CN105738516B - 一种以生物胺为特征标志物鉴别蜂毒种类的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物胺作为特征标志物在鉴别蜂毒种类中的应用，还涉及利用生物胺作为特征标志物采用HPLC/MS/MS手段鉴别蜂毒种类的方法，该方法以组织胺、多巴胺、五羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素中的一种或多种为特征标志物，能够精准地用于鉴别意大利蜜蜂蜂毒、王浆高产蜜蜂蜂毒、安纳托利亚蜜蜂蜂毒、高加索蜜蜂蜂毒、卡尼鄂拉蜜蜂蜂毒、喀尔巴阡蜜蜂蜂毒中的一种或多种，此种鉴别方法能够高效、稳定、准确的鉴别六种蜂毒，对于加强蜂毒种类鉴别的研究，探索蜂毒溯源信息，以及开发我国传统中医药物，提高我国蜂毒质量，保证消费者健康具有重要意义。

Description

一种以生物胺为特征标志物鉴别蜂毒种类的方法

技术领域

本发明涉及蜜蜂分析技术领域，尤其涉及一种以生物胺为特征标志物鉴别蜂毒种类的方法。

背景技术

蜂毒一种由蜜蜂的毒腺和副毒腺分泌，存储在毒囊中的有毒液体。当处于危险境况中，蜜蜂即会通过毒针将蜂毒液射入人体或者捕食者体内，这种毒液很容易使人体产生过敏反应，严重时危及生命。蜂毒含有活性酶、多肽、碳水化合物、脂质、氨基酸和胺类等多种活性化合物，因此具有抗癌、防辐射、抗菌、消炎和抗突变等多种药理学性质和生物活性。传统中医中，人们成功地使用蜂毒疗法减轻由类风湿、多发性硬化症关节炎等引起的慢性疼痛。近几年，关于蜂毒能够阻碍白细胞迁移从而抑制局部炎症，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肾上腺皮质激素分泌和改善微循环的集体效应已被发现，因此蜂毒已被广泛用于某些免疫相关疾病、肿瘤、肌肉骨骼疼痛等疼痛疾病的治疗。

组织胺、多巴胺、五羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素等生物胺是蜂毒中一类重要化合物。组胺大部分由组氨酸在肥大细胞中脱羧形成，参与中枢和外周神经系统的多种生理功能。多巴胺在脑部分泌，在下丘脑和垂体部位发挥作用，是一种神经递质。90％以上的5-羟色胺由肠嗜铬细胞释放，是一种强力的血管收缩剂和平滑肌兴奋剂。组胺、多巴胺和五羟色胺分别在中枢神经系统和周边神经系统中负责不同部门的工作，并且在抑郁症治疗中发挥关键作用。肾上腺素和去甲肾上腺素在肾上腺髓质中合成，肾上腺素去甲基化后形成去甲肾上腺素，在缓解频率心动过缓，低血压和呼气性呼吸困难中起到协同作用。生物胺除了存在于在蜂毒中，作为生物活性因子还以较低含量广泛存在于诸如麻黄和吴茱萸等中草药中。此外，生物胺以较高的含量存在于被污染的奶酪、水果、酒、蔬菜和海产品等食品中，造成严重毒性风险。

与蜂毒肽或酶的含量相比，蜂毒中生物胺的含量相对低。但是，在蜂毒摄入人体时所引起的疼痛、瘙痒和过敏等反应却与这类低分子含氮化合物密切相关。组胺能够促进平滑肌和骨骼肌收缩从而引起疼痛。研究表明，当一个名为A11的多巴胺受体被破坏时，慢性疼痛得到缓解，从而间接证明了多巴胺在疼痛调解中发挥作用。下调五羟色胺的2A受体可以减弱患者腰椎间盘突出症的坐骨神经痛，表明五羟色胺具有加强肌肉疼痛的功能。去甲肾上腺素与α1肾上腺素受体结合能够加剧疼痛，引起损伤或者炎症等。蜂蛰人时会引起疼痛、瘙痒、肿胀等过敏反应，但是关于蜂毒中生物胺含量与蜂蜇时的疼痛程度以及不同蜂种蜂毒的研究几乎没有。

目前，国内已有的研究报道中测定生物样品或者食品样品中生物胺的方法以色谱耦合电子捕获检测器、紫外检测器或者荧光检测器的方法居多。

电子捕获检测器属于浓度型检测器，需要化合物带有强电负性才能够有信号响应，而各种生物胺的电负性相对较弱，所以电子捕获检测器对于生物胺的敏感度并不高，同时电子捕获检测器的线性范围较窄，不适合含量跨度比较大的化合物检测。

紫外检测器由入射光强和投射光强的比例来确定化合物，属于专属性检测器，只对有紫外可见吸收的药物有用，使用简单，成本低，线性范围宽，耐用性好，但是生物胺类化合物均无紫外吸收，不能直接采用紫外检测器进行定性定量分析。

相对于紫外检测器而言，荧光检测器的灵敏度可以通过增加入射光的强度而得到大幅度提高，但是生物胺类化合物并没有荧光特性，也不能直接应用检测。所以在生物胺的检测中，当采用紫外检测器或荧光检测器时，需要通过衍生化使其带上发光基团，才能够被检测到。衍生化虽然可以大大地提高灵敏度，但是衍生化过程操作繁琐、耗时长，并且需要丹磺酰氯、OPA、DMQC-QSU、CNBF、NQS、AQC等有毒衍生化试剂，有危害实验人员身体健康的危险。

此外由于蜂毒样品量非常小，并且采集过程中容易产生蜂蜇等危险，所以目前国内外尚没有关于蜂毒分类的研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷和不足，发现生物胺可作为特征标志物用于鉴别不同种类蜂毒，在此基础上，还提供了具体的鉴别方法，此种鉴别方法能够高效、稳定、准确的鉴别六种蜂毒，对于加强蜂毒种类鉴别的研究，探索蜂毒溯源信息，以及开发我国传统中医药物，提高我国蜂毒质量，保证消费者健康具有重要意义。

本发明的技术方案之一是：生物胺作为特征标志物在鉴别蜂毒种类中的应用。

所述生物胺为组织胺、多巴胺、五羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素中的一种或多种。

所述蜂毒为意大利蜜蜂蜂毒、王浆高产蜜蜂蜂毒、安纳托利亚蜜蜂蜂毒、高加索蜜蜂蜂毒、卡尼鄂拉蜜蜂蜂毒、喀尔巴阡蜜蜂蜂毒中的一种或多种。

具体地，根据其中一种生物胺的含量即可达到区分六种蜂毒中几种蜂毒的目的，例如：根据去甲肾上腺素的含量可准确的区分上述六种蜜蜂蜂毒；根据组织胺的含量可区分安纳托利亚蜜蜂蜂毒；根据多巴胺的含量可区分意大利蜜蜂蜂毒、高加索蜜蜂蜂毒、喀尔巴阡蜜蜂蜂毒；根据肾上腺素的含量可区分安纳托利亚蜜蜂蜂毒和卡尼鄂拉蜜蜂蜂毒。

进一步地，根据蜂毒中两种或两种以上生物胺的含量可以更加精准的区分各种蜜蜂蜂毒，例如：根据蜂毒中组织胺和多巴胺的含量可将采自意大利蜜蜂、王浆高产蜜蜂的蜂毒与采自安纳托利亚蜜蜂、高加索蜜蜂、卡尼鄂拉蜜蜂和喀尔巴阡蜜蜂的蜂毒加以区分；根据蜂毒中组织胺、多巴胺、生物胺、五羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素可以更加精准的区分出上述六种蜂毒。

现有技术并未报道过以生物胺为特征标志物来对蜂毒种类进行鉴别的相关技术，以生物胺作为特征标志物鉴别不同种类蜂毒具有简单、快速、准确、稳定的优势。

本发明的技术方案之二是：一种以生物胺为特征标志物鉴别蜂毒种类的方法，包括如下步骤：

(1)配制标准工作液：取适量生物胺标准物质溶于纯水中，配制成1ng/mL～1000ng/mL不同浓度梯度的多个标准工作液；

(2)制备待测样品溶液：取适量待测蜂毒样品溶于水中，涡旋处理后取上清液即得；

(3)采用HPLC/MS/MS方法检测待测样品溶液和标准工作液：采用单点校准或多点校准法对蜂毒中的生物胺进行定性分析和定量分析。

其中，所述生物胺标准物为组织胺、多巴胺、五羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素中的一种或多种。

所述蜂毒为意大利蜜蜂蜂毒、王浆高产蜜蜂蜂毒、安纳托利亚蜜蜂蜂毒、高加索蜜蜂蜂毒、卡尼鄂拉蜜蜂蜂毒、喀尔巴阡蜜蜂蜂毒中的一种或多种。

如前所述，单独通过一种生物胺即可实现蜂毒的初步区分，例如单独通过去甲肾上腺素即可区分开上述六种蜂毒，即去甲肾上腺素可以作为区分上述六种蜂毒的特征标志物，此种情况下，标准工作液的配制方法为：取适量去甲肾上腺素标准物质溶于纯水中，配制成1ng/mL～1000ng/mL不同浓度梯度的多个标准工作液。所述浓度梯度的个数可采用本领域常用量，优选为3-10个，进一步优选为7个，最优选地，不同的浓度梯度分别为1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL。

采用多种生物胺能够更加精准的区分各种蜂毒，此种情况下，按如下方式配制标准工作液：取等量生物胺标准物质同时溶于纯水中，配制混合标准工作液。也就是说，混合标准工作液中，各生物胺的浓度相同。所述浓度梯度的个数可采用本领域常用量，优选为3-10个，进一步优选为7个，最优选地，不同的浓度梯度分别为1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL。

优选地，所述待测样品溶液采用如下方法制备得到：每5.0mg样品加入1-3mL纯水，涡旋5-15min，离心后取上清液备用。

进一步优选地，每5.0mg样品加入2mL纯水，涡旋10min，1000rpm离心后取上清液备用。

样品预处理结束后，针对不同的生物胺种类，采用直接取上清液进样分析或将上清液用纯水稀释或将上清液浓缩后再进样分析的手段对上清液进行进一步的处理，以确保待测物的响应值在标准曲线范围内，确保定量准确。例如，各个生物胺的标准曲线范围为1ng/mL～1000ng/mL，且采用上述优选方式对蜂毒样品进行处理时，在检测组织胺和多巴胺时，由于蜂毒中二者含量较高，需要对上清液采用纯水进行稀释(稀释的倍数约为20-30倍，优选为25倍)，避免仪器出现超载导致定量不准确的问题；在检测肾上腺素、去甲肾上腺素、五羟色胺时，则直接采用上清液进样。

本发明对蜂毒样品预处理仅采用纯水作为溶剂，对环境友好，对人体无危害，且样品预处理步骤简单，便于操作。

所述HPLC条件为：采用PFP色谱柱，按照体积比为1-5：95-99、60-80：20-40的0.05％-0.15％甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱；

优选地，采用PFP色谱柱，按照体积比为3：97、70:30的0.1％甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱；

进一步优选地，采用PFP色谱柱，0-4min，按照体积比为3：97，4-6min，按照体积比70:30的0.1％甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱。

为了进一步确保鉴定结果的准确度，更好的区分各种蜂毒，所述HPLC还包括如下检测条件：柱温：25～35℃；流速：0.2～0.5mL/min；进样量：4.0-6.0μL；优选地，柱温30℃，流速0.3mL/min，进样量5.0μL。

所述MS/MS的检测参数为：

所述MS/MS还包括如下检测条件：雾化器温度：300～400℃；雾化器流速：5-8L/min；雾化器压力：30～40psi；毛细管电压:1800～2200V；鞘流气温度：320～380℃；鞘流气流速：8～10L/min；锥孔电压:800～1200V；

优选地，雾化器温度：350℃；雾化器流速：6L/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压:2000V；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：9L/min；锥孔电压:1000V。

进行单点校准分析时，根据待测样品溶液中待测物质的含量，选择峰面积相近的混合标准工作液和样品溶液等体积掺差进样，进行定性定量分析。

进行多点校准分析时，利用上述多个混合标准工作液首先绘制标准工作曲线，然后检测待测样品，根据峰面积积分值定量。

所述定性分析为通过色谱保留时间与质谱选择离子共同定性，具体为：待测物质与标准物质的保留时间相对偏差不大于1％，且子离子的相对丰度的差异不大于10％。

采用上述样品预处理及检测方法，所述组织胺、多巴胺、五羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素具有极低的检出限，分别为0.09ng/g，0.17ng/g，0.1ng/g，0.17ng/g，0.14ng/g。

同时，还具有极低的定量限，分别为0.31ng/g，0.59ng/g，0.3ng/g，0.56ng/g，0.45ng/g。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。

本发明具有的优势是：

(1)首次提出以生物胺作为特征标志物对不同种类蜂毒进行鉴别，并建立了鉴别方法；

(2)只选用环境友好试剂纯水溶解样品并对目标化合物进行提取，操作简便，鉴定结果准确；

(3)根据不同的生物胺种类选择不同的浓度进样，确保测定结果精准可靠；

(4)由于去甲肾上腺素热稳定性较差，在离子源内易失水，所以选用m/z 152.1作为母离子进行定性定量分析；

(5)流动相水相中需要加入甲酸，为待测物提供酸性环境，提高离子化效率；

(6)在分析过程中，只有含有两个子离子，且相对丰度的差异不大于10％，保留时间相对偏差不大于1％情况下才认定含有待测物，鉴别更加精准；

(7)由于蜂毒中含有大量的内源性物质，采用其他检测手段(例如液相色谱非质谱检测器)时，内源性物质的存在容易干扰蜂毒中生物胺的定性和定量分析，本发明采用液相色谱串联质谱这种特异性的检测器能够很好的解决上述问题。

附图说明

图1组织胺(His)、多巴胺(DA)、五羟色胺(5-HT)、肾上腺素(E)和去甲肾上腺素(NE)的MRM图谱；

图2为不同蜂种的蜂毒中组织胺含量的盒图；

图3为不同蜂种的蜂毒中多巴胺含量的盒图；

图4为不同蜂种的蜂毒中五羟色胺含量的盒图；

图5为不同蜂种的蜂毒中肾上腺素含量的盒图；

图6为不同蜂种的蜂毒中去甲肾上腺素含量的盒图。

图2-图6中，Yi代表意大利蜜蜂蜂毒，JF代表王浆高产蜜蜂蜂毒，AN代表安纳托利亚蜜蜂蜂毒，G代表高加索蜜蜂蜂毒，K代表卡尼鄂拉蜜蜂蜂毒，KR代表喀尔巴阡蜜蜂蜂毒。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

实施例1

(1)配制标准贮备液：分别准确称取10.0mg组织胺、多巴胺、五羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素，置于10mL容量瓶中，用纯水溶解并定容，充分摇匀，即得1.0mg/mL的标准贮备液，密封，-4℃保存(可稳定保存6个月)。

(2)配制混合标准工作液：取适量各标准贮备液于同一容量瓶中，用纯水稀释定容，配制成以下系列标准工作液：1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL，100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL，密封，置4℃冰箱中保存备用(可稳定保存1个月)。

(3)蜂毒样品前处理：称取蜂毒样品5.0±0.1mg，置于5mL具塞离心管中，加入2mL纯水，涡旋10min混匀，1000rpm离心后从离心管中吸取部分上清液或将上清液稀释之后备用。

(4)绘制标准工作曲线：采用HPLC/MS/MS法对混合标准工作液进行检测，检测结果如表3所示，检测条件如下：

流动相：A相：0.1％的甲酸水，B相：甲醇溶液；洗脱条件见表1：

表1 液相梯度洗脱表

PFP色谱柱，柱温为30℃；流速为0.3mL/min；进样量为2.0μL；雾化器温度：350℃,雾化器流速：6L/min,雾化器压力35psi,毛细管电压:2000V,鞘流气温度:350℃,鞘流气流速:9L/min,锥孔电压:1000V。标准物的母离子、子离子、传输电压、碰撞能量见表2：

表2 质谱参数

表3 方法标准曲线线性范围、相关系数、添加回收率范围、相对标准偏差、检测限、定量限

组织胺的回归方程为：y＝5240.63x+73560.2；多巴胺的回归方程为：y＝18406.03x+420191.7；五羟色胺的回归方程为：y＝25170.17x+336638.0；肾上腺素的回归方程为：y＝8312.64x+7425.3；去甲肾上腺素的回归方程为：y＝17176.48x+8212.5。

(5)采用步骤(4)的方法对待测样品进行检测，其中，检测组织胺和多巴胺时，采用稀释25倍后的上清液进样；检测五羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素时，直接采用上清液进样。检测结果如表4所示：

表4 六种蜂毒中组织胺、多巴胺、五羟色胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的含量

备注：待测样品为来自不同蜂场蜜蜂的蜂毒，对其分别检测后，各种生物胺的含量有所差异，表4列出的是6种蜂毒中各生物胺的含量范围。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种以生物胺为特征标志物鉴别蜂毒种类的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配制标准工作液：取适量生物胺标准物质溶于纯水中，配制成1ng/mL～1000ng/mL不同浓度梯度的多个标准工作液；

所述生物胺为组织胺、多巴胺、五羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素；

(2)制备待测样品溶液：取适量待测蜂毒样品溶于水中，涡旋处理后取上清液即得；

(3)采用HPLC/MS/MS方法检测待测样品溶液和标准工作液：采用单点校准或多点校准法对蜂毒中的生物胺进行定性分析和定量分析；

所述HPLC条件为：采用PFP色谱柱；

流动相：A相：0.1％的甲酸水，B相：甲醇溶液；梯度洗脱条件如下：

所述MS/MS的检测参数为：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按如下方式配制标准工作液：取等量生物胺标准物质同时溶于纯水中，配制混合标准工作液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多个标准工作液为3-10个。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多个标准工作液为7个。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标准工作液的浓度梯度分别为1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL。

6.根据权利要求1-2、4-5任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品溶液采用如下方法制备：每5.0mg样品加入1-3mL纯水，涡旋5-15min，离心后取上清液备用。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样品溶液采用如下方法制备：每5.0mg样品加入2mL纯水，涡旋10min，1000rpm离心后取上清液备用。

8.根据权利要求1-2、4-5、7任一项所述的方法，其特征在于：所述HPLC还包括如下检测条件：柱温：25～35℃；流速：0.2～0.5mL/min；进样量：4.0-6.0μL；

和/或，所述MS/MS还包括如下检测条件：雾化器温度：300～400℃；雾化器流速：5-8L/min；雾化器压力：30～40psi；毛细管电压:1800～2200V；鞘流气温度：320～380℃；鞘流气流速：8～10L/min；锥孔电压:800～1200V。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述HPLC还包括如下检测条件：柱温30℃，流速0.3mL/min，进样量5.0μL；

和/或，所述MS/MS还包括如下检测条件：雾化器温度：350℃；雾化器流速：6L/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压:2000V；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：9L/min；锥孔电压:1000V。

10.根据权利要求1-2、4、5、7、9任一项所述的方法，其特征在于：所述蜂毒为意大利蜜蜂蜂毒、王浆高产蜜蜂蜂毒、安纳托利亚蜜蜂蜂毒、高加索蜜蜂蜂毒、卡尼鄂拉蜜蜂蜂毒、喀尔巴阡蜜蜂蜂毒中的一种或多种。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述蜂毒为意大利蜜蜂蜂毒、王浆高产蜜蜂蜂毒、安纳托利亚蜜蜂蜂毒、高加索蜜蜂蜂毒、卡尼鄂拉蜜蜂蜂毒、喀尔巴阡蜜蜂蜂毒中的一种或多种。