CN114814012B

CN114814012B - 饲料中林可胺类抗生素的测定方法

Info

Publication number: CN114814012B
Application number: CN202210385369.3A
Authority: CN
Inventors: 王凤芹; 开丽霞; 汪以真; 路则庆; 程远之
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-04-13
Filing date: 2022-04-13
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-04-13
Also published as: CN114814012A

Abstract

本发明公开一种饲料中林可胺类抗生素的测定方法。本发明采用80%甲醇磷酸氢二钾溶液对饲料中3种林可胺类抗生素（林可霉素、克林霉素和吡利霉素）进行提取，并采用混合型阳离子交换（MCX）固相萃取小柱对试样进行净化。通过液相色谱串联质谱法（LC‑MS/MS）对林可霉素、克林霉素和吡利霉素进行同时定量。结果表明，在40~4000μg kg^‑1的添加水平下，7种饲料中林可胺类的平均回收率在81.5%~103.3%之间，日内和日间相对标准偏差小于10%。饲料中的检出限（LOD）和定量限（LOQ）在3.6~9.8μg kg^‑1和11.4~31.3μg kg^‑1之间。该方法适用于同时测定饲料中林可霉素、克林霉素和吡利霉素3种抗生素。本发明准确灵敏，操作简便，稳定性好。

Description

饲料中林可胺类抗生素的测定方法

技术领域

本发明涉及一种饲料中林可胺类抗生素的测定方法。

背景技术

林可胺类抗生素来源于天然产物林可霉素，包括半合成衍生物克林霉素和吡林霉素（图1）（Morar等，2009）。1976年，第一种林可胺类抗生素—林可霉素在美国首次获得许可，用于治疗革兰氏阳性细菌引起的感染（Schwarz等，2016）。由于抗菌谱较窄，克林霉素被引入化学修饰以扩大其抗菌谱（Rezanka等，2007；Hoeksema等，1964），克林霉素于1970年在美国获得食品和药品管理局（FDA）的批准。2000年，美国和欧盟批准了一种新的林可胺类抗生素，即吡利霉素，该抗生素已被证明可有效治疗哺乳期奶牛的乳腺炎（Jiang等，2015）。需要注意的是，高剂量的林可胺类抗生素对动物具有较大的毒性（Morris, 1995）。

抗生素耐药性是一个全球性的问题，其促使科学界寻找控制和检测饲料中抗生素的新方法和途径。对于畜禽配合饲料、预混合饲料和奶牛精料补充料中林可胺类抗生素的测定，传统上采用微生物测定法（Stahl等，1983；Wong，1990）或薄层色谱法（TLC）（Krzek等，2000）。然而，微生物测定法和TLC方法的灵敏度、准确性和选择性较差（Douša等，2006）。一些文献报道了液质联用法测定饲料中的林可胺类抗生素，获得了较低检出限、较好的精密度和再现性。然而，所有这些研究都是针对其中一两种林可胺类抗生素的分析（Oyedeji等，2019；Yan等，2010）。迄今为止，还没有文献报道可同时检测饲料中林可霉素、克林霉素和吡利霉素3种抗生素。

发明内容

针对现有饲料中林可胺类抗生素测定方法的缺乏以及对饲料中抗生素监管的需要，本发明首次提供了一种饲料中林可胺类抗生素的测定方法，方法准确灵敏度，操作简便，稳定性好。

一种饲料中林可胺类抗生素测定的方法，称取饲料样品2.5 g，置于50 mL离心管中，加入20 mL 80%甲醇磷酸氢二钾提取液，30℃±2℃水浴超声20 min，于8000 r/min离心5 min，转移上清液至50 mL容量瓶中。沉淀重复提取一次，并离心，合并两次上清液，用80%甲醇磷酸氢二钾提取液定容至50 mL。准确移取2.5 mL提取液至10 mL塑料离心管中，加入2.5 mL 1%甲酸水溶液，涡旋混匀，获得提取液的备用液；备用液由MCX小柱净化后，经LC-MS/MS分析，外标法定量。

所述的80%甲醇磷酸氢二钾提取液：称取三水磷酸氢二钾11.411 g，加入430 mL水溶解，用0.1 M盐酸溶液调节pH至8.0±0.1，并定容至500 mL，混匀；取甲醇800 mL，加入0.1M磷酸氢二钾缓冲液200 mL，混匀。

所述的净化方法，具体步骤如下：

MCX小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 1%甲酸水溶液活化，上述提取液的备用液过柱。用3 mL 1%甲酸水溶液、3 mL水和3 mL甲醇依次淋洗MCX小柱，抽干。用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于50℃水浴氮气吹干，准确加入2.5 mL 50%甲醇溶液复溶，涡旋混匀，过有机微孔滤膜，获得上机分析试样溶液。

所述的外标法定量，具体步骤如下：

准确移取适量的林可胺类抗生素混合标准溶液用50%甲醇溶液配制成浓度分别为1.0 μg L^-1、2.0 μg L^-1、5.0 μg L^-1、10.0 μg L^-1、50.0 μg L^-1、100 μg L^-1和200 μg L^-1的标准工作溶液。依次测定林可胺类抗生素标准溶液与试样溶液，以标准溶液的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制工作曲线，并对样品进行定量。

本发明的有益效果：

本发明首次采用80%甲醇磷酸氢二钾溶液对饲料中的3种林可胺类抗生素进行提取；再用MCX固相萃取小柱对提取液进行净化；采用LC-MS/MS分析，外标法对试样中的3种林可胺类抗生素同时定量。

结果表明，在40~4000 μg kg^-1的添加水平下，7种饲料中林可胺类的平均回收率在81.5%~103.3%之间，日内和日间相对标准偏差小于10%。饲料中的检出限（LOD）和定量限（LOQ）在3.6~9.8μg kg^-1和11.4~31.3μg kg^-1之间。该方法适用于同时测定饲料中林可霉素、克林霉素和吡利霉素3种抗生素。该方法灵敏度高、准确度高、操作简便稳定。

附图说明

图1是林可霉素、克林霉素素和吡利霉素的化学结构图（ChemDraw Ultra作图）。

图2是林可霉素、克林霉素素和吡利霉素色谱图（流动相：甲醇-水）。

图3是林可霉素、克林霉素素和吡利霉素色谱图（流动相：乙腈-水）。

图4是林可霉素、克林霉素素和吡利霉素色谱图（流动相：0.1%甲酸甲醇-水）。

图5是林可霉素、克林霉素素和吡利霉素色谱图（流动相：0.1%甲酸乙腈-水）。

图6是林可霉素质谱图（100 μg L^-1, 50% MeOH溶液）。

图7是克林霉素质谱图（100 μg L^-1, 50% MeOH溶液）。

图8是吡利霉素质谱图（100 μg L^-1, 50% MeOH溶液）。

图9是林可胺类抗生素在不同提取和净化条件下的回收率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细的说明。

方法原理

用80%甲醇磷酸氢二钾溶液提取饲料中的3种林可胺类抗生素，随后采用MCX固相萃取小柱对提取液进行净化，通过与标样比对，应用LC-MS/MS对饲料中3种林可胺类抗生素定性，并应用外标法对其进行同时定量。

操作步骤

称取饲料样品2.5 g，置于50 mL离心管中，加入20 mL 80%甲醇磷酸氢二钾提取液，30℃±2℃水浴超声20 min，于8000 r/min离心5 min，转移上清液至50 mL容量瓶中。沉淀重复提取一次，并离心，合并两次上清液，用80%甲醇磷酸氢二钾提取液定容至50 mL。准确移取2.5 mL提取液至10 mL塑料离心管中，加入2.5 mL 1%甲酸水溶液，涡旋混匀，备用；MCX小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 1%甲酸水溶液活化，上述备用液过柱。用3 mL 1%甲酸水溶液、3 mL水和3 mL甲醇依次淋洗MCX小柱，抽干。用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于50℃水浴氮气吹干，准确加入2.5 mL 50%甲醇溶液复溶，涡旋混匀，过有机微孔滤膜，经LC-MS/MS分析，外标法定量。

仪器与试剂

所用仪器设备：超高效液相色谱-质谱联用仪（Acquity UPLC TQ MS，美国Waters公司）、超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）、超纯水仪（Milli-Q，德国EMDMillipore公司）、电子分析天平（ME204E，瑞士Mettler Toledo公司）、离心机（ST 40R，美国Thermo公司）和氮吹仪（N-EVAP 112，美国Organomation公司）。

（纯度≥98%）、克林霉素盐酸盐一水合物（纯度≥98%）和吡利霉素盐酸盐（纯度≥96%）购自百灵威科技有限公司。色谱级甲醇、乙腈和甲酸购自美国Sigma-Aldrich公司。Oasis MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL）、Oasis HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL）购自美国Waters公司。分析纯三水磷酸氢二钾、氨水和盐酸均购自国药集团化学试剂有限公司。AcuqityUPLC BEH C₁₈（2.1×50 mm，1.7 μm）色谱柱购自美国Waters公司。

饲料样品来自浙江科盛饲料股份有限公司。

实施例1 LC-MS/MS分析条件

流动相由A和B两相组成（A: 0.1%甲酸水溶液；B:乙腈），梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速为 0.4 mL min^-1；柱温设置为30℃；进样量为8 µL。

林可霉素、克林霉素和吡利霉素均具有叔胺结构，表现为弱碱性，其在质谱上有很强的正离子响应，故选择正离子模式扫描，多级反应监测（MRM）。雾化气、干燥气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气。以A、B流动相（50:50，V/V）配制浓度为100 μg L^-1林可霉素、克林霉素和吡利霉素3种化合物，通过注射泵以10 mL min^-1的流速注入质谱分析，以优化锥孔电压、碰撞能量、驻留时间和碎片离子等质谱参数（见表2）并创建相应的调谐文件。

实施例2 方法学研究

参考欧盟委员会第2002/657/EC号决议（2002/657/EC）对本发明方法进行验证，对基质效应、准确度（回收率）、精密度（再现性）、线性和选择性进行评估，并对其进行细小的修改：采用检出限（LOD）和定量限（LOQ）代替动物饲料中常见的检测确定限（CCα）和检测容量（CCβ）（Frenich 等，2011；Ying等，2013；Kiebooms等，2015）

在本发明中，以基质匹配标准溶液工作曲线斜率与纯溶剂的标准溶液工作曲线斜率的比值来评估基质效应（ME）（Chawla等，2017；Varga等，2021）。对于使用7种不同种类的空白饲料提取物作为基质和纯溶剂配制系列混合标准工作溶液（1.0, 2.0, 5.0, 10.0,50.0, 100.0和200 μg L^-1）。基质效应根据方程式（1）进行计算，结果用ME%表示。一般来说，如果斜率的比值在80%到120%之间（Frenich等，2010），信号增强或抑制效应被认为是可接受的（Lehotay等，2010），斜率的比值在该范围之外，则表明存在强烈的基质效应（Lopes等，2012）。

将低、中、高（40 μg kg^-1、400 μg kg^-1和4000 μg kg^-1）三种不同浓度水平的林可胺类混合标准溶液加入到2.5 g空白饲料中（6个平行）。按提取和净化步骤进行处理后，并经LC-MS/MS定量分析，通过方程式（2）评估林可胺类抗生素的平均回收率。对于一个有效的前处理方法，回收率应在80%到110%之间（Molononi等，2018年）。

方法的精密度由重复性（日内精密度）和日间精密度确定，并以相对标准偏差（RSD）表示。对于日内精密度，在同一天对3个不同添加水平的饲料样品进行试验，每个水平6个重复。对于日间精密度，在3天的时间区间内，3次重复当日试验。良好的精密度标准是RSD应低于20%（Molononi等，2018年）。

线性通过基质匹配标准曲线进行分析，用猪、鸡和鸭的配合饲料、预混合饲料和奶牛精料补充料的空白基质配制林可霉素、克林霉素和吡利霉素系列浓度（1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0和200 μg L^-1）的标准工作液。同时用纯溶剂配制林可霉素、克林霉素和吡利霉素系列浓度（1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0和200 μg L^-1）的标准工作液，通过上述两种标准曲线的相关系数（R²）进行评估，其应大于0.98（Molononi等，2018）。

LC-MS/MS法测定饲料中林可胺类抗生素的选择性，通过比对空白饲料和空白饲料样品加标（添加40 μg kg^-1）分析结果来验证。在适当的保留时间范围内确定化合物的特征离子和平均保留时间±相对标准偏差表示。

方法LOD和LOQ通过向7种空白饲料样品中添加低浓度（40 μg kg^-1）林可胺类抗生素来考察，每种饲料分别进行7次试验。LOD是通过将所有7种饲料中林可胺类含量的自由度（根据t值表获得）乘以标准偏差（S）来计算，即LOD=3.143×S（Li等，2009），LOQ计算参考的公式是：LOQ=10×S（Ying等，2013）。

根据以上实施例1-2得到的结果与讨论：

（1）流动相的优化和确定

比较了甲醇-水（图2）、乙腈-水（图3）、含0.1%甲酸甲醇-水（图4）和含0.1%甲酸乙腈-水（图5）等不同的流动组分。结果表明，使用含有甲酸乙腈-水的流动相体系可以获得最大的灵敏度和最佳的峰形。这可能归因于甲酸增加了林可胺类抗生素的电离，而乙腈会产生比甲醇更好的色谱峰。本方法采用甲酸水（A：含0.1%甲酸）、乙腈（B）体系作为流动相。在优化的色谱条件下，林可霉素、克林霉素和吡利霉素的保留时间分别为1. 78、1. 97 min和1. 95 min，分析时间为5 min。

（2）林可胺类化合物的质谱裂解途径解析

在正离子模式下，选择林可胺类化合物丰度较高的准分子离子峰m/z 407.4、m/z425.4、m/z 411.2作为母离子，对母离子进行轰击碎裂，产生相应的子离子质谱图（图6、图7、图8）。对林可霉素、克林霉素和吡利霉素3种化合物质谱裂解途径解析如下：林可霉素和克林霉素产生子离子m/z 126，对应于3-丙基-N-甲基吡咯烷碎片离子（图6和图7中的A）。吡利霉素产生子离子m/z 112，对应于4-乙基哌啶（图8中的A）。林可霉素的子离子m/z 359、克林霉素的子离子m/z 377和吡利霉素的子离子m/z 363是由于各自准分子离子峰中硫代甲醇分子（图6-图8中的B）的丢失。

提取和净化条件的优化和确定

本发明以猪配合饲料作为提取条件优化的基质。考虑到林可胺类抗生素的弱碱性和强极性（Schwarz等，2016），在参考文献的基础上，首次比较了5%甲醇（Douša等，2006），甲醇（Pokrant等，2019）和pH 8.0磷酸盐缓冲液（Rezende等，2012）几种溶液对饲料中林可胺类抗生素的提取效率。结果表明，80%甲醇磷酸氢二钾提取液（K₂HPO₄-MeOH）比5% MeOH（52.5%~94.7%）和MeOH（59.5%~74.9%）的平均回收率（69.7%~107.1%）高。K₂HPO₄-MeOH具有良好的提取效率，可能是因为其对饲料具有更强的渗透性。

对于第二个阶段，在LC-MS分析之前，HLB SPE小柱（Douša等，2006；Hu等，2021）通常用于对不同基质中各种抗生素的净化，用于清除样品中的复杂干扰物。然而，由于不同性质的分析物的亲脂性和pKa方面存在显著差异，因此分析物在吸附剂上的不同保留行为可能会影响最佳净化效率。因此，本发明使用了MCX SPE作为净化小柱。结果表明，当选择K₂HPO₄-MeOH作为提取液，MCX SPE净化时的回收率（92.5%~107.1%）优于HLB SPE净化时的回收率（69.7%~105.2%），如图9所示。因此，选择前者进行样品净化。随后对MCX SPE的上样溶液进行了优化，分别用a）2.5 mL含有2%甲酸的甲醇、b）2.5 mL含有1%甲酸的甲醇、c）2.5 mL含有2%甲酸的水、d）2.5 mL含有1%甲酸的水分别稀释2.5 mL的K₂HPO₄-MeOH提取液（1:1体积，混匀），并将其上样至经活化处理的MCX SPE小柱中。当用水（含1%甲酸或2%甲酸）稀释时，所有林可胺类抗生素的回收率（91.4%~104.1%）相似，且高于用甲醇（含1%甲酸或2%甲酸）稀释时的回收率（55.8%~83.5%）。因此，在提取液上样至MCX SPE小柱之前，采用2.5毫升含有1%甲酸的水稀释提取物。

方法学验证

尽管LC-MS分析具有强大的定性和定量能力，但其信号响应容易受到样品中基质干扰——即基质效应（MEs），因为在使用ESI时，其潜在的离子抑制或离子增强（Zhu 等，2018）使得基质效应成为了LC-MS分析的主要缺陷。LC-MS中基质效应的机制尚不十分明确（Nasiri等，2021）。然而，较为常见的解释是，基质与分析物之间存在可能的竞争，会影响分析物的信号强度（Benijts等，2004）。这种效应通常会导致分析物的离子抑制或离子增强，并影响所建立方法的再现性和准确性（Matuszewski等，2003）。因此，常常需要考虑在生物、环境、食品和饲料等分析中，对基质效应作出补偿（Stahnke等，2009）。常用补偿方法有同位素标记的内标物（Rychlik等，2008）、标准加入法（Harmoko等，2022）和基质匹配标准溶液法（Borrull等，2020；Varga等，2021）。虽然补偿基质效应的最佳方法是使用同位素标记的内标物，但这些化合物往往得不到或者价格昂贵（Frenich等，2011），因此，通常会考虑标准加入法或基质匹配标准溶液法。

表3显示了每种化合物对应的斜率的比值，并评估了其在不同种类饲料中的基质效应。从结果来看，斜率的比值在89%到114%之间，因此，林可霉素、克林霉素和吡林霉素在饲料中的基质效应不显著，故采用浓度范围内的纯溶剂标准工作曲线来进行定量。

表3 方法学评估结果

RSD= 相对标准偏差; FL=添加浓度: 40 μg kg^-1 (FL1), 400 μg kg^-1 (FL2),4000 μg kg^-1 (FL3).

纯溶剂配制林可霉素、克林霉素和吡利霉素混合标样系列浓度（1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0和200 μg L^-1）的标准工作液，得到的标准曲线的相关系数（R²）大于0.999。饲料中的LOD和LOQ在3.6~9.8 μg kg^-1和11.4~31.3μg kg^-1之间。回收率实验结果良好，见表3，在81.5%~103.3%之间，重复性RSD和日间RSD分别为0.7%~9.6%和2.9%~9.2%。

对于方法的特异性考察，采用LC-MS/MS法测定饲料中的林可胺类抗生素，并对空白饲料进行提取和分析。结果表明，在林可胺的保留时间内（Rt±2.5%以内），没有检测到干扰峰。

综上所述，本发明首次采用80%甲醇磷酸氢二钾溶液对饲料中3种林可胺类抗生素（林可霉素、克林霉素和吡利霉素）进行提取，并采用MCX固相萃取小柱对试样进行净化。通过液相色谱串联质谱法成功实现了对林可霉素、克林霉素和吡利霉素进行同时定量。回收率、RSD和检出限等均获得十分满意的结果。该方法适用于饲料中林可胺类抗生素的常规分析。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种饲料中林可胺类抗生素的测定方法，其特征是：向待测饲料中加入80%甲醇磷酸氢二钾溶液，对林可霉素、克林霉素和吡利霉素进行提取，采用MCX固相萃取小柱对试样进行净化，通过液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对林可霉素、克林霉素和吡利霉素进行同时定量；

所述的80%甲醇磷酸氢二钾溶液提取液为0.1 M磷酸氢二钾-甲醇，V/V，20:80；

所述的80%甲醇磷酸氢二钾提取液：称取三水磷酸氢二钾11.411 g，加入430 mL水溶解，用0.1 M盐酸溶液调节pH至8.0±0.1，并定容至500 mL，混匀；取甲醇800 mL，加入0.1 M磷酸氢二钾缓冲液200 mL，混匀。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤如下：

称取饲料样品2.5 g，置于50 mL离心管中，加入20 mL 80%甲醇磷酸氢二钾提取液，30℃±2℃水浴超声20 min，于8000 r/min离心5 min，转移上清液至50 mL容量瓶中；沉淀重复提取一次，并离心，合并两次上清液，用80%甲醇磷酸氢二钾提取液定容至50 mL；移取2.5mL提取液至10 mL塑料离心管中，加入2.5 mL 1%甲酸水溶液，涡旋混匀，得到备用液；MCX固相萃取小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 1%甲酸水溶液活化，上述备用液过柱；用3 mL1%甲酸水溶液、3 mL水和3 mL甲醇依次淋洗MCX固相萃取小柱，抽干；用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于50℃水浴氮气吹干，加入2.5 mL 50%甲醇溶液复溶，涡旋混匀，过有机微孔滤膜，经LC-MS/MS分析，外标法定量；

所述的1%甲酸水溶液为甲酸1 mL，加水定容至100 mL；

所述的5%氨水甲醇溶液为氨水5 mL，加甲醇定容至100 mL；

所述的50%甲醇溶液为甲醇50 mL，加水定容至100 mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：外标法定量，步骤如下：

准确移取适量的林可胺类抗生素混合标准溶液用50%甲醇溶液配制成浓度分别为1.0μg L^-1、2.0 μg L^-1、5.0 μg L^-1、10.0 μg L^-1、50.0 μg L^-1、100 μg L^-1和200 μg L^-1的标准工作溶液，依次测定林可胺类抗生素标准溶液与试样溶液，以标准溶液的浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制工作曲线，并对样品进行定量。