CN104458988B

CN104458988B - 一组生物标志物的测定方法

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Publication number: CN104458988B
Application number: CN201410705215.3A
Authority: CN
Inventors: 曹文卿; 静平; 李建军; 林黎明; 杨桂朋; 封立平
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CN104458988A

Abstract

本发明公开了一组生物标志物的测定方法，包括以下步骤：（1）提取与净化；（2）标准工作溶液的配制；将空白样品按上述步骤（1）处理，用该空白样品基质溶液在2～100？μg/L范围内，配制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定。本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于动物组织及尿液中生物标志物的含量的定性确证和定量检测，方法回收率在74.2%～106.2%之间，平均相对标准偏差（RSD）为6.4%～13.0%，检出限为20.0？μg/kg,定量限为50.0μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。

Description

一组生物标志物的测定方法

技术领域

本发明涉及一组生物标志物的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定性定量测定生物组织或尿液品中的生物标志物含量的方法，属于生物标志物测定技术领域。

背景技术

近年来，随着溴氰菊酯使用范围的不断扩大，溴氰菊酯的毒理研究亦从单纯的选择低等生物为实验对象研究神经毒性作用机制，扩展到对哺乳动物的三致作用、代谢过程等多层次的研究。为评估其生态风险，需要发展用于生物亚致死效应的指示参数来更为准确地评估和预测其对环境生物的毒害情况许多研究者首先从生物化学方面探索反应污染物对生物早期的影响参数，其中生物标志物法因为测定指标全面、准确且系统，而得到普遍认可。生物标志物通常分为三类：即暴露标志物、效应标志物和易感性标志物。在选择合适的生物标志物时，有时需要综合分析，权衡利弊，采取一组综合的评价指标。

溴氰菊酯，分子式C₂₂H₁₉Br₂NO₃，分子量505.20，结构式如下：

因其在人体内代谢十分迅速，目前技术很难检测出尿中的原型；1R,3R-二溴菊酸[(1R-cis)-3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylicacid]和3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoicacid，3-PBA)是溴氰菊酯分子的两个组成部分，3-苯氧基苯甲酸是多种菊酯农药相同的代谢产物，同时检测1R,3R-二溴菊酸与3-苯氧基苯甲酸可能成为溴氰菊酯特异性的代谢标志物。

国内研究通过观察小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与精母细胞染色体崎变率等发现溴氰菊酯具有致突变性，国外研究结果也表明：溴氰菊酯具有致癌、致畸与致突变性。溴氰菊酯的毒作用研究多集中于神经毒性、免疫毒性、肝脏毒性与内分泌毒性等，但近年来，其对DNA的毒作用已经引起了学者们的广泛关注；中毒体征、常规理化、传统DNA形态学分析方法已不能满足在分子水平进行研究的需要，检测技术上推陈出新日显迫切。在溴氰菊酯的毒作用机理中，活性氧损伤机制受到众多学者的认可。

活性氧在生物体内可以造成多种DNA氧化性损伤，形成多种形式的碱基加合物、碱基丢失、DNA断裂或交联等DNA生物标志物，这些损伤引起DNA功能的抑制和结构的改变，从而使DNA中遗传信息的稳定性受到不同程度的破坏。

活性氧攻击DNA可形成二十几种修饰碱基，其中8-羟基脱氧鸟苷化学性质稳定，被认为是反映DNA氧化损伤灵敏和稳定的指标之一，可以作为内源及外源因素对DNA氧化损伤的生物标志物，当基因组中出现高含量的8-羟基脱氧鸟苷时，特异性糖基酶完全修复DNA损伤的能力丧失；8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是活性氧自由基氧化细胞核DNA或线粒体DNA后形成的产物。作为较理想的DNA氧化损伤作用的生物标志物，8-OH-dG引起了生态毒理学和生物医学界的广泛兴趣。

另外，烷化损伤是DNA损伤的另一种方式，在DNA中最易被烷化的是鸟嘌呤，鸟嘌呤氧6位甲基化，形成6-甲氧基鸟嘌呤。6-甲氧基鸟嘌呤则是烷基化学物诱导产生重要的DNA突变前损伤产物，如不能及时修复，则有致癌性的危险。

单胺类神经递质含量变化是反映颅内神经代谢的较敏感指标，单胺类递质包括儿茶酚胺和吲哚胺两类。儿茶酚胺类主要有肾上腺素(EP)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)及其产物，吲哚类主要指5-羟基色胺(5-HT)。5-羟基色胺(5-HT)是一种重要的神经递质和信号分子，5-HT在中枢及外周神经系统中都发挥重要作用。在中枢神经系统，5-HT能影响人的睡眠、情绪、行为、认知等；在外周，5-HT能调节血管收缩与舒张、胃肠蠕动、细胞增殖及凋亡、血小板聚集等。有研究表明，有关污染物暴露实验动物实验中，发现较多的污染物可作用于哺乳动物的神经系统，并表现为兴奋性神经毒性，并可影响包括5-HT在内的单胺类神经递质及其代谢产物的水平。5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)是由5-HT在单胺氧化酶(MAO)作用下转化而来的。人及动物体液中5-HIAA含量的测定对于对多种疾病的诊断、治疗及机理研究有重要价值，有研究表明转移性癌症患者尿中5-HIAA显著增高。另外5-HIAA作为5-HT的主要代谢产物，对其排泄量的测定可以反映体内5-HT的量，因此两者的含量或者其含量比均可作为重要的生物标志物，对类癌、精神-神经性疾病、消化系统粘膜损伤、肝功能损伤以及由于污染物暴露评估或生态毒理导致的以上疾病的诊断、评估具有重要价值。

对于生物标志物的检测目前大多采用针对单一组分，不同检测技术，分别检测的模式，不利于污染物暴露评估需要多指标综合评估的需求。

本发明根据溴氰菊酯对动物染毒暴露后可能形成的多种生物标志物，结合溴氰菊酯的特异性代谢产物，采用液相色谱/串联质谱建立同时测定尿液和动物组(脑、肝等)包括1R,3R-二溴菊酸[(1R-cis)-3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylicacid]、3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoicacid，3-PBA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、6-甲氧基鸟嘌呤、5-羟基色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺、肾上腺素、3-硝基丙酸、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、维生素C等组合生物标志物的检测方法。为溴氰菊酯食品安全以及环境毒理学暴露评估提供简便、快速、准确的检测技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种同时测定尿液和动物组(脑、肝等)包括1R,3R-二溴菊酸[(1R-cis)-3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylicacid]、3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoicacid，3-PBA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、6-甲氧基鸟嘌呤、5-羟基色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺、肾上腺素、3-硝基丙酸、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、维生素C等组合生物标志物的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

(1)前处理

提取与净化

动物肉、动物肉样品经均质制样机充分粉碎(-20℃避光保存)；动物尿样品冰箱中(-20℃避光保存)，样品使用前避光解冻。

a)动物肉样品：称取样品(2.00±0.01)g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min。8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气吹至近干；用乙腈水(1:9)定容至1mL，定溶液涡旋后转移至2mLEP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析；

b)肝脏样品：称取样品(2.00±0.01)g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min。8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气浓缩至2mL左右，加入5×2mL乙腈饱和正己烷脱脂2次，离心，将弃去正己烷后的提取液继续40℃下氮气浓缩至近干；用乙腈：水(1:9)定容至1mL，涡旋后转移至2mLEP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS进样分析；

c)尿液样品：用移液枪取1.0mL动物尿样品于50mL聚丙烯离心管中，用甲酸铵缓冲液调节至中性，加入10μL抗氧剂和1mL甲醇，涡旋30s后8000r/min离心5min，转出上清液，加5mL正己烷脱脂2次后，加载至事先用甲醇和水活化好的HLB小柱，接取流出样液，4℃12000r/min离心10min，吸取上清液进棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析。

(2)标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤(1)处理，用该空白样品基质溶液在2～100μg/L范围内，配制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；

(3)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定

将步骤(2)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(1)中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中生物标志物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中生物标志物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中生物标志物含量。

步骤(1)中样品若为动物组织样品，需加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一转移至聚丙烯离心管中，加入提取液和抗氧剂溶液，涡旋后用细胞破碎仪超声提取，基质分散固相萃取剂由十八烷基硅烷键合相(C₁₈)组成，每克样品中C18加入量为50mg。申请人研究发现，加入十八烷基硅烷键合相能够对非极性干扰物进行有效吸附萃取。

优选的，步骤(1)中提取溶液为含易挥发有机酸的乙腈水溶液，本发明提供了一种甲酸乙腈水溶液，三者的体积比为1:949:50。该提取液的组成兼顾了极性与非极性目标物能够同时提取，而且提前效果好。

步骤(1)中抗氧剂由维生素C(VC)组成，对于生物组织样品每克样品中抗氧剂加入量为5μL，对于动物尿液每mL样液抗氧剂加入量为10μL。加入抗氧剂可以防止还原性目标化合物在提取净化过程中被氧化。

步骤(1)中采用高速冷冻离心法净化提取所得上清液，离心温度不高于4℃，转速不低于10000r/min，所得上清液氮气吹至近干而非全干，氮吹时水浴锅温度不可太高，例如低于40℃，低温操作有利于目标化合物的稳定，高速冷冻离心有利于脂类杂质的沉降。

骤(1)中样品净化过程中氮吹至近干后，定容液乙腈-水的比例与初始流动相一致。浓缩时吹得过干会影响某些目标物的回收率。

步骤(1)中样品净化过程中定溶液涡旋后不过膜，而是转移至小体积EP管(例如2mLEP管)中，低温下高速离心(例如4℃12000r/min离心10min，但不仅限于此)后，吸取上层清液至棕色进样小瓶供HPLC-MS/MS分析。不过滤膜是防止膜吸收某些目标物，因为目前没找到哪种滤膜其兼容性适用于极性变化范围这样大的一组化合物。

步骤(1)中尿液样品处理过程中为：用移液枪取1.0mL动物尿样品于50mL聚丙烯离心管中，用甲酸铵缓冲液调节至中性，加入抗氧剂和1mL甲醇，涡旋30s后4℃下8000r/min离心5min，转出上清液，加5mL正己烷脱脂2次后，加载至事先用甲醇和水活化好的固相萃取小柱(所用小柱为HLB小柱)，接取流出样液，4℃下12000r/min离心10min，吸取上清液进棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析。

步骤(3)中液相色谱的流动相A为：乙腈；流动相B：0.1％的甲酸水溶液(甲酸-水(1：1000)，V/V)。液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序见下表。

步骤(3)中液相色谱的色谱柱填料为C18(2)，粒径为3μm。

步骤(3)中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压：+5500V&-4500V；电离方式：ESI⁺&ESI^-；正负离子同时扫描；离子源温度：550℃；雾化气压力：0.31MPa；气帘气压力：0.207MPa；辅助气压力：0.369MPa。

步骤(3)中质谱检测使用多反应监测(MRM)扫描模式，各生物标志物的母、子离子及MRM监测条件见下表。

12种生物标志物的MRM设定条件

步骤(3)中检测所述提取液中各生物标志物的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且样液(样品)中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当空白基质标准溶液的相对丰度偏差不超过30％时，则判定该样品中该种生物标志物的存在；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种标志物。

生物标志物是毒理学的前沿研究内容，我们在研究开发生物标志物种类的同时，还必须充分评价这些生物标志物的应用价值，比较分析这些标志物的优缺点。

暴露生物标志物的选择及可行性分析：暴露生物标志物一般依靠测定体液和组织中特定化合物或者其代谢物，或者与生物分子相互作用形成的产物。由于溴氰菊酯体内代谢十分迅速，不适宜于作为暴露评估的目标化合物，而其代谢产物1R,3R-二溴菊酸与3-苯氧基苯甲酸相对稳定，可作为溴氰菊酯的体内剂量暴露生物标志物，可指示机体经化学品暴露的程度，但并不能提供由此引起毒害效应程度的信息，必须和其他生物标志物形成组合生物标志物，综合反映其真实剂量的生化机制和毒害效应的相关性。

反应或毒性效应生物标志物的选择和可行性分析：在机体对化学物质暴露的生化反应中，较为有用的病理变化标志物如能精确指示受损害的器官、组织或者细胞器的标志物是适用于连续暴露的生物标志物。8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、6-甲氧基鸟嘌呤、5-羟基色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺、肾上腺素等均表现出与所研究的生物学现象的关联性，并呈现剂量-效应，和时间效应关系，所以可综合作为溴氰菊酯的毒性效应生物标志物。

本发明的有益效果在于：本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于动物组织及尿液中溴氰菊酯代谢产物1R,3R-二溴菊酸[(1R-cis)-3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylicacid]、3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoicacid，3-PBA)、以及8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、6-甲氧基鸟嘌呤、5-羟基色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)等12种生物标志物的含量的定性确证和定量检测，方法回收率在71.2％～106.2％之间，平均相对标准偏差(RSD)为6.4％～13.0％，检出限为50.0μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。在某种程度上满足毒理学分析的生物标志物检测的技术要求，将为评估机体对化学物质暴露的生化反应中，利用较为有用的病理变化标志物精确指示受损害的器官、组织或者细胞器。这些适用于连续暴露的生物标志物以及组合生物标志物可为预先诊断生物组织受损的损坏程度提供一定的技术支撑。必须和其他生物标志物形成组合生物标志物，综合反映其真实剂量的生化机制和毒害效应的相关性。

具体实施方式

实施例1兔肉中生物标志物含量的检测

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂API4000Q型四极杆串联质谱仪配电喷雾离子源(美国AB公司)；Agilent1100液相色谱仪(美国Agilent公司)；漩涡振荡混合器(美国Thermo公司)；sigma低温离心机(美国Sigma公司)；旋转蒸发浓缩仪(德国Heidolph公司)；Gilson移液器(法国Gilson公司)；氮吹仪(美国Jic公司)；超纯水器Mili-Q(美国Millipone公司)；十八烷基硅烷键合相(C18)净化剂(40～60μm)购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。

试剂：甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲酸、乙酸、均购置于迪马公司，分别为农残级和液相色谱纯；氢氧化钠、盐酸、乙酸铵均为分析纯，水用Mili-Q超纯水仪制备。

抗氧剂：用纯水配制10g/L的VC溶液，4℃避光保存，有效期为一周；甲酸铵缓冲液：1mol/L的甲酸铵溶液，用氨水和甲酸调节pH为5.5左右。

标准物质：纯度为99.7％，购自Sigma公司。

(1)样品前处理

提取与净化

a)兔肉、兔肉样品经均质制样机充分粉碎(-20℃避光保存)；兔尿样品冰箱中(-20℃避光保存)，样品使用前避光解冻。

b)兔肉样品：称取样品(2.00±0.01)g，加0.1gC₁₈吸附剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min。8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气吹至近干；用乙腈水(1:9)定容至1mL，定溶液涡旋后转移至2mLEP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析；(2)标准工作溶液的配制

分别称取各种生物标志物标准品10.0mg于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成1.0g/L的标准储备液；以上标准储备液均于-20℃保存，实验中用甲醇稀释上述标准储备液，配制成不同浓度的混合标准工作液，于4℃保存。

标准储备液通过精确称取标准品用适当溶剂配制：3-苯氧基苯甲酸、1R,3R-二溴菊酸用乙腈溶解定容；8-羟基脱氧鸟苷、6-甲氧基鸟嘌呤用0.2％甲酸水溶解；3-硝基丙酸、5-羟基色胺、5-羟吲哚乙酸、肾上腺素、多巴胺等分别用甲醇水(1:1,V/V)溶解定容；配制成浓度为100mg/L储备液(-20℃避光保存)；储备液进一步用相应溶剂稀释成10mg/L的中间溶液(-20℃避光保存)；5-羟基色胺、肾上腺素、多巴胺等不稳定物质须避光保存。其中5-羟基色胺、肾上腺素、多巴胺储备液有效期为半年；肾上腺素、多巴胺中间液有效期为一个月。

称取2.0g兔肉空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成10、20、50、100、200、500、1000ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。(3)液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定

分析仪器为AB4000Q-TRAPHPLC-MS/MS.

其中色谱条件为：

色谱柱：PhenomenexLunaC18(2)，(2.0mm×150mm，3.0μm)；柱温：25℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL。流动相：A为乙腈，B为10mM甲酸铵-0.1％(v/v)甲酸-水溶液。梯度洗脱程序：0～3min，5％A；3～7min，5％～90％A；7～9min，90％A；9.2～17min，5％A。

电离方式：ESI⁺&ESI^-；采集模式：MRM；离子源温度：550℃；雾化气压力：0.31MPa；气帘气压力：0.207MPa；辅助气压力：0.369MPa；电喷雾电压：+5500V&-4500V。

提取溶液：0.1％甲酸乙腈水溶液(1:949:50，体积比)。

流动相A：乙腈；流动相B：水(0.1％甲酸,V/V)。

液相色谱的流动相为A：乙腈；流动相B：0.1％的甲酸水溶液(甲酸-水(1：1000),V/V)。其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测(MRM)扫描；

有关各目标分析物MRM的具体设置条件见表2。

定性鉴定：对于目标物的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致(变化范围在±2.5％之内)；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在该种目标物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标物。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

加标回收率和重复性：

在空白兔肉中加入3个浓度水平的标志物标准溶液，然后分别进行前处理待添加30min后按上述处理步骤进行含量测定，将测定浓度与标志物理论添加浓度进行比较，得到农药生物标志物的添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，

测定结果见表3。

方法学验证

线性关系：配制12种生物标志物质量浓度分别为0、10、30、100、500μg/L的系列混合标准溶液。以目标组分的峰面积(y)对质量浓度(x)作标准曲线，结果表明，分析物在0～500μg/L范围内具有较好的线性关系，相关系数大于0.999，方法定量下限(S/N＝10)均低于50μg/L。

在空白兔组织基质(兔肉、兔肝、兔脑)和空白兔尿中分别添加50、100、200μg/L3个水平的混合标准溶液，按前述试验方法技能型测定，相关数据见下表。

生物标志物回归方程与相关系数、添加回收率与精密度

由上表可以看出，在3个加标水平上，生物标志物的平均回收率为71.2％～106.2％，平均相对标准偏差(RSD)为6.4％～13.0％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

检出限：

将不同浓度的基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限，12种生物标志物的检出限为20μg/kg；定量限为50.0μg/kg。

实际样品测定：

使用该检测方法对喂毒的试验兔子的肉，尿液等10多个样品进行了检测。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一组生物标志物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取与净化

样品制备动物肉、动物肝样品经均质制样机充分粉碎，-20℃避光保存；动物尿样品冰箱中-20℃避光保存，样品使用前避光解冻：

a）动物肉样品：称取样品2.00±0.01g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气吹至近干；用1:9的乙腈：水定容至1mL，定容液涡旋后转移至2mLEP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析；

b）肝脏样品：称取样品2.00±0.01g，加基质分散固相萃取剂研磨至色泽均一，转移至50mL聚丙烯离心管中，准确加入10mL提取液和10μL抗氧剂溶液，涡旋10s后用细胞破碎仪超声提取5min，8000r/min离心5min，将上清液转移至另一洁净聚丙烯离心管中；残渣加入5mL提取液，重复提取一次，合并上清液，将合并后的上清液4℃10000r/min离心5min，所得上清液于40℃下氮气浓缩至2mL左右，加入乙腈饱和正己烷脱脂2次，离心，将弃去正己烷后的提取液继续40℃下氮气浓缩至近干；用1:9的乙腈：水定容至1mL，涡旋后转移至2mLEP管中，4℃12000r/min离心10min，吸取上层清液至棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS进样分析；

c）尿液样品：用移液枪取1.0mL动物尿样品于50mL聚丙烯离心管中，用甲酸铵缓冲液调节至中性，加入10μL抗氧剂和1mL甲醇，涡旋30s后8000r/min离心5min，转出上清液，加5mL正己烷脱脂2次后，加载至事先用甲醇和水活化好的HLB小柱，接取流出样液，4℃12000r/min离心10min，吸取上清液进棕色进样小瓶，HPLC-MS/MS分析；

（2）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）处理，用该空白样品基质溶液在2～100μg/L范围内，配制至少三个浓度的生物标志物系列浓度标准工作液；

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（2）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（1）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中生物标志物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中生物标志物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中生物标志物含量；

步骤（1）中基质分散固相萃取剂是十八烷基硅烷键合相（C₁₈），每克样品中C18加入量为50mg；

步骤（1）中提取溶液为含易挥发有机酸的乙腈水溶液；

步骤（1）中抗氧剂是维生素C；

步骤（3）中液相色谱的流动相A为乙腈；流动相B为体积比是0.1%的甲酸水溶液；

步骤（3）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序是：

；

步骤（3）中液相色谱的色谱柱填料为C18，粒径为3μm；步骤（3）中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压：+5500V&-4500V；电离方式：ESI⁺&ESI^-；正负离子同时扫描；离子源温度：550℃；雾化气压力：0.31MPa；气帘气压力：0.207MPa；辅助气压力：0.369Mpa；

所述的生物标志物是1R,3R-二溴菊酸、3-苯氧基苯甲酸、8-羟基脱氧鸟苷、6-甲氧基鸟嘌呤、5-羟基色胺、5-羟吲哚乙酸、3-硝基丙酸、多巴胺、肾上腺素、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、维生素C。