CN115452974B - 饲料中大观霉素的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定饲料中大观霉素的方法。试样中大观霉素用2%三氯乙酸水溶液（含0.4%乙二胺四乙酸二钠）提取，提取液经调节pH值至4.7±0.2，由混合型阳离子固相小柱净化，采用HILIC色谱柱分离，液相色谱质谱‑质谱联用法测定，基质匹配外标法定量。结果表明：本发明建立的固相萃取‑超高效液相色谱‑串联质谱法对饲料中大观霉素检出限为1.0 mg/kg，定量限为2.0 mg/kg。不同饲料基质中大观霉素浓度在0.1~10.0μg/mL范围内线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.99。大观霉素的回收率为91.3%~104.2%，相对标准偏差（RSD）为1.5%~9.4%。本发明建立的固相萃取‑超高效液相色谱‑串联质谱法灵敏、可靠，可应用于饲料中大观霉素的准确测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种饲料中大观霉素的测定方法。
背景技术
大观霉素曾被广泛用于治疗家禽、猪的细菌和寄生虫感染，或作为生长促进剂。硫酸大观霉素与盐酸林可霉素的预混剂被用于预防猪赤痢、沙门氏病菌、大肠菌肠炎及支原体肺炎。考虑到饲用抗生素的不合理及违法使用带来的抗生素在食物中残留、细菌耐药性以及环境污染等系列问题，从源头掌握动物食品安全状况也越来越需要灵敏、可靠的分析方法作为饲料和食品检验的保障。
大观霉素（化学结构见图1），属于氨基糖苷类化合物，结构上由氨基糖与氨基环醇组成。大观霉素具有热稳定性和非挥发性，使用GC或GC-MS分析需要较长时间的衍生化反应；其结构上没有发色光团和荧光光团，使用液相色谱分析通常需要柱前或柱后衍生，然后用紫外或荧光检测。上述方法均会因衍生效率或衍生物的稳定性低而导致方法的精密度较差。脉冲安培计、蒸发光散射和化学发光检测无需任何衍生，可以直接检测氨基糖苷类化合物，但不能进行确证，同时灵敏度也不够。
液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）因其高选择性和准确性在饲料质量控制中占有突出地位，然而氨基糖苷类化合物极性大的特性又限制了其在常规反相色谱-质谱联用上的应用。离子对液相色谱法采用添加离子对试剂的方法延长了极性目标物在反相色谱柱上的保留，但是离子对试剂的使用会严重抑制质谱仪的电喷雾离子化效果，大幅度降低仪器灵敏度。作为离子对液相色谱法的替代，亲水相互作用液相色谱法（HILIC）在分析过程中对极性目标物具有较强的保留，并且HILIC流动相中高比例的有机相在电喷雾电离（ESI）过程中快速反应蒸发，相对于离子对液相色谱，HILIC与ESI联用可以获得更高的灵敏度。已有文献报道采用HILIC分离大观霉素等氨基糖苷类化合物 [STYPULKOWSKA K， BLAZEWICZ A，BRUDZIKOWSKA A， et al. Development of high performance liquid chromatographymethods with charged aerosol detection for the determination of lincomycin，spectinomycin and its impurities in pharmaceutical products[J]. Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis， 2015，112:8-14. ]。
来自样品中的基质效应往往限制了LC-MS/MS方法的重现性和准确度。在去除样品基质的前处理方法中，固相萃取（SPE）相对于在流动相加入改进剂，稀释，稳定同位素标记的内标物等方面普遍被认为更易于实现。各种性能的离子型SPE小柱和亲水亲脂型（HLB）SPE小柱常常用于去除样品中的基质。氨基糖苷类化合物的净化涉及离子交换机制，通常采用阳离子交换小柱，其填料的性质对加载的提取液pH值有较为严格的要求，因此采用SPE小柱净化提取液时，往往需要调节上样溶液的pH值，而使得氨基糖苷类化合物在SPE小柱上得以保留。关于饲料中大观霉素的测定，我国现行标准《饲料中大观霉素的测定》（农业部2086号公告-7-2014）提供了两种分析方法：高效液相色谱-蒸发光散射检测法和液相色谱-质谱联用法。其中，高效液相色谱-蒸发光散射检测法不能满足确证需要，且只适用于配合饲料中大观霉素的检测，而液相色谱-质谱联用法前处理和液相方法也不能满足稳定和准确检测的需要。到目前为止，还没有针对饲料样品中大观霉素测定的系统解决方案。
总之，定量分析氨基糖苷类化合物，需要克服提取、净化、分离和检测等方面的困难。
发明内容
鉴于此，针对饲料中大观霉素测定方法的缺乏以及对饲料中抗生素监管的需要，本发明首次提供了一种饲料中林可霉素的测定方法，方法稳定性好、准确度高。
一种饲料中大观霉素的测定方法，向待测饲料中加入质量分数为2%三氯乙酸水溶液，含0.4%乙二胺四乙酸二钠，对大观霉素进行提取，提取液经调节pH值至4.7±0.2，采用混合型阳离子MCX固相小柱净化，采用HILIC色谱柱分离，流动相A：0.01 mol/L甲酸铵水溶液和B：0.01 mol/L甲酸铵乙腈-水溶液，梯度洗脱，以电喷雾离子源正离子扫描方式，在多反应监测模式下进行测定，基质匹配外标法定量；
所述的流动相A为0.01 mol/L甲酸铵水溶液，含0.4%甲酸，称取0.63 g甲酸铵，用100 mL水溶解，再加入4 mL甲酸，用水定容至1 000 mL，混匀；
所述的流动相B为0.01 mol/L甲酸铵乙腈-水溶液，含0.4%甲酸，称取0.63 g甲酸铵，用100 mL水溶解，再加入4 mL甲酸，用乙腈定容至1 000 mL，混匀。
所述的方法，步骤如下：
称取待测饲料2.5 g，置于50 mL塑料离心管中，加入23 mL 2% TCA溶液，再加入2mL 5% EDTA-2Na溶液，常温水浴超声20 min，于8 000 r/min离心5 min，转移上清液至另一只50 mL离心管中；将沉淀重复提取一次并离心，合并两次上清液，混匀；准确移取3 mL提取液至10 mL塑料离心管中，用10%氨水溶液准确调节pH至4.7±0.2后，于8 000 r/min离心5min，制得样品备用液；依次用3 mL甲醇和3 mL水活化MCX固相萃取小柱，将样品备用液全部上样，分别用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽干；用3 mL 10% 氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，准确加入3 mL样品溶解液，其中流动相A和B各50%，复溶，过0.22 μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS检测，基质匹配外标法定量；
所述的2%三氯乙酸水溶液为三氯乙酸2 mL，加水稀释至100 mL；
所述的5%EDTA-2Na溶液为EDTA-2Na 5 g，加水溶解并稀释至100 mL；
所述的10%氨水溶液为氨水10 mL，加水稀释至100 mL；
所述的10%氨水甲醇溶液为氨水10 mL，加甲醇稀释至100 mL。
所述的方法，调节提取液pH至4.7±0.2，步骤如下：
准确移取3 mL提取液至10 mL塑料离心管中，用10%氨水溶液准确调节pH至4.7±0.2。
所述的基质匹配外标法定量，步骤如下：
称取各空白饲料样品8份，每份2.5 g，置于50 mL离心管中，再向其中加入一系列标准溶液，静置过夜。按样品试验步骤进行提取、调节pH值、净化等处理，形成理论添加浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL的标准溶液，上机测试，以浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制基质匹配标准工作曲线，对样品中的大观霉素进行定量。
本发明首次建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中大观霉素的方法。该方法灵敏度高、可靠性强。
结果表明：本发明建立的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法对饲料中大观霉素检出限为1.0 mg/kg，定量限为2.0 mg/kg。不同饲料基质中大观霉素浓度在0.1~10.0μg/mL范围内线性关系良好，相关系数（R 2）均大于0.99。在4个浓度水平（2.0、20.0、200和1000 mg/kg）下进行添加试验，大观霉素的回收率为91.3%~104.2%，相对标准偏差（RSD）为1.5%~9.4%。
附图说明
图1是大观霉素的化学结构图。
图2是大观霉素的标准溶液MRM色谱图（1.0 μg/mL）。
图3是大观霉素在不同流动相体系中总离子流图（5.0 μg/mL）。
图4是大观霉素水合物结构。
图5是大观霉素子离子质谱图（5.0 μg/mL）。
图6是大观霉素可能质谱裂解途径。
图7是不同浓度的TCA对不同种类饲料中大观霉素回收率比较；
其中，JPH: 鸡配合，JYH: 鸡预混合，JNS: 鸡浓缩，ZPH: 猪配合，ZYH: 猪预混合，NN: 奶牛精料补充料，200 mg/kg 添加。
图8是不同浓度的TCA（含0.6%EDTA-2Na）对饲料中大观霉素回收率影响；
其中，JYH: 鸡预混合，ZYH: 猪预混合，NN: 奶牛精料补充料， 200 mg/kg 添加。
图9是不同浓度的EDTA-2Na对大观霉素回收率的影响。
图10是提取液的pH值（2~9）对大观霉素回收率的影响（20.0 mg/kg添加）。
图11是提取液的pH值（4.1~4.9）对大观霉素回收率的影响（20.0 mg/kg添加）。
图12是 MCX与WCX SPE小柱对大观霉素回收率的影响（ZPH：猪配合饲料；ZYH：猪预混合饲料， 20.0 mg/kg 添加）。
图13是不同规格MCX SPE小柱对大观霉素回收率的影响（1000.0 mg/kg添加）。
图14是饲料中大观霉素不同水平添加回收率（检测浓度与溶剂标准溶液比较）。
图15是空白饲料色谱图；
其中，a:鸡配合饲料；b:鸡预混合饲料；c:鸡浓缩饲料；d:猪配合饲料；e:猪预混合饲料；f:奶牛精料补充料。
图16是不同饲料中阳性添加色谱图；
其中，a:鸡配合饲料；b:鸡预混合饲料；c:鸡浓缩饲料；d:猪配合饲料；e:猪预混合饲料；f:奶牛精料补充料，1.0 mg/kg添加。
具体实施方式
下面结合方法原理、附图和实施例等对本发明做进一步阐述。
试样中大观霉素用三氯乙酸水溶液（含乙二胺四乙酸二钠）提取，提取液调节pH值后经混合型阳离子固相小柱净化，溶解、过膜后，液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准工作曲线校准，外标法定量。
称取饲料样品2.5 g，置于50 mL塑料离心管中，加入23 mL 2% TCA溶液，再加入2mL 5% EDTA-2Na溶液，常温水浴超声20 min，于8 000 r/min离心5 min，转移上清液至另一只50 mL离心管中。将沉淀重复提取一次并离心，合并两次上清液，混匀。准确移取3 mL提取液至10 mL塑料离心管中，用10%氨水溶液准确调节pH至4.7±0.2后，于8 000 r/min离心5min，制得样品备用液。依次用3 mL甲醇和3 mL水活化MCX固相萃取小柱，将样品备用液全部上样，分别用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽干。用3 mL 10% 氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，准确加入3 mL样品溶解液（流动相A和B各50%）复溶，过0.22 μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS检测，基质匹配外标法定量。
所用仪器设备：超高效液相色谱-质谱联用仪（Waters ACQUITYTM UPLC TQ Massdetector，美国Waters公司）、KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、超纯水仪（德国EMD Millipore公司）、电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、ST 40R离心机（美国Thermo公司）、氮吹仪（美国Organomation公司）。
盐酸大观霉素（纯度：99.9%）购自坛墨质检科技股份有限公司。色谱级甲醇、乙腈和甲酸购自美国Sigma-Aldrich公司。Oasis MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL）、Oasis MCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Oasis MCX固相萃取柱（500 mg，6 mL）和Oasis WCX固相萃取柱（60mg，3 mL）购自美国Waters公司。分析纯三氯乙酸（TCA）、氨水和乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）均购自国药集团化学试剂有限公司。
饲料样品来自浙江科盛饲料股份有限公司。
实施例1 LC-MS/MS分析条件
色谱柱：HILIC，50 mm×2.1 mm，粒径1.7 μm；进样量：5 μL；流速：0.5 mL/min；流动相A相：0.01 mol/L甲酸铵水溶液（含0.4%甲酸），流动相B相：0.01 mol/L甲酸铵溶液（乙腈-水，9:1，含0.4%甲酸），色谱分离梯度洗脱条件如表1所示，色谱图见图2。
表1 梯度洗脱程序
电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+）；检测方式：多级反应监测（MRM）；毛细管电压：0.5 kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：550℃；脱溶剂气流速：1000 L/Hr。雾化气、干燥气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气。喷雾电压、碰撞能量等参数优化至最佳灵敏度。监测离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。
表2 质谱分析条件
实施例2样品的前处理
提取：平行做两份试样。称取2.5 g（精确至0. 01 g）饲料样品于50 mL塑料离心管中，加入23 mL 2% TCA溶液，再加入2 mL 5% EDTA-2Na溶液，常温水浴超声20 min，于8 000r/min离心5 min，转移上清液至另一只50 mL离心管中。将沉淀重复提取一次并离心，合并两次上清液，混匀。准确移取3 mL提取液至10 mL塑料离心管中，用10%氨水溶液准确调节pH至4.7±0.2后，于8 000 r/min离心5 min，制得样品备用液。
净化：依次用3 mL甲醇和3 mL水活化MCX固相萃取小柱，将样品备用液全部上样，分别用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽干。用3 mL 10% 氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，准确加入3 mL样品溶解液（流动相A和B各50%）复溶，过0.22 μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS检测。
实施例3标准曲线的制备
空白基质标准工作曲线：称取空白饲料2.5 g，精确至0.01 g，置于50 mL离心管中，按样品的前处理步骤进行处理。以获得的复溶液作为空白基质，稀释200 μg/mL的大观霉素标准溶液，得到0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL的空白基质标准工作溶液，上机测试，以浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制空白基质标准工作曲线，结果见表3。
基质匹配标准工作曲线：称取各空白饲料样品8份，每份2.5 g，精确至0.01 g，置于50 mL离心管中，再向其中加入一系列标准溶液，静置过夜。按样品试验步骤进行处理，形成理论添加浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL的标准溶液，上机测试，以浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制基质匹配标准工作曲线，结果见表3。
同时制备溶剂标准溶液，一并上机测试。以标准工作溶液的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制溶剂标准工作曲线，结果见表3。
表3 不同饲料基质中大观霉素的标准曲线方程、相关系数和基质效应
| 饲料样品 | 溶剂标准曲线方程 | 相关系数(R 2 ) | 空白基质标准曲线方程 | 相关系数(R 2 ) | 基质效应(%) | 基质匹配标准曲线方程 | 相关系数(R 2 ) |
| 鸡配合饲料 | y=8128.9x-3023.4 | 0.993 1 | y=6613.2x-2232.9 | 0.990 4 | 0.81 | y=5607.4x-1759.6 | 0.995 0 |
| 鸡预混合饲料 | y=8298.3x-2800.8 | 0.993 0 | y=5532.2x-1867.2 | 0.993 0 | 0.96 | y=5709.6x-973.3 | 0.996 8 |
| 鸡浓缩饲料 | y=8260.2x-2757.5 | 0.994 4 | y=7891.3x-1045.2 | 0.996 8 | 0.67 | y=6477.9x-1004.3 | 0.997 7 |
| 猪配合饲料 | y=8228.3x-2970.1 | 0.994 4 | y=9265.7x-857.2 | 0.999 5 | 1.13 | y=6437.8x-448.7 | 0.999 6 |
| 猪预混合饲料 | y=8173.2x-2564.4 | 0.995 8 | y=7092.9x+313.3 | 0.993 0 | 0.87 | y=4142.9x-1268.8 | 0.994 5 |
| 奶牛精料补充料 | y=8314.6x-2748.3 | 0.994 9 | y=6225.8x-541.4 | 0.993 0 | 1.11 | y=3349.5x-1495.4 | 0.992 0 |
注：线性范围：0.1~10.0 μg/mL
实施例4方法的准确度与精密度
提取、净化等前处理条件的优化以提取回收率评价，提取回收率为加入溶剂标准品的饲料样品经前处理后的峰面积与溶剂标准品峰面积的比值。方法的准确度以回收率来评价，分别移取25、250、2500、4000 μg/mL 4个浓度的大观霉素标准溶液，加入到空白饲料样品中，得到最终计算浓度为2.0、20.0、200、1000 mg/kg的4个添加水平。每种饲料在每个浓度下设6个平行，以基质匹配标准工作曲线计算回收率，精密度以相对标准偏差（RSD）表示。
实施例5数据处理与分析
数据处理采用Excel 2016统计分析软件进行处理和计算，结果以平均值来表示。
根据以上实施例1-6得到的结果与讨论：
本研究在流动相中分别添加0.005、0.01、0.02 mol/L甲酸铵，以考察甲酸铵含量对峰形、质谱强度以及稳定性的影响，色谱图见图3中a-e部分，结果发现：流动相中不加甲酸铵，色谱谱峰会产生拖尾现象；高浓度甲酸铵（0.02 mol/L）会使大观霉素产生较强的离子抑制现象，大观霉素的灵敏度相对较低；随着甲酸铵浓度降低，灵敏度逐渐升高，而当甲酸铵浓度低至0.005 mol/L时，大观霉素峰面积重复性变差。因此，最终确定0.01 mol/L甲酸铵水溶液（含0.4%甲酸）和0.01 mol/L甲酸铵溶液（乙腈-水，9:1，含0.4%甲酸），作为流动相。
如图1结构所示，大观霉素具有独特的三元环结构，两个糖苷通过缩酮和半缩醛相连，其分子中的羰基以酮水合形式存在（见图4）。母离子扫描，质谱图中出现丰度较高的准分子离子峰[M+H2O+H]+，故选择m/z 351作为母离子。对母离子进行轰击碎裂，产生相应的子离子，子离子质谱图见图5。可能质谱裂解途径见图6所示，大观霉素在B环的同侧C-O键间断裂生成m/z 207的碎片，再经过一系列脱水或-CH3NH2等残基生成多级碎片。选择丰度较强的二级碎片离子m/z 333作为定量离子，m/z 207作为定性离子。
试验比较了0.5%、1%、2%、3%、5%、8%以及10%TCA溶液的提取效率和对峰形的影响。在此基础上也考察了2%TCA溶液中添加或不添加EDTA-2Na对大观霉素的质谱响应值的影响。采用不同浓度的TCA溶液作为提取液时：分别称取鸡配合、鸡预混合、鸡浓缩、猪配合、猪预混合等空白饲料和奶牛精料补充料空白饲料各14份试样（用于平行两份试验），每份试样2.5 g（精确到0.01 g），置于50 mL塑料离心管中，均添加250 μL浓度为2000 μg/mL的大观霉素，室温放置过夜。分别加入25 mL 0.5%、1%、2%、3%、5%、8%以及10%TCA的提取液，按样品的前处理步骤进行处理。试验结果发现：鸡预混合、猪预混合和奶牛精料补充料等饲料中大观霉素回收率均在20%以下，选择2%TCA溶液提取鸡配合、鸡浓缩、猪配合等饲料时，大观霉素整体回收率更高和更稳定（见图7）。
考虑到TCA溶液提取鸡预混合、猪预混合和奶牛精料补充料等饲料，大观霉素回收率均低于20%，参考了不同基质中EDTA-2Na的添加量，向上述三种经不同浓度的TCA提取液中添加EDTA-2Na，并参考文献报道使EDTA-2Na添加浓度为0.6%，具体操作为：从每份试样中准确移取3 mL提取液各3份，至10 mL塑料离心管中，分别向其中加入261 uL 7.5% EDTA-2Na混匀，用10 %氨水准确调节pH为4.7±0.2，后经MCX小柱净化，浓缩后复溶，上机测定。试验结果表明：向小于5%的TCA溶液中添加0.6% EDTA-2Na均使鸡预混合、猪预混合和奶牛精料补充料等饲料中的大观霉素回收率大幅度提高（见图8）。
在此基础上，考察了向2%TCA溶液中添加不同浓度的EDTA-2Na对饲料中大观霉素提取效率的影响。分别称取鸡配合、鸡预混合、鸡浓缩、猪配合、猪预混合等空白饲料和奶牛精料补充料空白饲料各18份试样（用于平行两份试验），每份试样2.5 g（精确到0.01 g），置于50 mL塑料离心管中，添加250 μL浓度为2000 μg/mL的大观霉素，室温放置过夜。向2%TCA中添加EDTA-2Na，使2%TCA提取液分别含0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的EDTA-2Na，按样品的前处理步骤进行处理。试验结果发现：添加EDTA-2Na可以获得更高且更稳定的回收率，而当EDTA-2Na的浓度为0.4%时，大观霉素回收率普遍较高（见图9）。因此，最后确定采用含0.4% EDTA-2Na的2%TCA溶液作为饲料中大观霉素的提取液。
本研究考察了10 %氨水调节鸡预混合饲料提取液的pH值在2、3、4、5、6、7、8、9时的回收率。平行做8份试样。称取鸡预混合空白饲料2.5 g（精确到0.01 g），置于50 mL塑料离心管中，添加200 μL浓度为250.0 μg/mL的大观霉素，室温放置过夜。加入23 mL 2%TCA溶液再加入2 mL 5% EDTA-2Na溶液，常温水浴超声20 min，于8000 r/min离心5 min，取上清液。残留物用上述方法重复提取一次，合并上清液。从每份试样中准确移取3 mL提取液各5份，至10 mL塑料离心管中，用10 %氨水准确调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9，后经MCX小柱净化，浓缩后复溶，上机测定。试验结果表明：调节提取液pH值4~5时，可以获得更高的回收率（见图10），在此基础上继续采用奶牛精料补充料对pH值在4~5区间内的回收率进行进一步考察。
称取奶牛精料补充料空白饲料2.5 g（精确到0.01 g），置于50 mL塑料离心管中，添加200 μL浓度为250.0 μg/mL的大观霉素，室温放置过夜。加入23 mL 2%TCA溶液再加入2mL 5% EDTA-2Na溶液，常温水浴超声20 min，于8000 r/min离心5 min，取上清液。残留物用上述方法重复提取一次，合并上清液。从试样中准确移取3 mL提取液15份，至10 mL塑料离心管中，用10 %氨水准确调节pH为4.1、4.3、4.5、4.7和4.9（3个重复），后经MCX小柱净化，浓缩后复溶，上机测定。试验结果表明：pH值在4.5到4.9区间可以获得更高且更稳定的回收率（见图11），所以最终将上样溶液pH值调节为4.7±0.2。
试验选取了Oasis MCX（60 mg，3 mL）和Oasis WCX（60 mg，3 mL）两种常见阳离子型SPE小柱净化猪配合饲料和猪预混合饲料提取液。分别称取猪配合和猪预混合空白饲料各5份试样，每份试样2.5 g（精确到0.01 g），置于50 mL塑料离心管中，添加200 μL浓度为250.0 μg/mL的大观霉素，室温放置过夜。按样品的前处理步骤进行提取调节pH值后，经MCX小柱或WCX小柱净化，浓缩后复溶，上机测定。试验结果表明：对于猪配合饲料和猪预混合饲料Oasis MCX比Oasis WCX SPE小柱在相同的洗脱体系下能获得更高的回收率（见图12），因此选用MCX SPE小柱用于提取液的净化。
在此基础上，考察了不同规格的MCX SPE小柱的净化效果，选取了Oasis MCX（60mg，3 mL）、Oasis MCX（150 mg，6 mL）和Oasis MCX（500 mg，6 mL）三种不同规格的SPE小柱对猪配合饲料提取液进行净化。称取猪配合空白饲料2份，各2.5 g（精确到0.01 g），置于50mL塑料离心管中，其中一份添加625 μL浓度为4000 μg/mL（饲料中最高添加水平1000.0mg/kg）的大观霉素，室温放置过夜。按样品的前处理步骤进行处理。用空白饲料提取液将对应规格的MCX SPE小柱净化后复溶液稀释10倍后上机测定。试验结果表明：三种不同规格MCX SPE小柱在相同的洗脱体系下均能获得60%~70%的回收率（见图13），可见Oasis MCX的最小规格即可对最高浓度添加（1000.0 mg/kg）的大观霉素进行有效的净化。因此选择Oasis MCX（60 mg，3 mL）用于提取液的净化。
制备溶剂标准工作曲线、空白基质标准工作曲线、基质匹配标准工作曲线方程、相关系数（R 2 ）和ME列于表3。试验结果表明：一方面不同种类的饲料基质会对大观霉素产生大小不一的增强或抑制效应。另一方面，除了鸡浓缩饲料中ME为0.67，其余饲料中ME范围为0.81~1.13，除鸡浓缩饲料之外的饲料基质未产生明显的增强或抑制效应。但对空白鸡配合饲料分别添加4个浓度水平（2.0、20.0、200和1000 mg/kg）的大观霉素，经前处理后的复溶液与其相应的溶剂标准溶液（0.1、1.0、5.0和10.0 μg/mL）比较发现，回收率仅在60%~70%之间（见图14），而如表3所示，基质匹配标准工作曲线方程在0.1~10.0 μg/mL浓度范围内，线性关系良好（R 2 均大于0.99）。综上所述，采用基质匹配标准工作曲线对饲料中大观霉素进行定量分析。
添加系列大观霉素标准溶液至空白饲料样品中（见图15），经提取、净化等处理后得到理论添加浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL的标准溶液，在线性范围0.1~10.0 μg/mL内，大观霉素的标准工作曲线见表3，R 2 均大于0.99。
向空白试样中添加大观霉素使之添加浓度为2.0 mg/kg，其信躁比S/N均大于10，并且经前处理后其浓度在线性范围内，该方法的检出限则根据S/N=3（见图16），确定的检出限可达到1.0 mg/kg。所以最终确定方法的定量限为2.0 mg/kg，检出限为1.0 mg/kg。
选用畜禽配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料分别进行加标回收试验，每种饲料采用不同的添加浓度，每个添加浓度制备6个平行样品，结果见表4。试验结果表明，在1.0~1000 mg/kg添加浓度范围内，大观霉素回收率为91.3%~104.2%，RSD在1.5%~9.4%之间。由此可见回收率和重复性较好，说明本方法能满足饲料中大观霉素含量测定需要。
表4 饲料样品中的大观霉素回收率(n=6) %
流动相的组成：文献报道[MORENO-GONZALEZ D, HAMED A M, GARCIA-CAMPANA AM, et al. Evaluation of hydrophilic interaction liquid chromatography-tandemmass spectrometry and extraction with molecularly imprinted polymers fordetermination of aminoglycosides in milk and milk-based functional foods[J].Talanta, 2017,171:74-80. ]，在流动相中使用甲酸铵或乙酸铵有助于改善氨基糖苷类物质在HILIC分离过程中的峰形和离子化。因此，为解决上述色谱峰拖尾的问题，本发明在优化参考文献[CHEN L, CHEN H, SHEN M. Hydrophilic interaction chromatographycombined with tandem mass spectrometry method for the quantification oftobramycin in human plasma and its application in a pharmacokinetic study[J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical andLife Sciences, 2014,973C:39-44. ]分析氨基糖苷类化合物所使用的甲酸—挥发性铵盐—水—乙腈的流动相体系基础上，采用了甲酸—甲酸铵—水—乙腈流动相体系，即在水和乙腈/水溶液（V/V，9:1）中分别加入0.4%甲酸。在试验过程中发现，随着流动相中有机相比例增加，大观霉素保留时间变大，梯度洗脱起始阶段使用高比例有机相，延长了大观霉素在色谱柱上的保留，后期逐渐提高水相比例，促进了大观霉素出峰。同时，HILIC因为流动相中富含有机溶剂，增强了去溶剂和离子源的离子化效率，从而获得更高的灵敏度。
样品前处理条件：TCA溶液作为一种蛋白沉淀剂常用于目标化合物的提取，而氨基糖苷类物质又能够在酸性环境下稳定存在，因此，TCA溶液被用作饲料中的大观霉素提取液。低浓度的TCA溶液不能有效的沉淀蛋白质，并且混浊的提取液往往造成SPE小柱的堵塞，太高浓度的TCA溶液则引入较高强度的离子而影响SPE小柱的净化效果，因此，TCA溶液浓度至关重要。此外，在TCA溶液中往往加入EDTA-2Na，对于提取液中加入EDTA-2Na的作用机制还不是十分明确，有研究认为其作用是络合金属离子，但又有学者认为在低pH环境下，EDTA-2Na络合能力比较有限。此外，考虑到后续的样品净化，一些提取液在净化前还需要对其pH进行严格的控制。因此，本发明对提取液和上样溶液的pH值进行了考察。
固相萃取柱的选择：饲料样品提取过程中的基质杂质可能会在色谱柱上吸附，不能被洗脱，造成色谱柱柱效降低，同时造成系统压力升高，另外无机盐类也会抑制质谱信号。2%TCA作为提取液只能沉淀部分蛋白质，还需要进一步净化。氨基糖苷类物质具有强极性和弱碱性，对这些化合物的净化涉及离子交换机制，常用的反相SPE往往不能凑效，而需要使用阳离子交换SPE取而代之。通常采用弱阳离子交换和强阳离子交换SPE小柱。当采用强阳离子交换SPE小柱时，氨基糖苷类化合物与填料上的磺酸基位点结合牢固，使得定量洗脱困难。而当采用弱阳离子交换SPE小柱时，需要对上样溶液的pH进行严格的控制，一方面需要确保离子交换小柱的去质子化，另一方面需要使氨基糖苷类化合物质子化而在SPE小柱上得以保留。本试验发现，未经固相萃取柱净化的样品会产生较强的基质效应，造成色谱柱污染，峰形变宽、柱压升高以及灵敏度下降等一系列问题。在这种情况下，本试验尝试了3种规格的MCX固相萃取柱3CC（60 mg）、6CC（150 mg）和6CC（500 mg），结果发现2种6CC规格的固相萃取柱需要更多的洗脱液，而样品经3CC（60 mg）规格的固相萃取柱净化后可完全消除基质效应，并且得到可靠的试验结果。因此，从效率和经济的角度考虑，本试验最终选择了3CC（60 mg）这个规格的MCX固相萃取柱用于饲料样品的净化。
样品基质效应：基质效应（ME）是指目标化合物在离子化时受到基质干扰物竞争引起分析信号变化从而导致增强或抑制的效应，空白基质标准工作曲线与溶剂标准工作曲线斜率的比值反映基质效应的强弱。采用公式ME=K 1 /K 2 （其中K 1 和K 2 分别为空白基质标准工作曲线斜率和溶剂标准工作曲线斜率），当ME为0.8~1.2时，说明基质效应不明显。超出这个范围则表示基质增强或抑制效应不可忽略。
试验比较了溶剂标准工作曲线、空白基质标准工作曲线和基质匹配标准工作曲线，空白基质标准工作曲线斜率与溶剂标准工作曲线的比值反映基质效应的强弱，基质匹配法作为基质校准的替代方法旨在补偿基质效应和回收率损失。基质匹配法选取类型相同，均匀一致、且在大观霉素保留时间处，质谱响应值小于方法定量限30%的饲料样品，作为空白样品。第一次分析时，制备基质匹配标准溶液首先对残留物量进行初步分析，根据分析结果确定标准物质添加量，使得添加到试验部分的标准物质为已存在于样品中的残留物估计量的1到5倍之间。
本发明采用三氯乙酸水溶液（含乙二胺四乙酸二钠）提取饲料中的大观霉素，并将提取液的pH值进调节至4.7±0.2，经MCX固相萃取柱净化，成功建立了提取和净化程序；试样经HILIC色谱柱分离，流动相为0.01 mol/L甲酸铵水溶液（含0.4%甲酸）-0.01 mol/L甲酸铵乙腈-水溶液（含0.4%甲酸），梯度洗脱，以电喷雾离子源（ESI）正离子扫描方式，在多反应监测（MRM）模式下进行测定，成功建立了仪器分析方法；本试验通过基质匹配外标法校正基质干扰，通过UPLC-MS/MS分析，建立了定量测定饲料中大观霉素的方法。该方法中大观霉素的检出限和定量限分别为1.0 mg/kg和2.0 mg/kg；大观霉素在1.0~10.0 μg/mL范围内线性关系良好，R 2均大于0.99。在4个浓度（2.0、20.0、200和1000 mg/kg）下进行添加试验，大观霉素的回收率为91.3%~104.2%，RSD为1.5%~9.4%。
综上所述，本发明建立的SPE-UPLC-MS/MS法操作简单，准确度高，可应用于饲料中大观霉素的快速定量分析。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种饲料中大观霉素的测定方法，其特征是：步骤如下：称取待测饲料2.5g，置于50mL塑料离心管中，加入23mL2％三氯乙酸水溶液，再加入2mL 5％EDTA-2Na溶液，常温水浴超声20min，于8000r/min离心5min，转移上清液至另一只50mL离心管中；将沉淀重复提取一次并离心，合并两次上清液，混匀；准确移取3mL提取液至10mL塑料离心管中，用10％氨水溶液准确调节pH至4.7±0.2后，于8000r/min离心5min，制得样品备用液；依次用3mL甲醇和3mL水活化MCX固相萃取小柱，将样品备用液全部上样，分别用3mL水和3mL甲醇淋洗，抽干；用3mL 10％氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，准确加入3mL样品溶解液，其中流动相A和B各50％，复溶，过0.22μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS检测，基质匹配外标法定量；
所述的流动相A为0.01mol/L甲酸铵水溶液，含0.4％甲酸，称取0.63g甲酸铵，用100mL水溶解，再加入4mL甲酸，用水定容至1000mL，混匀；
所述的流动相B为0.01mol/L甲酸铵乙腈-水溶液，含0.4％甲酸，称取0.63g甲酸铵，用100mL水溶解，再加入4mL甲酸，用乙腈定容至1000mL，混匀；
所述的2％三氯乙酸水溶液为三氯乙酸2mL，加水稀释至100mL；
所述的5％EDTA-2Na溶液为EDTA-2Na 5g，加水溶解并稀释至100mL；
所述的10％氨水溶液为氨水10mL，加水稀释至100mL；
所述的10％氨水甲醇溶液为氨水10mL，加甲醇稀释至100mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：调节提取液pH至4.7±0.2，步骤如下：准确移取3mL提取液至10mL塑料离心管中，用10％氨水溶液准确调节pH至4.7±0.2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的基质匹配外标法定量，步骤如下：称取各空白饲料样品8份，每份2.5g，置于50mL离心管中，再向其中加入一系列标准溶液，静置过夜。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，按样品试验步骤进行提取、调节pH值、净化处理，形成理论添加浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/mL的标准溶液，上机测试，以浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制基质匹配标准工作曲线，对样品中的大观霉素进行定量。
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