸铵溶液(用甲酸调节pH值至4.0)为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行线性梯度洗脱程序，流速为1ml/min；柱温为30℃；进样量为20μl；检测波长为254nm。
表1
Figure GDA0002949306140000071
三、不同杆菌肽样品溶液配制及分析
USP杆菌肽锌对照品、EP杆菌肽锌对照品、中检院杆菌肽对照品溶液的配制方法如下：
精密称对照品20mg，置10ml量瓶中，加乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)溶液(40g/L，pH经氢氧化钠溶液调至7.0)溶解并定量稀释至刻度，摇匀。
按照上述实验条件进行分析，典型色谱图见图5-7所示，图5对应USP杆菌肽锌对照品(R048CO)，图6对应EP杆菌肽锌对照品(Batch 3.0)，图7对应中检院杆菌肽对照品(130320-200709)。
取对比例1中的制备溶液(杆菌肽A、B1/B2/B3、C1/C2/C3、F)，在本实施例得到的色谱图中进行定位，如图5-7中的标识。杆菌肽B1、B2实现了基线分离，杆菌肽C2、C3与相邻有关物质均实现了较好的分离，适合于定性定量分析。
四、不同杆菌肽样品中各组分的定量分析
取上述的不同杆菌肽样品溶液，采用本实施例所述的HPLC方法，分别记录色谱图。由于已知组分与相邻杂质之间均实现良好分离，故可按照面积归一化法分别计算杆菌肽A、有效组分(A+B1/B2/B3)、B1、B2、B3、C1、C2、C3及F的含量，结果见表2。
表2不同杆菌肽样品组分的检测结果/％
Figure GDA0002949306140000081
由上述对比例和实施例可知，本发明公开了一种分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法。相较于已有方法，本发明具有如下优势：(1)本发明公布的高效分析杆菌肽组分的HPLC方法，杆菌肽A、杆菌肽B1/B2/B3、杆菌肽C1/C2/C3、杆菌肽F均分离良好，并首次实现杆菌肽B1与B2基线分离。分析效果好于目前已公布的药典方法(《欧洲药典》9.0版、《英国药典》2017版及《美国药典》40版)及文献中的液相色谱方法(J Antibiot,1995,48,233-242；JPharm Biomed Anal,2001,24,977-982；Rapid Commun Mass Spectrom,2003,17(12):1366-1379；J Pharm Biomed Anal,2012,70,619-623)；(2)本发明中HPLC方法填补了中国药典2015年版中缺乏杆菌肽组分分析的空白；(3)药典方法采用非挥发性盐溶液(磷酸盐)作为流动相，不能进行质谱分析，存在局限性，本发明中的方法可实现HPLC-MS联用直接分析杆菌肽中的组分；(4)毛细管电泳方法(Electrophoresis,2001,22(7):1356-1362)对杆菌肽各组分的定位是基于已有文献的推测，本发明对各组分有明确定位；(5)方法重复性好，柱效高，对不同的杆菌肽样品测定结果稳定可靠；适合于杆菌肽组分的定性定量分析，易于推广。
相较于药典方法，通过本发明的技术方法，可以实现对杆菌肽更加严格地质量控制。综上所述，本发明中的技术方法易于操作，可快速高效灵敏地分析杆菌肽中的组分。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法，其特征在于，将杆菌肽样品或杆菌肽锌样品在溶剂中溶解后，各组分直接通过HPLC-UV经反相色谱柱进行分析测定；其中，以50mmol/L甲酸铵溶液、且用甲酸调节pH值至4.0为流动相A，乙腈为流动相B，所述流动相A与流动相B的梯度洗脱比例为：0min时，流动相B的比例为23％；30min时，流动相B的比例为30％；40min时，流动相B的比例为40％；50min时，流动相B的比例为40％；51min时，流动相B的比例为23％；58min时，流动相B的比例为23％；
所述杆菌肽组分包括主要组分、其他组分和有关物质；其中，所述主要组分为杆菌肽A，所述其他组分包括杆菌肽B、杆菌肽C、杆菌肽E、杆菌肽F、杆菌肽H、杆菌肽I中的至少一种，所述有关物质包括杆菌肽的氧化产物、差向异构化产物、水解产物、硫酸化产物中的至少一种；其中，所述杆菌肽B包括杆菌肽B1、杆菌肽B2、杆菌肽B3，所述杆菌肽C包括杆菌肽C1、杆菌肽C2、杆菌肽C3，所述杆菌肽H包括杆菌肽H1、杆菌肽H2、杆菌肽H3，所述杆菌肽I包括杆菌肽I1、杆菌肽I2、杆菌肽I3。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述杆菌肽样品包括杆菌肽原料药、注射剂及软膏剂；所述杆菌肽锌样品包括杆菌肽锌原料药、注射剂及软膏剂。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，用于溶解所述杆菌肽样品的溶剂包括水、乙腈、甲醇、异丙醇或其混合溶剂；用于溶解所述杆菌肽锌样品的溶剂包括含有乙二胺四乙酸二钠的水溶液、乙腈、甲醇、异丙醇或其混合溶剂；所述杆菌肽样品或杆菌肽锌样品溶解后的终浓度为0.1-20mg/mL。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述反相色谱柱的填料为十八烷基键合的硅胶基质、八烷基键合的硅胶基质或四烷基键合的硅胶基质，色谱柱柱长5-30cm，直径1-10mm，填料粒径1-10μm。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，经过所述反相色谱柱的流速为0.5-1.5ml/min；进样体积为1-100μl；色谱柱柱温为20-40℃。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述分析测定采用的检测器选自紫外检测器、二极管阵列检测器或者质谱检测器。
7.根据权利要求6所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述紫外检测器、二极管阵列检测器的检测波长为180-380nm。
CN201811467424.3A 2018-12-03 2018-12-03 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法 Active CN109444318B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811467424.3A CN109444318B (zh) 2018-12-03 2018-12-03 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811467424.3A CN109444318B (zh) 2018-12-03 2018-12-03 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109444318A CN109444318A (zh) 2019-03-08
CN109444318B true CN109444318B (zh) 2021-04-27

Family

ID=65555466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811467424.3A Active CN109444318B (zh) 2018-12-03 2018-12-03 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109444318B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111678996A (zh) * 2020-04-26 2020-09-18 上海市食品药品检验所 杆菌肽氧化组分及其分析方法和双键磺酸化半胱氨酸氧化组分的碎裂模式
CN114577924B (zh) * 2021-12-24 2024-05-07 齐鲁制药（内蒙古）有限公司 一种同时检测鸡蛋中杆菌肽a和杆菌肽b残留量的方法
CN114755334B (zh) * 2022-04-09 2024-07-30 宁波市农业科学研究院 一种能同时测定猪组织中杆菌肽b2、b3含量的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2774590A1 (en) * 2009-10-28 2011-05-05 Xellia Pharmaceuticals Aps New bacitracin antibiotics
CN102236005B (zh) * 2011-04-18 2014-06-18 林维宣 一种动物源食品中多种多肽类兽药残留量的检测方法
CN107904198B (zh) * 2017-11-14 2020-09-15 南京农业大学 一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109444318A (zh) 2019-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lu et al. Detection of ractopamine residues in pork by surface plasmon resonance-based biosensor inhibition immunoassay
CN109444318B (zh) 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法
Suntornsuk Recent advances of capillary electrophoresis in pharmaceutical analysis
JP2023162207A (ja) 標識化グリコシルアミンの迅速調製およびそれを生成するグリコシル化生体分子の分析方法
Li et al. Ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the determination of epirubicin in human plasma
Lu et al. Multi-walled carbon nanotubes as solid-phase extraction adsorbent for the ultra-fast determination of chloramphenicol in egg, honey, and milk by fused-core C18-based high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Liu et al. Automated on-line liquid chromatography–photodiode array–mass spectrometry method with dilution line for the determination of bisphenol A and 4-octylphenol in serum
CN105548412A (zh) 一种同时测定食品中5种氨基糖苷类药物残留量的方法
CN103713078A (zh) 一种蜂蜜中氨基酸的测定方法
CN111157641B (zh) 一种hplc-ms-ms法测定人血浆中卡马西平成分含量的方法
CN102788852A (zh) 一种液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法
CN110320290A (zh) 甲钴胺注射液有关物质的hplc检测方法
Gupta Drug level monitoring: antidepressants
Xin et al. Simple and fast determination of tetrodotoxin in human plasma based on hydrophilic-interaction/ion-exchange mixed-mode solid phase extraction combined with liquid chromatography-tandem mass spectroscopy
CN112858498A (zh) 一种弹性体密封件中14种n-亚硝胺的测定方法及应用
CN102033111A (zh) 反相高效液相色谱法分离多黏菌素e甲磺酸钠及其类似物
Šatínský et al. On-line coupling of sequential injection extraction with restricted-access materials and post-column derivatization for sample clean-up and determination of propranolol in human plasma
CN108872405B (zh) 一种洛度沙胺氨丁三醇有关物质的hplc分析检测方法
CN113984928A (zh) 一种2-苯甲酰基吡咯有关物质的高效液相色谱分析方法
Wang et al. Separation and structural characterization of unknown impurity in vancomycin by two-dimensional preparative liquid chromatography, LC-MS and NMR
CN103175930A (zh) 一种测定亚硫酸钠含量的高效液相色谱分析方法
CN109358140B (zh) 一种利福昔明原料及其制剂组分的检测方法
CN112067709A (zh) 注射用头孢地嗪钠有关物质的测定方法及应用
CN114113416B (zh) 一种液相色谱法测定废水中兽药氯前列烯醇的方法
CN117347519B (zh) 检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 200120 No. 1500 Zhangheng Road, Pudong New Area, Shanghai

Applicant after: Shanghai Institute for food and drug control

Address before: 200120 No. 1500 Zhangheng Road, Pudong New Area, Shanghai

Applicant before: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant