CN109828071B - 一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，特点是包括以下步骤：（1）目标物经水溶液提取后，通过大粒径硅藻土柱可实现水的快速吸附，乙腈作为洗脱液逐级渗入，替换掉水溶液的同时，完成了9种常见注水类药物及代谢物的同步净化、浓缩过程；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备；（3）经Hypersile Gold C18色谱柱，乙腈‑水为流动相梯度洗脱，通过采集目标物的高准确度质量数并自动触发二级，从而实现9种目标物的快速筛查；（4）通过基质标准曲线计算待测物浓度，优点是一次前处理完成水溶性药物的同时提取、净化、浓缩过程，检测灵敏度高、重现性、分辨率高且可操作性强。

Description

一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，尤其是涉及一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法。

背景技术

我国作为猪肉消费大国，肉制品的安全直接关系到民生建设，国家及监管部门对猪肉安全监测也愈加重视。近些年，出现的“注水肉”问题与不法分子使用新型注水药有直接关系，主要包括：阻断 M 胆碱受体的抗胆碱药（阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱）、局部麻醉药类（普鲁卡因、利多卡因），抗组胺类药物（异丙嗪）和肾上腺素受体激动药（肾上腺素及其代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸）。其中，阻断 M 胆碱受体的抗胆碱药能够抑制牲畜腺体分泌，使其因干渴大量饮水从而增加其重量，牟取暴利。抗组胺类药物（异丙嗪），作为一种镇定剂，能兴奋摄食中枢，增加动物采食和饮水而增加体重；另外，同时与肾上腺素共同使用产生“肾上腺素作用翻转”现象，使得血管舒张作用充分表现，实现最大限度增加注水量。局部麻醉药类（普鲁卡因、利多卡因）可降低猪肉宰杀和运输过程中挣扎导致的脱水。非法使用此类药物会使其原形和代谢产物不可避免地残留于动物源食品中，食品后会对人体中枢神经系统等造成不良影响。目前有关猪肉注水类药物的测定方法还较少，尚无同时测定猪肉基质中9种注水类药物及其代谢物的文献报道。已有文献多是按照某一类药物建立的，适应范围单一，大部分研究局限于法医学方面。因此，建立猪肉中多类注水药的高通量筛查方法，对提高监管工作效率、保障猪肉食品安全具有重要的意义。

注水类药物检测主要涉及两方面技术：前处理技术和仪器分析。由于动物源性食品种类多、基质复杂，标准方法和文献报道多数采用固相萃取柱净化，其步骤复杂、实验成本高。例如，王海燕等对畜肉中5种阿托品类药物残留量同时筛查，前处理采用磷酸盐缓冲溶液超声提取，MCX SPE小柱净化；胡海山等对动物源性食品中镇静剂类药物残留量测定，用乙腈作为提取液，Oasis HLB 固相萃取柱净化；另外，段科等对生肉中的阿托品类进行检查，乙腈超声提取后正己烷除油净化。乙腈作为提取液，对上述水溶性物质的提取，特别是猪肉体内水滞留性药物的提取效果不佳，不能保证强极性化合物的回收率。如何把极性物质从水溶液中有效提取出来，这始终是一个艰巨的挑战。

目前，仪器方法主要涉及液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-串联质谱联用法等。国内外检测低浓度水平的药物残留通常采用的检测方法为LC-MS/MS法和 GC-MS法，其中 LC-MS/MS 法数据通量大，无需衍生化且定性能力强，是一种灵敏度与和选择性极高的检测手段。随着质谱的发展和推广，一次进样完成多类残留分析已成为可能。药物残留正逐渐由液相色谱-三重四级杆质谱（LC-MS/MS）目标型检测向高分辨质谱（HRMS）进行精确质量非目标型全扫描检测转变。传统的LC-MS/MS在定量分析上具有优势，但分析化合物数量有限，只能针对方法中涵盖的物质，并需要逐个进行参数优化，耗时且对基质干扰敏感，相应的前处理也就更为复杂；而且分辨率低，不能有效区分相对分子质量相近的化合物，会造成假阳性结果等。全扫描高分辨质谱仪则不需要待测化合物的特征离子碎片，直接采集高准确度质量数（m/z 200，分辨率70，000），对待测样品进行全扫描并自动触发二级，需要增加目标化合物时，不必再次进样，重新分析已有的全扫描数据即可。在高分辨率下采集的数据降低了近似质量数的干扰，更好地避免了假阳性的发生。通过多级扫描，建立二级谱图数据库，特别适合高通量的检测筛查。目前，国内外还没有公开一种同时检测猪肉中上述9种注水类药物残留的方法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，该方法一次前处理完成水溶性药物的同时提取、净化、浓缩过程，检测灵敏度高、重现性、分辨率高且可操作性强。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理

将待测样品按5g：10 mL的比例加入到提取液中，振荡、超声各4-6 min，4000-5000r/min下离心4-6 min；取8-12mL水相上填充量为1000 mg的硅藻土柱后平衡5 min，然取10mL乙腈过硅藻土柱，洗脱2-3次，收集洗脱液并加入0.5 mL二甲基亚砜，用乙腈定容至20mL；取出10 mL，氮吹后用纯水定容至1.0 mL，过0.22 μm 滤膜，待分析；

（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A．混合标准溶液组成：

混合标准溶液1包括：0.5 ug/mL肾上腺素、0.5 ug/mL 4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和1.0 ug/mL 3,4-二羟基扁桃酸；混合标准溶液2包括：0.01 ug/mL异丙嗪、0.01 ug/mL阿托品、0.01 ug/mL山莨菪碱、0.01 ug/mL东莨菪碱、0.01 ug/mL普鲁卡因和0.01 ug/mL利多卡因；

B．基质标准曲线定量：

在空白样品中分别加入上述两种混合标准溶液1：0 μL，10 μL，20 μL，50 μL，100μL，加入上述混合标准溶液2：5.0 μL，10 μL，50 μL，100 μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据，其中响应值=标准品峰面积/标准品质量；

（3）色谱条件与质谱条件

A．色谱柱：Hypersile Gold C18，柱温40℃；流动相A：含有0.1%甲酸的水溶液；流动相B：乙腈溶液，梯度见下表1；进样量为10 μL，洗脱总时间为10 min，流动相流速为0.3mL/min；

表1 正、负离子模式HPLC洗脱程序

；

B．质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-500，分辨率70000，自动增益控制目标值5×10⁵；4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸采用负离子模式2700 V，其余成分则采用正离子模式3800 V，离子传输管温度为300 ℃，鞘气压（N₂）35arb，辅助气压（N₂）10 arb，气化室温度350℃；二级采用自动触发模式，分辨率35000， 自动增益控制目标值2×10⁵，碰撞能量范围25%-40%，保留时间采集范围：根据色谱图中各个目标物质的保留时间值±1.0 min；

（4）浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式得到：X=2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L

V— 定容体积，单位为mL；

m－试样体积或质量，单位为g。

步骤（1）中所述的提取液的配制方法如下：将草酸溶于水配制成浓度为8.6 g/L的草酸溶液，用氨水调pH至4.0。

步骤（1）中取10mL水相上填充量为1000 mg的硅藻土柱。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，建立了猪肉中常见的9种注水类药物：肾上腺素及代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸，异丙嗪，阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因的快速分析方法。目标物经水溶液提取后，通过大粒径硅藻土柱可实现水的快速吸附，乙腈作为洗脱液逐级渗入，替换掉水溶液的同时，完成了9种常见注水类药物及代谢物的同步净化、浓缩过程，经Hypersile Gold C18 (100 mm×2.1 mm 1.9 μm) 色谱柱，乙腈-水（0.1%甲酸）为流动相梯度洗脱，通过采集目标物的高准确度质量数并自动触发二级，从而实现9种目标物的快速筛查。结果表明，本方法对猪肉基质具有较强的适用性，肾上腺素及代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸的线性范围为5.0～50 ng/mL，定量限为5.0 μg/kg，另一代谢物3,4-二羟基扁桃酸的线性范围为10～100 ng/mL，定量限为20 μg/kg，其他待测物线性范围为0.05～1.0 ng/mL，定量限为0.05 μg/kg。加标回收率在80.7%～99.1%之间，相对标准偏差低于10%。该方法对水溶性化合物兼容性强，灵敏度高，重现性好，分辨率高，适应于猪肉中常见的9种注水类药物的快速筛查。

附图说明

图1为本发明9种注水药的提取离子色谱图；

图2为乙腈洗脱体积对9种注水类药物回收率的影响；

图3为9种注水类药物在猪肉基质中各自浓度范围内的标准曲线图， 其中a：肾上腺素；b：4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸；c：3,4-二羟基扁桃酸；d：异丙嗪；e：阿托品；f：山莨菪碱；g：东莨菪碱；h：普鲁卡因；i：利多卡因。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

1、仪器与试剂

Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（赛默飞世尔科技ThermoFisherScientific公司），配有H-ESI II源。液相色谱系统为UltiMate 3000高压液相色谱，配有自动进样器。色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)。Milli-Q高纯水发生器 (美国Millipore公司)。硅藻土柱型号为 Chromabond XTR (1000 mg)。

标准品购自Sigma和Dr . Ehrenstorfer公司，纯度≥95%。二甲基亚砜（分析纯）购自南京化学试剂一厂。色谱纯甲酸购自美国 Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为色谱纯，购自德国Merck公司。实验用水为Milli-Q超纯水（18.2 ΩM·cm）。

2、提取净化流程

基质样品来自国家猪肉残留监控抽样和进出口送检企业。

称取5.00 g样品，加入10 mL提取液，振荡、超声各4-6 min，4000-5000 r/min下离心5 min；取水层上样，平衡5 min，用10 mL乙腈上柱洗脱2次，下接50 mL离心管，并加入0.5mL二甲基亚砜，乙腈定容至20 mL；取出10 mL，氮吹后用纯水定容至1.0 mL，过0.22 μm 滤膜，待分析。其中提取液的配制方法为将草酸溶于水配制成浓度为8.6 g/L的草酸溶液，用氨水调pH至4.0。

3、混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A．混合标准溶液组成：

混合标准溶液1包括：0.5 ug/mL肾上腺素、0.5 ug/mL 4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和1.0 ug/mL 3,4-二羟基扁桃酸；混合标准溶液2包括：0.01 ug/mL异丙嗪、0.01 ug/mL阿托品、0.01 ug/mL山莨菪碱、0.01 ug/mL东莨菪碱、0.01 ug/mL普鲁卡因和0.01 ug/mL利多卡因；

B．基质标准曲线定量：

在空白样品中分别加入上述两种混合标准溶液1：0 μL，10 μL，20 μL，50 μL，100μL，加入上述混合标准溶液2：5.0 μL，10 μL，50 μL，100 μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据，其中响应值=标准品峰面积/标准品质量；

空白样品按照上述前处理方法处理，得到的基质液中加入上述9种混合标准溶液，根据各自检出限浓度配置基质加标曲线，以浓度为横坐标，作为样品待测物浓度定量的依据。

4、色谱条件与质谱条件

色谱柱：Hypersile Gold C18 (100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，柱温40℃。流动相A：含有0.1% 甲酸水溶液；流动相B：乙腈溶液，梯度见下表1。进样量为10 μL，洗脱总时间为10min，流动相流速为0.3 mL/min。

表1 正、负离子模式HPLC洗脱程序

；

质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-500，分辨率70000，自动增益控制（AGC）目标值5×10⁵；4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸采用负离子模式2700 V，其余成分则采用正离子模式3800 V，离子传输管温度为300 ℃，鞘气压（N₂）35 arb，辅助气压（N₂）10 arb，气化室温度350℃；在样品运行前对仪器分别进行正、负离子校正；二级采用自动触发模式，分辨率35000， AGC目标值2×10⁵，碰撞能量范围25%-40%，保留时间采集范围：根据一级色谱图中各个目标物质的保留时间值±1.0 min。

5、定性、定量分析

定性分析：精确质量误差低于5×10^-6，同时比对保留时间、同位素分布、主要二级碎片和二级质谱图相似度，综合判断后得到准确的定性结果，避免假阳性的出现。部分标准物质图谱见图1。

二、结果与讨论

1、提取液的选择

考虑到猪肉特殊基质成分和9种化合物都有较好的水溶性性质，而且化学结构中均含有碱性基团，所以选择酸化的水溶液进行提取：既可以提取到9种待测的注水类物质，又可以防止脂肪过多的被提取出来，降低脂肪的干扰。

2、提取剂的添加量对柱子填料的影响

提取液的添加量要充分考虑柱子的填料含量，本发明选择的硅藻土柱型号为Chromabond XTR (1000 mg)，分别比较了上样量为5 mL，8 mL，10 mL，12 mL，15 mL时柱子的负载情况，在上样量达到12 mL和15 mL的时候，柱子已达到饱和并渗出，水溶液的渗出会导致最后的氮吹浓缩过程大大延长。另外，当上样量为5 mL和8 mL的时候，柱子的填料未充分浸入水溶液，大大降低了柱子的利用率，同时对于9种待测药物本就很低的检出限量来说，也增加了仪器检出的难度。因此，最终将上样体积确定为10 mL。

3、洗脱体积的优化

水相提取液上样后，纯乙腈作为洗脱液，通过乙腈的逐级渗入，注水类药物按照极性强度依次从饱和的硅藻土柱上洗脱下来。实验中分别考察乙腈作为洗脱溶剂的添加量10mL, 10 mL*2和10 mL*3对待药物回收率的影响。由图2可知，当乙腈体积为10 mL*2和10mL*3时，提取率趋于稳定，9种待测注水类药物在猪肉中的回收率均平稳地保持在80% 以上。从节约氮吹浓缩的时间和成本的角度出发，确定纯乙腈作为洗脱液的洗脱体积为10mL*2。

4、仪器条件优化

参照9种待测化合物的电离性质，通过流动注射泵连续进样，对每种待测注水类药物的单标溶液进行全扫描，确定每种化合物的电离方式和分子离子峰。其中4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸采用 ESI^- 模式，其余化合物均采用 ESI⁺ 模式。在分别输入各目标化合物的分子式，由软件计算精确分子式，可将待分析的样品的质谱扫描图谱以工作站软件进行自动解析，软件综合各种同位素丰度匹配比例，各种加合离子（如加H^＋、加Na^＋、加K^＋、二聚体、脱水峰、各种中性丢失），计算结果中某种精确质量数对应的可能的中性分子式组合，获得每个化合物的分子离子峰后，进行二级质谱扫描，优化碰撞能量，获得碎裂片段。通过与建立的目标数据库中化合物的分子式、碎裂片段质量数、并结合色谱保留时间，来筛查是否包含数据库中待测化合物，从而实现目标注水类药物的快速筛查。

在流动相中加入0.1%甲酸能增加正离子检测模式下物质的电离效率, 促进 [M+H]⁺ 离子生成，因此针对正离子模式下检测的药物，添加了0.1%甲酸，同时也进一步考察了乙酸铵缓冲液离子强度的影响，乙酸铵溶液浓度从2mmol/L变化到10 mol/L，结果表明，无论是在正离子模式还是负离子模式，凡是含有0.1%甲酸的溶液均可以获得了最佳的色谱峰形、分离效果和质谱信号响应。从减小仪器污染的角度出发，本发明最终采用含有0.1%甲酸水溶液作为最终流动相，全过程选择梯度洗脱方式，通过优化流动相梯度洗脱条件实现了9种待测物的有效分离（图谱见图1）。

5、加标回收结果分析

分别准确移取适量混合标准工作液，用前处理后的空白样品基质液稀释，配制成不同浓度的系列基质匹配标准溶液，待测定。以测得峰面积y为纵坐标，对应的标准溶液浓度x为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。结果表明，肾上腺素及其代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸在5.0～50 ng/mL浓度范围内，另一代谢物3，4-二羟基扁桃酸在10～100 ng/mL浓度范围内，其他药物（异丙嗪，阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因）在0.05～1.0 ng/mL浓度范围内，各自呈现良好的线性关系，相关系数 r ² 均大于0.990可以满足定量分析的要求（图3）。加标回收率在80.7%～99.1%之间，相对标准偏差低于10%。用基质提取液添加低水平的标准溶液（肾上腺素及代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸为5.0 μg/kg，另一代谢物3,4-二羟基扁桃酸为20 μg/kg，其他待测物为0.05 μg/kg），获得每种待测物对应信噪比S/N ≥10时的含量，以此为该化合物的定量限(LQD)（表2）。结果表明，该方法灵敏度高，操作简便，适用于猪肉中注水类药物残留的快速筛查。

表2 9种注水类药物在猪肉中的添加浓度、线性方程及其回收率范围的实验数据(n=6)

。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品前处理

将待测样品按5g：10 mL的比例加入到提取液中，振荡、超声各4-6 min，4000-5000 r/min下离心4-6 min；取8-12mL水相上填充量为1000 mg的硅藻土柱后平衡5 min，然取10 mL乙腈过硅藻土柱，洗脱2-3次，收集洗脱液并加入0.5 mL二甲基亚砜，用乙腈定容至20 mL；取出10 mL，氮吹后用纯水定容至1.0 mL，过0.22 μm 滤膜，待分析；

（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备

A．混合标准溶液组成：

混合标准溶液1包括：0.5 μg/mL肾上腺素、0.5 μg/mL 4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和1.0μg/mL 3,4-二羟基扁桃酸；混合标准溶液2包括：0.01 μg/mL异丙嗪、0.01 μg/mL阿托品、0.01 μg/mL山莨菪碱、0.01 μg/mL东莨菪碱、0.01 μg/mL普鲁卡因和0.01 μg/mL利多卡因；

B．基质标准曲线定量：

在空白样品中加入上述混合标准溶液1：0 μL，10 μL，20 μL，50 μL，100 μL，加入上述混合标准溶液2：5.0 μL，10 μL，50 μL，100 μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；

（3）色谱条件与质谱条件

A．色谱柱：Hypersil Gold C18，柱温40℃；流动相A：含有0.1%甲酸的水溶液；流动相B：乙腈溶液，梯度见下表1；进样量为10 μL，洗脱总时间为10 min，流动相流速为0.3 mL/min；

表1 正、负离子模式HPLC洗脱程序

；

B．质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100-500，分辨率70000，自动增益控制目标值5×10⁵；4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸采用负离子模式2700V，其余成分则采用正离子模式3800 V，离子传输管温度为300 ℃，鞘气压35 arb，辅助气压10 arb，气化室温度350℃；二级采用自动触发模式，分辨率35000， 自动增益控制目标值2×10⁵，碰撞能量范围25%-40%，保留时间采集范围：根据色谱图中各个目标物质的保留时间值±1.0 min；

（4）浓度计算方法

样品中待测物的含量根据如下计算公式得到：X=2*C*V/m，式中：

X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L；

V— 定容体积，单位为mL；

m－试样质量，单位为g。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，其特征在于步骤（1）中所述的提取液的配制方法如下：将草酸溶于水配制成浓度为8.6 g/L的草酸溶液，用氨水调pH至4.0。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测猪肉中9种注水类药物残留的方法，其特征在于步骤（1）中取10mL水相上填充量为1000 mg的硅藻土柱。

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