CN106053638B - 一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法，具体涉及一种基于HILIC色谱柱串联三重四级杆质谱，检测动物源食品中氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法。其特征在于：样品经过提取、固相萃取、经ZIC‑HILIC色谱柱分离后，由三重四级杆质谱测定。所检测的新霉素、大观霉素、双氢链霉素、链霉素、庆大霉素的浓度在10ug/kg‑500ug/kg范围内线性关系良好，20μg/kg浓度下响应值良好S/N＞10，样品真度无明显基质效应，样品中浓度检出限可降低至100ug/kg，与现有技术相比，本发明所述方法，具有样品前期处理时间短成本低、方法简便、基质覆盖全面、准确度高等特点。

Description

一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法，具体涉及一种利用ZIC-HILIC色谱柱串联三重四极杆质谱，检测6种氨基糖苷类抗生素在动物源食品中残留量的检测方法。
背景技术
氨基糖苷类抗生素 (Aminoglyeosides)，是一种由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素药物。对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果，可以有效抑制细菌的生长和繁殖，也常被添加在饲料中促进动物生长发育，是目前我国畜牧业中常用兽药。该类药物具有耳毒性和肾毒性等毒副作用，人类长期食用残留超标的畜产品将直接造成伤害。
为了保障食品安全，2002年我国农业部在 《动物组织中兽药残留最高限量》 中规定庆大霉素、壮观霉素、链霉素、二氢链霉素和潮霉素在动物肌肉中的最高残留限量分别为100、500、600、600 μg/kg及不得检出，安普霉素在猪肾脏中的最高残留限量为100μg/kg。
氨基糖苷类抗生素是一类强极性的碱性化合物，目前这类抗生素痕量残留的同时检测通常采用反相离子对色谱-串联质谱法。但是所用的离子对试剂七氟丁酸会造成离子抑制，污染质谱。另外，目前关于氨基糖苷类抗生素的样品检测方法，不仅检测时间长，而且样品检测前处理步骤复杂，对检测人员的技术性要求过高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中采用反向离子色谱，其使用的离子对试剂七氟丁酸会造成离子抑制，污染质谱的问题及现有检测技术前期样品处理时间长，步骤繁琐的技术问题。
本发明所要实现的技术目的是提供一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法，通过ZIC-HILIC色谱柱串联三重四极杆质谱的方法进行快速、简便、高灵敏度的定量检测。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：
一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）样品前处理：
称取试料（2.5±0.02）g，于50 mL离心管中，加入20 mL提取液（10 mM乙酸铵+0.4mM EDTA+1%氯化钠+5%三氯乙酸），涡旋混合30 s，振荡混合10 min，4000 r/min离心5 min，上清液用20%的氢氧化钠或1 M的盐酸水溶液调pH至6.5。
（二）固相萃取：
固相萃取SPE柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取上述步骤中的上清液过柱处理，用5mL水淋洗，抽干，加0.5M甲酸铵（pH=3）5 mL洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22 μm滤膜过滤，即为待测样品。
（三）ZIC-HILIC色谱柱-三重四极杆质谱检测：
三重四级杆质谱检测参数为：
离子源：ESI源，雾化气流速：3L/min，加热气流速：10L/min，离子源温度：300℃，DL管温度：250℃，加热模块温度：400℃，干燥气流量：10L/min。
基于ZIC-HILIC色谱柱的检测参数为：
色谱柱：ZIC-HILIC，规格为3.5μm 150*4.6mm；流动相A：175 mmol/L甲酸铵（pH=4.5）；流动相B：含有0.3%甲酸的乙腈；流速：0.55 mL/min；进样体积：20 μL；柱温箱温度：45℃；洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为B相60%；清洗液：80%乙腈水溶液：
所述洗脱中梯度时间程序如表1所示：
表1：洗脱梯度时间程序表
（四）通过绘制标准曲线，及测算，得出样品中氨基糖苷类抗生素的含量。
所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素、安普霉素、新霉素、链霉素、双氢链霉素、大观霉素。
所述6种氨基糖苷类抗生素选用乙腈+水（1+1）作为稀释溶剂，浓度点依次为10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、500μg/kg，得出线性关系良好，R2>0.99，六种化合物20μg/kg响应值良好S/N＞10。
具体如表2所示：
表2：六种氨基糖苷类抗生素标准品的线性关系
根据样品在色谱和质谱条件下测定，记录峰值面积，绘制峰面积-浓度标准曲线，根据样品添加回收试验的结果，计算得出上述6种氨基糖苷类抗生素的检出限为100ug/kg，满足样品检出限的需要。
本发明实现的有益效果：
与现有技术相比，本发明所述的一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法，通过ZIC-HILIC色谱柱串联三重四极杆质谱的方法进行检测，具有检测方法简单、准确度高、前期样品处理简单，避免了七氟丁酸会造成离子抑制，污染质谱的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容进行进一步阐述，实施例只起到解释说明作用，并不能限定本发明的范围，一般技术人员对本发明内容做出的一般性改动，只要未超出本发明所述范围，都将等价落在本发明权利要求书所限定的范围内。
实施例
1、实验仪器与试剂如下：
试剂：甲酸铵，乙酸铵，乙二胺四乙酸二钠，氯化钠，三氯乙酸，氢氧化钠，盐酸，Cleanert PWCX 固相萃取SPE柱。
仪器：岛津LC-MSMS 8050色谱-质谱仪，湘仪L550离心机，EYEL 4 分液漏斗振荡器。
2、试验方案如下：
用庆大霉素、安普霉素、新霉素、链霉素、双氢链霉素、大观霉素标准品制定标准曲线，并根据标准品确定色谱-质谱的最佳条件。
选用空白鸭肝进行真度检测试验、选用空白鸭肉进行样品添加回收试验，得出检测下限。
3、试验方法如下：
（一）样品前处理：
称取试料（2.5±0.02）g，于50 mL离心管中，加入20 mL提取液（10 mM乙酸铵+0.4mM EDTA+1%氯化钠+5%三氯乙酸），涡旋混合30 s，振荡混合10 min，4000 r/min离心5 min，上清液用20%的氢氧化钠或1 M的盐酸水溶液调pH至6.5。
（二）固相萃取：
固相萃取SPE柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取上述步骤中的上清液过柱处理，用5mL水淋洗，抽干，加0.5M甲酸铵（pH=3）5 mL洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22 μm滤膜过滤，即为待测样品。
（三）ZIC-HILIC色谱柱-三重四极杆质谱检测：
三重四级杆质谱检测参数为：
离子源：ESI源，雾化气流速：3L/min，加热气流速：10L/min，离子源温度：300℃，DL管温度：250℃，加热模块温度：400℃，干燥气流量：10L/min。
基于ZIC-HILIC色谱柱的检测参数为：
色谱柱：ZIC-HILIC，规格为3.5μm 150*4.6mm；流动相A：175 mmol/L甲酸铵（pH=4.5）；流动相B：含有0.3%甲酸的乙腈；流速：0.55 mL/min；进样体积：20 μL；柱温箱温度：45℃；洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为B相60%；清洗液：80%乙腈水溶液。
（四）通过绘制标准曲线，及测算，得出样品中氨基糖苷类抗生素的含量。
4、结果分析
4.1标准物质线性及稳定性
乙腈+水（1+1）作为稀释溶剂，稀释6种氨基糖苷类抗生素药物（庆大霉素、安普霉素、新霉素、链霉素、双氢链霉素、大观霉素）混标，浓度点依次为10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、500μg/kg，并进行仪器分析。
得出上述6种抗生素的线性关系如表2所示，线性关系良好，经液相色谱-质谱检测，所述6种化合物标准品在20ug/kg值时的响应值良好，S/N>10,稳定性良好。
4.2真度及选择性
选择空白鸭肝样品进行前处理，分别进行空白提取液稀释标准品及溶剂稀释标准品分析实验，真度A=提取液稀释标准品峰面积A1/溶剂稀释标准品A2 *100%,以此作为简单实验参数量化机制效应。
真度A值：A＜100%，基质抑制效应； A≈100%，无明基质制效应； A＞100%，基质增强效应，6种抗生素的检测结果多为无明显基质效应，如表3所示：
表3：六种氨基糖苷类抗生素基质效应检测结果
4.3添加回收稳定性试验：
鸭肉空白样品进行样品添加回收试验，萃取液中浓度为50ug/kg、100ug/kg、500ug/kg, 得出结果如表4、表5、表6所示：
表4：萃取液中浓度50ug/kg的添加回收试验结果
表5：萃取液中浓度100ug/kg的添加回收试验结果
表6：萃取液中浓度500ug/kg的添加回收试验结果
由上述数据可以看出，空白鸭肉在添加回收中浓度为50ug/kg样品时，6种抗生素的添加回收率多数较高，稳定性RSD落在3.8至6.7区间内，稳定值良好。
综合上述试验结果，得出上述6种抗生素的检测下限为100ug/kg。

Claims (1)

1.一种动物源食品中氨基糖苷类抗生素残留量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)样品前处理称取试料2.5±0.02g，于50mL离心管中，加入20mL提取液，提取液浓度为10mM乙酸铵+0.4mMEDTA+1％氯化钠+5％三氯乙酸，涡旋混合30s，振荡混合10min，4000r/min离心5min，上清液用20％的氢氧化钠或1M的盐酸水溶液调pH至6.5；
(二)固相萃取
固相萃取SPE柱依次用甲醇5mL和水5mL活化，取上述步骤中的上清液过柱处理，用5mL水淋洗，抽干，加0.5M甲酸铵5mL洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品；0.5M甲酸铵的pH＝3；
(三)ZIC-HILIC色谱柱-三重四极杆质谱检测
三重四级杆质谱检测参数为：
离子源：ESI源，雾化气流速：3L/min，加热气流速：10L/min，离子源温度：300℃，DL管温度：250℃，加热模块温度：400℃，干燥气流量：10L/min；
基于ZIC-HILIC色谱柱的检测参数为：
色谱柱：ZIC-HILIC，规格为150mm×4.6mm×3.5μm；流动相A：175mmol/L甲酸铵，pH＝4.5；
流动相B：含有0.3％甲酸的乙腈；流速：0.55mL/min；进样体积：20μL；柱温箱温度：45℃；洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为B相60％，10min为B相15％，20min为B相15％，20.1min为B相60％，30min洗脱结束；清洗液：80％乙腈水溶液；
(四)通过绘制标准曲线及测算，得出样品中氨基糖苷类抗生素的含量。
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