CN105548412A - 一种同时测定食品中5种氨基糖苷类药物残留量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测食品中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、新霉素残留量的测定方法，包括如下步骤：（1）提取；（2）净化；（3）配制基质标准工作溶液；（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定。本发明具有操作简便、准确、灵敏度高及重复性好的优点。完全能满足我国和欧盟、美国、日本对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种可同时检测多种氨基糖苷类抗生素残留量的测定技术方法，具体地说是链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素5种氨基糖苷类药物残留量测定方法，属于色谱检测技术领域。
背景技术
氨基糖苷类抗生素(aminoglycosideantibiotics,AGs)是由氨基糖与氨基环醇形成的苷。自1944年Waksman等发现链霉菌产生链霉素以来，氨基糖苷类抗生素的研究与开发已经过了半个多世纪。由于该类药物具有性质稳定、抗菌谱广、杀菌力强、水溶性好，排泄迅速完全，对许多致病菌有抗生素后效应，目前在临床上仍然是重要的抗感染药，广泛用于各种革兰阴性菌感染和结核病的治疗。但是，由于AGs药物具有耳毒性和肾毒性等毒副作用，且极易产生耐药性，欧盟明确规定禁止将AGs药物作为畜禽促生长添加剂使用；美国及我国对动物源性食品中该类药物的残留监控都极为关注。
目前，AGs的检测方法主要有酶联免疫法、液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法。酶联免疫法作为AGs的筛查方法，有着快速、高效、高通量等仪器方法不可比拟的优势。AGs抗生素结构中不含共轭双键，缺少发色基团，但结构中含有较多的活性或极性基团可供设计衍生化检测方法或分离方法。采用液相色谱法检测AGs，一般需要柱前或柱后衍生化，荧光检测器检测。另外，由于该类化合物易溶于水，极性强，在C18柱上保留很弱，通常需要在流动相中加入改性剂，增加目标物在柱子上的保留。目前，使用最多的是通过加入离子对试剂来增强保留。绝大多数的液相色谱-串联质谱检测AGs的方法中，也都采用离子对试剂增加化合物的保留和响应。但离子对试剂在质谱检测中有离子抑制作用，一旦使用了离子对试剂，很难冲洗干净，严重干扰仪器对其他化合物的检测。
在以上AGs的几种检测方法中，酶联免疫法由于简单快速的优势，作为定性筛查方法应用较为普遍；液相色谱法和气相色谱-质谱法前处理都需要衍生化，操作复杂，灵敏度也很难达到要求，应用越来越少；液相色谱-串联质谱法相对而言，灵敏度更高，选择性更强，而且不需要衍生化，但由于离子对试剂的加入，对其他化合物的干扰问题嗜待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以同时测定食品中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素5种氨基糖苷类药物残留量的测定方法，以弥补现有技术的不足。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种仪器分析方法，以解决现有方法中由于离子对试剂的加入，对其他化合物检测的干扰问题。
本发明的测定首先是对样品的前处理的补充和改进。目前的文献报道及相关检测标准中，氨基糖苷类抗生素的提取基本都采用磷酸溶液或磷酸盐缓冲液提取，三氯乙酸除蛋白，采用离子交换型固相萃取小柱净化。但是由于离子交换型固相萃取小柱较难平衡，操作有一定难度，容易造成方法重现性差、检测结果准确度不高的问题。本发明采用在磷酸盐缓冲提取液中加入离子对试剂的方法，使得氨基糖苷类化合物与离子对试剂轭合，极性降低，然后直接采用C18柱净化，大大降低了前处理的操作难度，提高了方法的重现性和准确性。
本发明的测定通过采用一种集传统反相色谱柱的作用和离子交换功能于一体的混合色谱柱，使得色谱体系采用与质谱兼容更好的流动相体系，而不需要采用离子对试剂，就可以很好的分离氨基糖苷类药物，而且峰形良好、灵敏度良好。
本发明的测定方法包括如下步骤：
(1)提取
称取打碎后的样品至离心管中，加入提取液，均质、混匀、离心，上清液转移至另一新的离心管中，在提取液中加入正已烷，蜗旋振荡混匀，离心，弃去上层液体，取下层提取液过柱净化。
(2)净化
提取液加贮液器中通过预处理过的SPE柱，待液体完全流出后，用水淋洗小柱，弃去所有流出液，正压吹干，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液至氮吹管，50℃水浴氮气吹干，1.0ml流动相蜗旋溶解，过0.22μm滤膜至进样小瓶，供高效液相色谱－串联质谱仪测定。
(3)配制基质标准工作溶液
将空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，用该空白样品基质溶液在50～1000μg/L范围内，配制至少五个浓度的氨基糖苷系列基质标准工作溶液；
(4)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定
质谱检测使用多反应监测扫描模式，链霉素的母离子582.4，子离子分别为263.3和407.4，双氢链霉素的母离子584.3，子离子分别为263.3和409.3，卡那霉素的母离子485.3，子离子分别为163.2和324.2；壮观霉素的母离子333.3，子离子分别为140.2和189.2；庆大霉素的母离子478.4，子离子分别为205.2和160.2。
a)定量测定：将步骤(3)中系列基质标准工作液进行LC-MS/MS测定，以基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中氨基糖苷类化合物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氨基糖苷类药物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氨基糖苷类药物残留量；
b)定性测定：检测步骤(2)中样品液中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质标准溶液的相对丰度偏差满足欧盟657指令的要求时，则判断该样品中存在该种目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物。
上述步骤(1)中提取液为10mL磷酸盐缓冲液(PH＝2.0，含50mM庚烷磺酸钠、25mM磷酸三钠，用磷酸调PH值至2.0)。
上述步骤(1)中正己烷体积为10mL。
上述步骤(2)中固相萃取小柱为C18。
上述步骤(2)中样品通过SPE时流速要≤3ml/min。
上述步骤(2)中SPE小柱用5ml甲醇、5ml水预处理。
上述步骤(2)甲醇洗脱体积为5mL。
上述步骤(4)中液相色谱的流动相为A：乙腈，流动相B：1％甲酸水溶液(含10mM甲酸铵)，流速0.5mL/min，进样量10μL。
上述步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 70 | 30 |
| 3.0 | 10 | 90 |
| 6.0 | 10 | 90 |
| 6.1 | 5 | 95 |
| 7.0 | 5 | 95 |
| 9.0 | 70 | 30 |
| 20.0 | 70 | 30 |
A和B的％是体积比例。
上述步骤(4)中液相色谱的色谱柱为ObeliscR，该色谱柱具有传统反相色谱柱功能及离子交换功能。柱温为30℃。
上述步骤(4)中质谱检测使用电喷雾质谱检测，离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多重反应监测(MRM)；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：0.344MPa；气帘气压力：0.172MPa；辅助气流速：0.413MPa；离子源温度：550℃。
上述步骤(1)和(2)中的涡旋振荡时间1min。
上述步骤(1)～(4)中样品接触到的包括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。
本发明的有益效果在于：
本发明采用具有传统反相柱和离子吸附两种作用的色谱柱，建立了一种不需要在流动相中加入离子对试剂的液相色谱-串联质谱方法，有效解决了离子对试剂在质谱检测中对其他化合物的影响，同时通过优化前处理方法，解决了AGs化合物由于极性大、易吸附造成的回收率低的难题。
本发明能有效降低食品中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素残留检测中的基质干扰，采用优化的前处理方法和色谱条件，结合串联质谱检测器应用于食品中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素定性确证和定量检测，平均回收率63.5％～76.4％，相对标准偏差(RSD)为7.9％～13.5％，定量限为50μg/kg。
本发明具有操作简便、准确、灵敏度高及重复性好的优点。完全能满足我国和欧盟、美国、日本对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
附图说明
图1为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的链霉素多反应监测色谱图。
图2为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的双氢链霉素多反应监测色谱图。
图3为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的卡那霉素多反应监测色谱图。
图4为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的壮观霉素多反应监测色谱图。
图5为以鱼为基质，浓度为50.0ng/mL的庆大霉素多反应监测色谱图。
具体实施方式
现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。
实施例中使用的仪器与试剂如下：
CR21GⅢ型高速冷冻离心机(Hitachi，Japan)；MS3型旋涡混合器(IKA，Germany)；1290快速高效液相色谱(Agilent，USA)-5500三重四极杆质谱仪(ABSciense，USA)；C18固相萃取柱(J.T.Baker，USA)。
试剂：甲醇、乙腈(HPLC级，Merke，Germany)；甲酸铵(HPLC级，CNW，Germany)；庚烷磺酸钠、磷酸、磷酸三钠(分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司)。
标准物质：链霉素，纯度大于96％；双氢链霉素，纯度大于99％；卡那霉素，纯度大于94.5％；壮观霉素，纯度大于95.5％；庆大霉素，纯度大于90％。以上标准品均购自美国Dr.公司。
实施例1：鱼肉中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素残留量的检测
(1)样品前处理
提取：
打碎后的样品称3g至50ml离心管中，加入10ml提取液，均质、混匀、离心，上清液转移至另一新的50ml离心管中，在提取液中加入10ml正已烷，振荡混匀15min，离心，弃去上层液体，取下层提取液10ml过柱净化。
净化：
SPE柱净化，提前用5ml甲醇、5ml水预柱，10ml提取液加贮液器中以小于等于3ml/min的流速通过C18柱，待液体完全流出后，用5ml水淋洗小柱，弃去所有流出液，正压吹干，最后用3ml甲醇洗脱，收集洗脱液至10ml氮吹管，50℃水浴氮气吹干，1.0ml流动相定溶过0.22μm滤膜至进样小瓶，供高效液相色谱－串联质谱仪测定。
(2)标准工作溶液的配制
称取标准品10±0.01mg于10mL塑料容量瓶中，用纯水溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素标准储备液各1.0mL置于100mL塑料容量瓶中，用纯水定容得到10.0μg/mL混合标准中间液；
用经检测不含链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素的鱼肉作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将混合标准中间液用空白基质溶液稀释配制成50、100、200、500、1000ng/mL系列基质标准工作溶液，待分析。
(3)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定
将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中目标物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中目标物残留量。
色谱条件：
色谱柱：ObeliSCR2.1×150mm，5μmLot:S02-002C；流动相：(A)乙腈；(B)1％甲酸水溶液(含10mM甲酸铵)；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；梯度洗脱程序如表1。
表1：实施例1的梯度洗脱程序
质谱参数：
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多重反应监测(MRM)；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：0.344MPa；气帘气压力：0.172MPa；辅助气流速：0.413MPa；离子源温度：550℃；
MRM检测参数见表2。
表2：实施例1的MRM检测参数
*为定量离子对。
定性鉴定：对于氨基糖苷类药物的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液中保留时间一致(变化范围在±2.5％之内)；样品中目标物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质相同的标准溶液中相对丰度偏差满足欧盟657指令有关要求(见表3)时，则判断该样品中存在该氨基糖苷类药物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该氨基糖苷类抗生素。
表3定性离子相对丰度的最大允许偏差
以基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表4。
表4鱼肉基质中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素标准工作曲线
| 名称 | 保留时间(min) | 回归方程 | 相关系数 |
| 链霉素 | 4.06 | Y＝345X+997 | 0.9993 |
| 双氢链霉素 | 4.11 | Y＝803X+386 | 0.9996 |
| 卡那霉素 | 4.82 | Y＝858X+4.19e+003 | 0.9912 |
| 壮观霉素 | 3.37 | Y＝1.15e+003X+4.51e+003 | 0.9961 |
| 庆大霉素 | 5.48 | Y＝747X+39.6 | 0.9927 |
加标回收率和重复性：
选取鱼肉、虾、鸡肉空白样品中，分别添加0.05、0.10、0.50mg/kg浓度水平的链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素标准溶液，按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与氨基糖苷类药物理论添加浓度进行比较，得到添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差。五种化合物的平均回收率63.5％～76.4％，相对标准偏差(RSD)为7.9％～13.5％。
本发明以大于3倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为检出限(LOD)，以大于10倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为定量限(LOQ)，链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素的检出限均为20μg/kg。链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素的定量限均为50μg/kg。
以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种同时测定食品中5种氨基糖苷类药物残留量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取
称取打碎后的样品至离心管中，加入提取液，均质、混匀、离心，上清液转移至另一新的离心管中，在提取液中加入正已烷，蜗旋振荡混匀，离心，弃去上层液体，取下层提取液过柱净化；
(2)净化
提取液加贮液器中通过预处理过的SPE柱，待液体完全流出后，用水淋洗SPE柱，弃去所有流出液，正压吹干，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液至氮吹管，50℃水浴氮气吹干，用1.0ml初始流动相蜗旋溶解，过0.22μm滤膜至进样小瓶，供高效液相色谱－串联质谱仪测定；
(3)配制基质标准工作溶液
将空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，用该空白样品基质溶液在50～1000μg/L范围内，配制至少五个浓度的氨基糖苷系列基质标准工作溶液；
(4)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定
质谱检测使用多反应监测扫描模式，链霉素的母离子582.4，子离子分别为263.3和407.4，双氢链霉素的母离子584.3，子离子分别为263.3和409.3，卡那霉素的母离子485.3，子离子分别为163.2和324.2；壮观霉素的母离子333.3，子离子分别为140.2和189.2；庆大霉素的母离子478.4，子离子分别为205.2和160.2；
a)定量测定：将步骤(3)中系列基质标准工作液进行LC-MS/MS测定，以基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中氨基糖苷类化合物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氨基糖苷类药物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氨基糖苷类药物残留量；
b)定性测定：检测步骤(2)中样品液中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质标准溶液的相对丰度偏差满足欧盟657指令的要求时，则判断该样品中存在该种目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物；
所述的5种氨基糖苷类药物是链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(1)和(2)中提取液为磷酸盐缓冲液，pH＝2.0，含50mM庚烷磺酸钠、25mM磷酸三钠，用磷酸调PH值至2.0。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(2)中SPE柱为BAKERBONDspeOctaecylC18。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(2)中样品通过SPE柱时流速为≤3mL/min。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(2)中SPE柱用5mL甲醇、5ml水预处理。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(2)甲醇洗脱体积为5mL。
7.如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤(4)中液相色谱的流动相的设置为
A：乙腈，B：含10mM甲酸铵的体积分数是1％的甲酸水溶液，流速0.5mL/min，进样量10μL；
其中步骤(4)中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：
A和B的％是体积比例。
8.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤(4)中液相色谱的色谱柱为ObeliscR，柱温为30℃。
9.如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤(4)中质谱检测使用电喷雾质谱检测，离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多重反应监测(MRM)；电喷雾电压：5500V；雾化气压力：0.344MPa；气帘气压力：0.172MPa；辅助气流速：0.413MPa；离子源温度：550℃。
10.如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤(1)和(2)中的涡旋振荡时间1min；上述步骤(1)～(4)中样品接触到的容器为塑料材质。
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