CN101551362A

CN101551362A - 一种同时检测食品中15种同化激素残留的液相色谱法

Info

Publication number: CN101551362A
Application number: CNA2009100274566A
Authority: CN
Inventors: 王洪新; 戴军; 许婷婷; 马朝阳; 吕文平
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Shanghai Guochu Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2009-05-07
Filing date: 2009-05-07
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2029-05-07
Also published as: CN101551362B

Abstract

本发明涉及一种检测动物源食品中同化激素药物残留的液相色谱法，特征是先取样：动物肌肉组织剔除脂肪及结缔组织，剁碎，研磨均匀，称取样品；提取：称取的样品用甲醇超声提取同化激素提取液；将提取液用旋转蒸发仪水浴蒸干，用甲醇水溶液溶解残渣；净化：提取液上C₁₈固相萃取柱进行固相萃取；上机测定：滤液用反相高效液相色谱测定，并用外标法－峰面积定量，再经二元梯度洗脱。本发明所检测样品为复杂生物样品：所建立的方法在约1小时时间可完成一次检测，简便快速、灵敏可靠且成本低，比已有的GC或HPLC方法同时分析的兽用激素药物种类多，操作较简便；比已有的GC/MS及LC/MS或LC/MS/MS方法成本低，溶剂毒性低。

Description

一种同时检测食品中15种同化激素残留的液相色谱法

技术领域

本发明公开了一种同时检测动物源食品中同化激素药物残留的高效液相色谱法。

背景技术

激素是生物体内产生的一类调节机体代谢生理功能的微量物质，兽药用同化激素主要包括：甾类同化激素，非甾类雌性激素以及β₂-受体激动剂。三者均有强的蛋白质同化作用，可提高蛋白质沉积，降低脂肪比率，从而提高饲料转化率。然而，长期摄入此类激素类药物会导致消费者内分泌紊乱和性早熟，增加致癌、致畸的风险。早在1988年1月1日欧盟就发出了禁止使用促生长同化激素，我国农业部也于1988年6月30日发布的《兽药管理条例实施细则》中规定“不得添加激素类药品”。但近年来，先后发生过我国出口的鸡肉含有己烯雌酚、鳗鱼等含有避孕药事件，一度造成外贸活动中断；同时由于全球饲料价格的上涨，有些养殖户受经济利益的驱动，非法使用这类禁药有可能进一步严重化。

国内外对同化激素多残留检测的测定方法主要有：GC、HPLC、GC-MS、LC-MS-MS。检测样品主要是血浆、尿液和水。同时检测药物种类少，还没有甾类同化激素和β₂-受体激动剂同时检测方法的研究。对于复杂生物样品，多种激素药物残留检测技术还处于探索研究阶段。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种简便快速、灵敏可靠，且成本低的检测动物源食品中同化激素药物残留的液相色谱法。

按照本发明提供的技术方案，一种同时检测动物源食品中15种同化激素药物残留的液相色谱法包含如下步骤：

取样：动物肌肉组织剔除脂肪及其他结缔组织，剁碎，研磨均匀，称取样品；

提取：称取的样品用甲醇超声提取同化激素；动物肌肉组织质量与甲醇分析纯A.R，质量体积比g/mL为1∶2～1∶9，提取2～4次，每次超声提取时间为0.25～1h，得到同化激素提取液；将提取液用旋转蒸发仪在35～60℃水浴蒸干，用体积分数20％～60％甲醇水溶液溶解残渣；

净化：提取液上C₁₈固相萃取柱进行固相萃取；先用甲醇、水活化C₁₈固相萃取小柱；再将样品提取液以1～4mL/min的速度过该固相萃取柱；然后用体积分数25％～50％甲醇水溶液淋洗小柱；最后用体积分数60％～95％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液；洗脱液用氮气吹干，用体积分数20％～50％甲醇水溶液定容至1mL，过0.45μm滤膜后供HPLC分析；

上机测定：滤液用反相高效液相色谱测定，并用外标法-峰面积定量，色谱柱为C18柱，色谱柱柱温为20～40℃；紫外检测波长为240nm；流动相：A相为乙腈，B相为0.003～0.007mol/L庚烷磺酸钠水溶液；二元梯度洗脱：0min，A，B两相体积比为40∶60；5min，A相由40％线性升至47％；15min，A相由47％线性升至50％；25min，A相由50％线性升至65％；30min，A相由65％线性升至75％，保持12min，进样体积为5μl。

所述同化激素为动物源食品中雌三醇、雌二醇、雌酮、炔雌醇、睾酮、甲基睾酮、丙酸睾酮、群勃龙、诺龙、孕酮、醋酸甲羟孕酮、己烷雌酚、己烯雌酚、莱克多巴胺和克伦特罗。

本发明的优点：本发明所检测样品为复杂生物样品：牛肉，鸡肉，猪肉，同时检测甾类同化激素和β₂-受体激动剂的15种代表性兽用激素药物。所用的试剂或药品纯度均为分析纯A.R或色谱纯。所建立的方法在约1小时时间可完成一次检测，简便快速、灵敏可靠且成本低，比已有的GC或HPLC方法同时分析的兽用激素药物种类多，操作较简便；比已有的GC/MS及LC/MS或LC/MS/MS方法成本低，溶剂毒性低，仪器较普及，利于推广应用。

附图说明

图1为本发明十五种动物源同化激素标准品同时检测的HPLC谱图(标准品色谱分离图)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：本发明一种同时检测动物源食品中15种同化激素药物残留的液相色谱法，采用以下步骤：

取样：将剔除脂肪及其他结缔组织后的牛肉切碎并用食品粉碎机绞成匀浆状；

提取：研磨均匀后的牛肉用甲醇超声提取同化激素；牛肉质量与甲醇分析纯A.R质量体积比(m/v，g/mL)比为1∶6，提取2次，每次提取时间为0.5h，得到同化激素提取液；将提取液用旋转蒸发仪在40℃水浴蒸干，用一定量20％(v/v)甲醇水溶液溶解残渣；

净化：C₁₈固相萃取柱用3mL甲醇，5mL水活化后将样品提取液以2mL/min的速度过C₁₈柱，等样液全部流出后，用3mL35％(V/V)甲醇水溶液淋洗小柱，弃去淋洗液；再用3mL60％(v/v)甲醇水溶液洗脱。收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干，用20％(v/v)甲醇水溶液定容至1mL，过0.45μm滤膜后HPLC测定。

上机测定：用反相高效色谱外标法-峰面积定量测定。液相色谱条件为：色谱柱为C₁₈柱，柱温35℃，紫外检测波长240nm，流动相：A相为乙腈；B相为0.004mol/L庚烷磺酸钠水溶液，二元梯度洗脱：0min，A，B两相体积比为40∶60；5min，A相由40％线性升至47％；15min，A相由47％线性升至50％；25min，A相由50％线性升至65％；30min，A相由65％线性升至75％，保持12min。

实施例2：本发明一种同时检测动物源食品中15种同化激素药物残留的液相色谱法，采用以下步骤：

取样：将剔除脂肪及其他结缔组织后的鸡脯肉切碎并用食品粉碎机绞成匀浆状；

提取：研磨均匀后的鸡脯肉用甲醇超声提取同化激素；鸡肉质量与甲醇分析纯A.R质量体积比(m/v，g/mL)比为1∶3，提取3次，每次提取时间为0.75h，得到同化激素提取液；将提取液用旋转蒸发仪在48℃水浴蒸干，用一定量35％(v/v)甲醇水溶液溶解残渣；

净化：C₁₈固相萃取柱用3mL甲醇，3mL水活化后将样品溶解液以3mL/min的速度过C₁₈柱，等样液全部流出后，用3mL 50％(v/v)甲醇水淋洗小柱，弃去淋洗液；再用2m L80％(v/v)甲醇水溶液洗脱。收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干，用35％(v/v)甲醇水溶液定容至1mL，过0.45μm滤膜后HPLC测定。

上机测定：用反相高效色谱外标法-峰面积定量测定。液相色谱条件为：色谱柱为C₁₈柱，柱温25℃，紫外检测波长240nm，流动相：A相为乙腈；B相为0.006mol/L庚烷磺酸钠水溶液，二元梯度洗脱：0min，A，B两相体积比为40∶60；5min，A相由40％线性升至47％；15min，A相由47％线性升至50％；25min，A相由50％线性升至65％；30min，A相由65％线性升至75％，保持12min。

实施例3：本发明一种同时检测动物源食品中15种同化激素药物残留的液相色谱法，采用以下步骤：

取样：将剔除脂肪及其他结缔组织后的猪腿肉切碎并用食品粉碎机绞成匀浆状；

提取：研磨均匀后的猪腿肉用甲醇超声提取同化激素；猪腿肉质量与甲醇分析纯A.R质量体积比(m/v，g/mL)为1∶4，提取4次，每次提取时间为0.25h，得到同化激素提取液；将提取液用旋转蒸发仪在55℃水浴蒸干，用一定量50％(v/v)甲醇水溶液溶解残渣；

净化：C₁₈固相萃取柱用3mL甲醇、5mL水活化后将样品溶解液以2.5mL/min的速度过C₁₈柱，等样液全部流出后，用3mL25％(v/v)甲醇水淋洗小柱，弃去淋洗液；再用3mL 95％(v/v)甲醇水溶液洗脱。收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干，用50％(v/v)甲醇水溶液定容至1mL，过0.45μm滤膜后HPLC测定。

上机测定：用反相高效色谱外标法-峰面积定量测定。液相色谱条件为：色谱柱为C₁₈柱，柱温40℃，紫外检测波240nm，流动相：A相为乙腈；B相为0.005mol/L庚烷磺酸钠水溶液，二元梯度洗脱：0min，A，B两相体积比为40∶60；5min，A相由40％线性升至47％；15min，A相由47％线性升至50％；25min，A相由50％线性升至65％；30min，A相由65％线性升至75％，保持12min。

测定结果：根据上述方法，得到十五种同化激素(雌三醇、雌二醇、雌酮、炔雌醇、睾酮、甲基睾酮、丙酸睾酮、群勃龙、诺龙、孕酮、醋酸甲羟孕酮、己烷雌酚、己烯雌酚、莱克多巴胺、克伦特罗)标准物质的液相色谱图，见附图1。15种同化激素在0.5～8mg/L范围内线性关系良好。方法的检出限(S/N＝3)为0.012～0.079mg/Kg，定量限为0.041～0.265mg/Kg。方法的平均加标回收率为66.1～101.9％，相对标准偏差(RSD)为2.1～12.4％。

如附图1所示：雌三醇(EST，99.0％)、雌二醇(ES，97.5％)、雌酮(ESN，99.0％)炔雌醇(EES，99.5％)、睾酮(TS，99.0％)、甲基睾酮(MTS，98.5％)、丙酸睾酮(PTS，99.0％)、群勃龙(TRE，97.0％)、诺龙(NT，99.5％)、孕酮(PG，99.5％)、醋酸甲羟孕酮(99.0％)、己烷雌酚(HES，98.5％)、克伦特罗(CLB，99.5％)、己烯雌酚(DES，99.5％)以上14种来自德国Augsburg公司；莱克多巴胺(RAC，95％)来自Sigma公司。

对被测定的动物肉样品，并不是都含有上述激素残留。但只要含有上述十五种同化激素残留，且含量高于本方法的检出限及符合本方法的定量范围内均可以被检出。

Claims

1、一种同时检测食品中15种同化激素残留的液相色谱法，其特征是：包含如下检测步骤：

上机测定：滤液用反相高效液相色谱测定，并用外标法-峰面积定量，色谱柱为C18柱，色谱柱柱温为20～40℃；紫外检测波长为240nm；流动相：A相为乙腈，B相为0.003～0.007mol/L庚烷磺酸钠水溶液；二元梯度洗脱：0min，A，B两相体积比为40∶60；5min，A相由40％线性升至47％；15min，A相由47％线性升至50％；25min，A相由50％线性升至65％；30min，A相由65％线性升至75％，保持12min，进样体积为5～100μl。

2、根据权利要求1所述的一种同时检测食品中15种同化激素残留的液相色谱法，其特征在于所述同化激素为动物源食品中雌三醇、雌二醇、雌酮、炔雌醇、睾酮、甲基睾酮、丙酸睾酮、群勃龙、诺龙、孕酮、醋酸甲羟孕酮、己烷雌酚、己烯雌酚、莱克多巴胺和克伦特罗。