CN114324654A - 一种奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的检测方法。该方法适用于监控奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素残留量，采用弱阳离子交换固定相作为萃取小柱填料，有效去除背景基质带来的干扰，提高了方法的灵敏度，本发明的方法对丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的最低检出限为0.12μg/mL、0.52μg/mL、0.96μg/mL、0.18μg/mL和1.87μg/mL，完全满足国家标准的限量要求。而且本发明提供的检测方法无需流动相中添加盐和离子对试剂，有效避免了质谱仪器被污染的情况，检测效率高，简单方便，且耗时短。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学检测技术领域，具体涉及一种奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的测定方法。
背景技术
抗生素滥用会毒害人体健康，并且产生的抗性基因会对人体和自然界都造成无可估量的损害。因此，当前迫切需要开发简单快速、准确高效的样品前处理方法以及检测手段，以满足抗生素监控的需要。氨基糖苷类药物核心的分子结构为一个氨基环醇环和一个或多个氨基糖分子通过配糖键相连接，典型的代表药物有链霉素、妥布霉素、安普霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等。在农业、畜牧业和水产业中，氨基糖苷类药物可以有效抑制细菌的生长和繁殖，因此常被作为兽药治疗家畜肠炎、赤皮病、白头白嘴病等。由于对药物的不合理使用及违法使用等情况，导致畜牧养殖中的氨基糖苷类抗生素不断想环境排放而导致的污染问题，已经引起国内外的普遍关注。因此，为防止氨基糖苷类药物残留富集造成环境污染，危害人类健康。迫切地需要分析研究氨基糖苷类药物在奶牛循环养殖中残留情况，并将氨基糖苷类药物纳入国家安全监管体系中，确定能准确测定其含量的方法，并将其推广就显得尤为重要了。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的测定方法。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的测定方法，包括以下步骤：
S1、样品前处理：
称取粉粹后的样品，加入超纯水，震荡，第一次离心，取第一上清液；向第一上清液中加入三氯乙酸水溶液，混匀震荡，第二次离心，取第二上清液；向第二上清液中加入氢氧化钠溶液调pH值，离心，取第三上清液，待用；
S2、固相萃取：
固相萃取SPE柱依次用甲醇和水活化，取步骤S1中的第三上清液过柱处理，用乙酸铵水溶液、乙酸铵-甲醇-水溶液、乙酸铵水溶液依次淋洗，抽干，加甲酸-乙腈-水洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品；
S3、标准工作溶液配制：
将空白样品按上述步骤S1和S2处理得到空白样品基质溶液，用空白样品基质溶液在0～1000μg/mL范围内，配制至少五个浓度的氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液；所述氨基糖苷类化合物混合标准工作溶液为含妥布霉素、卡那霉素、安普霉素、丁胺卡那霉素和链霉素的混合标准工作溶液；
S4、高效液相色谱串联质谱LC-MS/MS测定：
质谱检测使用多反应监测扫描模式，丁胺卡那霉素的母离子586.2，子离子分别为323.9和425.0；链霉素的母离子582.2，子离子分别为263.7和407.7；安普霉素的母离子540.2，子离子分别为217.0和378.0；卡那霉素的母离子485.2，子离子分别为162.8和324.0；妥布霉素的母离子468.2，子离子分别为163.0和205.1；
S41定量测定：将步骤S3中混合标准工作溶液进行LC-MS/MS测定，以混合标准工作溶液的峰面积为纵坐标，以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，进行回归分析，绘制标准曲线，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤S2中的待测样品注入LC-MS/MS进行测定，测得待测样品中各氨基糖苷类抗生素的色谱峰面积，代入标准曲线，得到待测样品中氨基糖苷类抗生素的含量，然后根据待测样品所代表试样的质量计算得到样品中氨基糖苷类抗生素的残留量；
S42定性测定：检测步骤S2中待测样品中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质标准溶液的相对丰度偏差满足欧盟657指令的要求时，则判断该样品中存在该种目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物；
所述S1、S2、S3和S4无先后顺序。
进一步的，步骤S1中，所述样品前处理的具体方法为：称取2g样品，加入超纯水10mL，振荡30min，然后在6000转速下离心10min，取第一上清液5mL；向第一上清液加入200μL 50％三氯乙酸(w/v)水溶液，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL；向第二上清液中加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7，离心，取第三上清液，待用。
进一步的，步骤S1中，所述固相萃取的具体方法为：先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
进一步的，所述固相萃取小柱为TGA萃取小柱。
进一步的，所述第三上清液通过所述TGA萃取小柱中流速不大于0.3mL/min。
进一步的，步骤S4中，高效液相色谱的色谱条件如下：色谱柱为Xbridge BEH C182.1×50mm，2.5μm；流动相A为含0.1％甲酸的10mmol/L甲酸铵溶液；流动相B为甲醇；流速为0.5mL/min；进样量为5μL；柱温为30℃；等度洗脱程序为以流动相A和流动相B的体积比例为98：2洗脱10min。
进一步的，步骤S4中，质谱检测使用电喷雾质谱检测，离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多重反应监测；毛细管电压为3.2kV；离子源温度为150℃；去溶剂气温度为500℃；去溶剂气流量：800L/h；锥孔气流速为150L/h；碰撞气流速为0.13mL/min。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供的检测方法采用弱阳离子交换固定相作为萃取小柱填料，有效去除背景基质带来的干扰，提高了方法的灵敏度，本发明的方法对丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的最低检出限为0.12μg/mL、0.52μg/mL、0.96μg/mL、0.18μg/mL和1.87μg/mL，完全满足国家标准的限量要求。
(2)本发明提供的检测方法适用于监控奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素残留量，对奶牛循环养殖中的各个复杂样品中丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素能够同时准确定量，有效的提高了检测工作效率。
(3)本发明提供的检测方法无需流动相中添加盐和离子对试剂，有效避免了质谱仪器被污染的情况，检测效率高，简单方便，且耗时短。
附图说明
图1为丁胺卡那霉素MRM图；
图2为链霉素MRM谱图；
图3为安普霉素MRM谱图；
图4为卡那霉素MRM谱图；
图5为妥布霉素素MRM谱图；
图6为实施例1的空白加标回收(2ppm)的图谱；
图7为实施例1的牛尿中氨基糖苷类药物的MRM图；
图8为对比例1的空白加标回收样本(2ppm)的图谱；
图9为对比例2的空白加标回收样本(2ppm)的图谱；
图10为对比例3的空白加标回收样本(2ppm)的图谱；
图11为对比例4的空白加标回收样本(2ppm)的图谱
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
本发明提供的方法可应用于奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的检测，在该方法的多反应监测扫描模式下：丁胺卡那霉素的母离子586.2，子离子分别为323.9和425.0；链霉素的母离子582.2，子离子分别为263.7和407.7；安普霉素的母离子540.2，子离子分别为217.0和378.0；卡那霉素的母离子485.2，子离子分别为162.8和324.0；妥布霉素的母离子468.2，子离子分别为163.0和205.1；本申请人还得到其他抗生素的MRM数据：壮观霉素的母离子333.2，子离子分别为140.2和189.5；庆大霉素的母离子478.3，子离子分别为157.0和160.0；新霉素的母离子615.0，子离子分别为293.0和323.0和双氢链霉素的母离子584.3，子离子分别为246.6和263.9。
实施例1-6中使用的仪器和试剂如下：
去离子水；甲醇：HPLC级；甲酸：HPLC级；甲酸铵：HPLC级；EDTA二钠：优级纯；三氯乙酸：纯度大于99％；
标准物质：纯度大于99％，丁胺卡那霉素(CAS:37517-28-5)；妥布霉素(CAS:32986-56-4)；硫酸安普霉素(CAS:41194-16-5)；硫酸卡那霉素(CAS:560-51-9)；硫酸链霉素(CAS:3810-74-0)。
氮吹仪；涡旋仪；三重四极杆液相色谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源(ESI)；分析天平：感量0.01g；离心机：8000r/min；离心管：50mL塑料离心管；固相萃取装置；固相萃取柱；0.22μm滤膜。
实施例1：
牛尿样本中氨基糖苷类抗生素残留量的测定。
步骤S1，样品前处理
准确量取5mL牛尿至10mL聚丙烯离心管中，加入200μL 50％三氯乙酸(w/v)水溶液，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL至5mL聚丙烯离心管中，加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7。中和过程会析出大量固体，再次置于高速离心机中10000rpm离心5min，取第三上清液，待用。
步骤S2，固相萃取
采用TGA弱阳离子交换SPE柱，先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
步骤S3，标准工作溶液配制：
用经检测不含氨基糖苷类抗生素的牛尿作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液；
称取丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素标准品各10±0.01mg于同一10mL塑料容量瓶中，用空白基质溶液溶解，定容得1000.0μg/mL混合标准储备液；将混合标准储备液用空白基质溶液稀释配制成0,20,50,100,200,500,1000μg/mL系列标准工作溶液，待分析。
步骤S4，高效液相色谱串联质谱法LC-MS/MS测定
将不同浓度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进定量分析,即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中目标物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中目标物残留量。
色谱条件：
色谱柱：Xbridge BEH C18 2.1×50mm，2.5μm；含0.1％甲酸的10mmol/L甲酸铵溶液；流动相B为甲醇；流速：0.5mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；度洗脱程序为以流动相A和流动相B的体积比例为98：2，检测运行时间为10min。
质谱条件为正离子模式下采用多反应监测检测，参数为离子源温度150℃，毛细管电压为3.2kV；离子源温度为150℃；去溶剂气温度为500℃；去溶剂气流量：800L/h；锥孔气流速为150L/h；碰撞气流速为0.13mL/min。
各氨基糖苷类抗生素标品的MRM条件及相关参数如表1所示：
表1MRM检测参数表
定性鉴定：对于表1中各个氨基糖苷类抗生素的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液中保留时间一致(变化范围在±2.5％之内)；样品中目标物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质相同的标准溶液中相对丰度偏差满足欧盟657指令有关要求时，则判断该样品中存在该氨基糖苷类药物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不表1中的氨基糖苷类抗生素。
如图1-图5所示，在本发明的色谱参数和质谱条件下的丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素定位图谱。
标准工作曲线：
以基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线线性回归方程如表3所示。
表2牛尿中各氨基糖苷类抗生素的标准工作曲线
加标回收率和重复性：
选取牛尿空白样品中，分别添加1μg/mL、3μg/mL和5μg/mL浓度水平的氨基糖苷类抗生素，按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与各理论添加浓度进行比较，得到添加回收率，每个添加水平平行测定3次，得其相对标准偏差。
结果如下表4所示：
表4.牛尿中五种氨基糖苷的加标回收结果
检出限与定量限：
本发明以大于3倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为检出限(LOD)，以大10倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为定量限(LOQ)，丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的检出限分别为0.12μg/mL、0.52μg/mL、0.96μg/mL、0.18μg/mL和1.87μg/mL。丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的定量限分别为0.40μg/mL、1.74μg/mL、3.21μg/mL、0.60μg/mL和6.23μg/mL。
如图7所示，牛尿样本中丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素实际检测值为：0.52μg/mL、6.73μg/mL、未检出、2.53μg/mL和未检出
对比例1：
牛尿样本中氨基糖苷类抗生素残留量的测定。
步骤S1，样品前处理
准确量取5mL牛尿至10mL聚丙烯离心管中，加入200μL 10％三氯乙酸(w/v)水溶液，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL至5mL聚丙烯离心管中，加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7。中和过程会析出大量固体，再次置于高速离心机中10000rpm离心5min，取第三上清液，待用。
步骤S2，固相萃取
采用TGA弱阳离子交换SPE柱，先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
步骤S3，标准工作溶液配制：
用经检测不含氨基糖苷类抗生素的牛尿作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液；
称取丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素标准品各10±0.01mg于同一10mL塑料容量瓶中，用空白基质溶液溶解，定容得1000.0μg/mL混合标准储备液；将混合标准储备液用空白基质溶液稀释配制成0,20,50,100,200,500,1000μg/mL系列标准工作溶液，待分析。
步骤S4，高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定
测定方法同实施例1。
加标回收率和重复性：
选取牛尿空白样品中，添加2μg/mL浓度水平的氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液，按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与各理论添加浓度进行比较，得到添加回收率。
结果如图8所示，五种氨基糖苷类抗生素均未被检出。
对比例2：
牛尿样本中氨基糖苷类抗生素残留量的测定。
步骤S1，样品前处理
准确量取5mL牛尿至10mL聚丙烯离心管中，加入200μL10mmol/L磷酸盐溶液，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL至5mL聚丙烯离心管中，加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7。中和过程会析出大量固体，再次置于高速离心机中10000rpm离心5min，取第三上清液，待用。
步骤S2，固相萃取
采用TGA弱阳离子交换SPE柱，先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
步骤S3，标准工作溶液配制：
用经检测不含氨基糖苷类抗生素的牛尿作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液；
称取丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素标准品各10±0.01mg于同一10mL塑料容量瓶中，用空白基质溶液溶解，定容得1000.0μg/mL混合标准储备液；将混合标准储备液用空白基质溶液稀释配制成0,20,50,100,200,500,1000μg/mL系列标准工作溶液，待分析。
步骤S4，高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定
测定方法同实施例1。
加标回收率和重复性：
选取牛尿空白样品中，添加2μg/kg浓度水平的氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液，按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与各理论添加浓度进行比较，得到添加回收率。
结果如图9所示，五种氨基糖苷类抗生素均未被检出。
对比例3：
牛尿样本中氨基糖苷类抗生素残留量的测定。
步骤S1，样品前处理
准确量取5mL牛尿至10mL聚丙烯离心管中，加入200μL 75％乙腈，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL至5mL聚丙烯离心管中，加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7。中和过程会析出大量固体，再次置于高速离心机中10000rpm离心5min，取第三上清液，待用。
步骤S2，固相萃取
采用TGA弱阳离子交换SPE柱，先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
步骤S3，标准工作溶液配制：
用经检测不含氨基糖苷类抗生素的牛尿作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液；
称取丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素标准品各10±0.01mg于同一10mL塑料容量瓶中，用空白基质溶液溶解，定容得1000.0μg/mL混合标准储备液；将混合标准储备液用空白基质溶液稀释配制成0,20,50,100,200,500,1000μg/mL系列标准工作溶液，待分析。
步骤S4，高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定
测定方法同实施例1。
加标回收率和重复性：
选取牛尿空白样品中，添加2μg/mL浓度水平的氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液，按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与各理论添加浓度进行比较，得到添加回收率。
结果如图10所示，五种氨基糖苷类抗生素均未被检出。
对比例4：
牛尿样本中氨基糖苷类抗生素残留量的测定。
步骤S1，样品前处理
准确量取5mL牛尿至10mL聚丙烯离心管中，加入200μL 75％乙腈，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL至5mL聚丙烯离心管中，加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7。中和过程会析出大量固体，再次置于高速离心机中10000rpm离心5min，取第三上清液，待用。
步骤S2，固相萃取
采用TGA弱阳离子交换SPE柱，先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
步骤S3，标准工作溶液配制：
用经检测不含氨基糖苷类抗生素的牛尿作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液；
称取丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素标准品各10±0.01mg于同一10mL塑料容量瓶中，用空白基质溶液溶解，定容得1000.0μg/mL混合标准储备液；将混合标准储备液用空白基质溶液稀释配制成0,20,50,100,200,500,1000μg/mL系列标准工作溶液，待分析。
步骤S4，高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定
测定方法同实施例1。
加标回收率和重复性：
选取牛尿空白样品中，添加2μg/kg浓度水平的氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液，按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与各理论添加浓度进行比较，得到添加回收率。
结果如图11所示，五种氨基糖苷类抗生素均未被检出。
实施例1和对比例1-4实验结果表明，只有实施例1中可以检出样本中的五种氨基糖苷类抗生素，对比例1-4均无法对其进行检测。因此，本方法可对样本中的五种氨基糖苷类抗生素进行准确的定性定量检测。
实施例2：
牛奶样本中氨基糖苷类抗生素残留量的测定。
步骤S1，样品前处理
准确量取5mL牛奶至10mL聚丙烯离心管中，加入200μL 50％三氯乙酸(w/v)水溶液，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL至5mL聚丙烯离心管中，加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7。中和过程会析出大量固体，再次置于高速离心机中10000rpm离心5min，取第三上清液，待用。
步骤S2，固相萃取
采用TGA弱阳离子交换SPE柱，先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
步骤S3，标准工作溶液配制：
用经检测不含氨基糖苷类抗生素的牛奶作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液；
称取丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素标准品各10±0.01mg于同一10mL塑料容量瓶中，用空白基质溶液溶解，定容得1000.0μg/mL混合标准储备液；将混合标准储备液用空白基质溶液稀释配制成0,20,50,100,200,500,1000μg/mL系列标准工作溶液，待分析。
步骤S4，高效液相色谱串联质谱法LC-MS/MS测定
测定方法同实施例1。
测得牛奶中残留的丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的含量分别为未检出、5.30μg/g、未检出、未检出和未检出。
实施例3：
牛粪样本中氨基糖苷类抗生素残留量的测定。
步骤S1，样品前处理
称取2.00g样品(需充分冷冻干燥后粉碎)，加入10mL超纯水，振荡30min，然后在6000转速下离心10min，取第一上清液。向第一上清液中加入200μL50％三氯乙酸(w/v)水溶液，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL至5mL聚丙烯离心管中，加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7。中和过程会析出大量固体，再次置于高速离心机中10000rpm离心5min，取第三上清液，待用。
步骤S2，固相萃取
采用TGA弱阳离子交换SPE柱，先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第一上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
步骤S3，标准工作溶液配制：
用经检测不含氨基糖苷类抗生素的牛奶作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液；
称取丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素标准品各10±0.01mg于同一10mL塑料容量瓶中，用空白基质溶液溶解，定容得1000.0μg/mL混合标准储备液；将混合标准储备液用空白基质溶液稀释配制成0,20,50,100,200,500,1000μg/mL系列标准工作溶液，待分析。
步骤S4，高效液相色谱串联质谱法LC-MS/MS测定
测定方法同实施例1。
测得牛粪中残留的丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的含量分别为1.43μg/g、4.34μg/g、未检出、2.58μg/g和未检出。
实施例4：
饲料样本中氨基糖苷类抗生素残留量的测定。
步骤S1，样品前处理
称取2.00g样品(需充分冷冻干燥后粉碎)，加入10mL超纯水，振荡30min，然后在6000转速下离心10min，取第一上清液。向第一上清液中加入200μL50％三氯乙酸(w/v)水溶液，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL至5mL聚丙烯离心管中，加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7。中和过程会析出大量固体，再次置于高速离心机中10000rpm离心5min，取第三上清液，待用
步骤S2，固相萃取
采用TGA弱阳离子交换SPE柱，先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第一上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水(2:40:60,v/v/v)洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
步骤S3，标准工作溶液配制：
用经检测不含氨基糖苷类抗生素的牛奶作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液；
称取丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素标准品各10±0.01mg于同一10mL塑料容量瓶中，用空白基质溶液溶解，定容得1000.0μg/mL混合标准储备液；将混合标准储备液用空白基质溶液稀释配制成0,20,50,100,200,500,1000μg/mL系列标准工作溶液，待分析。
步骤S4，高效液相色谱串联质谱法LC-MS/MS测定
测定方法同实施例1。
饲料中以上五种氨基糖苷类抗生素均未检出。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、样品前处理：
称取粉粹后的样品，加入超纯水，震荡，第一次离心，取第一上清液；向第一上清液中加入三氯乙酸水溶液，混匀震荡，第二次离心，取第二上清液；向第二上清液中加入氢氧化钠溶液调pH值，离心，取第三上清液，待用；
S2、固相萃取：
固相萃取SPE柱依次用甲醇和水活化，取步骤S1中的第三上清液过柱处理，用乙酸铵水溶液、乙酸铵-甲醇-水溶液、乙酸铵水溶液依次淋洗，抽干，加甲酸-乙腈-水洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经滤膜过滤，即为待测样品；
S3、标准工作溶液配制：
将空白样品按上述步骤S1和S2处理得到空白样品基质溶液，用空白样品基质溶液在0～1000μg/mL范围内，配制至少五个浓度的氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液；所述氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液为含丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的混合标准工作溶液；
S4、高效液相色谱串联质谱LC-MS/MS测定：
质谱检测使用多反应监测扫描模式，丁胺卡那霉素的母离子586.2，子离子分别为323.9和425.0；链霉素的母离子582.2，子离子分别为263.7和407.7；安普霉素的母离子540.2，子离子分别为217.0和378.0；卡那霉素的母离子485.2，子离子分别为162.8和324.0；妥布霉素的母离子468.2，子离子分别为163.0和205.1；
S41定量测定：将步骤S3中混合标准工作溶液进行LC-MS/MS测定，以混合标准工作溶液的峰面积为纵坐标，以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，进行回归分析，绘制标准曲线，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤S2中的待测样品注入LC-MS/MS进行测定，测得待测样品中各氨基糖苷类抗生素的色谱峰面积，代入标准曲线，得到待测样品中氨基糖苷类抗生素的含量，然后根据待测样品所代表试样的质量计算得到样品中氨基糖苷类抗生素的残留量；
S42定性测定：检测步骤S2中待测样品中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质标准溶液的相对丰度偏差满足欧盟657指令的要求时，则判断该样品中存在该种目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤S1中，所述样品前处理的具体方法为：称取2g样品，加入超纯水10mL，振荡30min，然后在6000转速下离心10min，取第一上清液5mL；向第一上清液加入200μL 50％三氯乙酸w/v水溶液，用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL；向第二上清液中加入适量2M NaOH水溶液调节pH值至6-7，离心，取第三上清液，待用。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤S1中，所述固相萃取的具体方法为：先用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样，上样结束后采用3mL 5mM乙酸铵(乙酸调节pH 4.8)水溶液、3mL 5mM乙酸铵用乙酸调节pH 4.8-80％甲醇/水溶液、3mL 5mM乙酸铵用乙酸调节pH 4.8水溶液依次淋洗，淋洗结束后减压抽干1～2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水2:40:60,v/v/v洗脱，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
4.如权利要求3所述的测定方法，其特征在于：所述固相萃取小柱为TGA萃取小柱。
5.如权利要求4所述的测定方法，其特征在于：所述第三上清液通过所述TGA萃取小柱中流速不大于0.3mL/min。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤S4中，高效液相色谱的色谱条件如下：
色谱柱为Xbridge BEH C18 2.1×50mm，2.5μm；流动相A为含0.1％甲酸的10mmol/L甲酸铵溶液；流动相B为甲醇；流速为0.5mL/min；进样量为5μL；柱温为30℃；等度洗脱程序为以流动相A和流动相B的体积比例为98：2洗脱10min。
7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤S4中，质谱检测使用电喷雾质谱检测，离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多重反应监测；毛细管电压为3.2kV；离子源温度为150℃；去溶剂气温度为500℃；去溶剂气流量：800L/h；锥孔气流速为150L/h；碰撞气流速为0.13mL/min。
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