CN104849377A - 一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法，研究了气相色谱-质谱测定畜禽肉中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的简便、高效、准确的前处理技术。将绞碎的肉样品用5%高氯酸超声波提取，再以10000r/min离心15min后，上清液用WCX固相萃取柱进行富集净化，衍生化后检测。4种兴奋剂在50-1000μg/L的范围具有良好线性，相关系数在0.995以上，加标回收率在84.32～103.15%之间，RSD在1.35～4.78%之间，避免了假阳性结果的出现，并且其最低检出限和加标回收率符合目前国内外检测要求。

Description

一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法

技术领域

本发明涉及一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法。

背景技术

特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺属于β-肾上腺素能受体兴奋剂，均具有促进动物体内营养物质由脂肪组织向肌肉组织转移的作用。但是动物在食用含特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的饲料后，会造成药物在肌肉及组织中不同程度的残留，人体过量的摄入这种药物会发生中毒等毒副作用，另外还可引起代谢紊乱，对糖尿病人可发生酸中毒或酮中毒。因此很多国家对此类药物的最高残留量都有严格规定，由于近年来我国加大了对克伦特罗使用的监管力度，有些不法分子转而非法使用特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺，影响了我国的畜禽产品的安全，严重威胁了人民的生命健康。因此对于研究猪肉为代表的动物组织中同时测定特布他林、沙丁胺醇莱、克多巴胺，克伦特罗4种β-兴奋剂的检测技术具有重大而深远的现实意义。传统的处理方法在提取过程中一般采用三种以上的溶剂，容易造成目标物的损失，实验的准确度低，步骤多，并且会造成环境的污染。

发明内容

本发明主要解决现有技术所存在的技术问题，从而提供一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法。

本发明是一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法，仪器包括：气相色谱--质谱联用仪、高速冷冻离心机、固相萃取小柱WCX、SCX、MCX、固相萃取装置和氮吹仪；试剂包括：高氯酸、甲醇、氨水、甲苯、N,O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺即BSTFA和纯度≥98%的标准品。

作为优选，所述气相色谱--质谱联用仪为安捷伦7890-5975C相色谱--质谱联用仪，色谱、质谱结构精准。

作为优选，所述标准品包括沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、硫酸特布他林和莱克多巴胺，为四种β-兴奋剂。

本发明一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法的步骤为：

a、标准溶液的配制：准确称取四种标准品1mg，用甲醇定容至10mL，配成0.1g/L的标准储备液，至于4℃冰箱中避光保存。使用时用甲醇逐级稀释储备液，配制成50、100、500、1000μg/L的标准溶液；

b、样品提取：准确称取捣碎的鲜肉2g于50mL离心管中，加入5%的高氯酸10mL，涡旋混合，超声提取30min，于高速离心机10000r/min离心15min，倾出上清液后再用5%的高氯酸10mL重复提取，合并上清液，待净化；

c、样品净化：依次用3mL甲醇和3mL去离子水活化平衡固相萃取小柱WCX，取1.3上清液以1mL/min的流速过柱，然后分别用3mL去离子水和3mL甲醇淋洗SPE柱，抽干后用5%氨化甲醇5mL淋洗柱子，收集洗脱液，经氮吹干后备用；

d、衍生化：吹干物加入衍生化试剂BSTFA+1%TMCS80μL，于具塞试管中涡旋混合器充分混匀，在80℃的烘箱中加热30min，氮气吹干，加甲苯0.5mL溶解供GC-MS分析，同时标准溶液氮气吹干，也按样品同步进行衍生化；

e、气相色谱或质谱：

（1）、检测气相色谱或质谱条件：HP-5ms石英毛细管柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度为280℃，载气为高纯氦气，纯度≥99.999%；

（2）、以不分流方式进样，进样量为1μl；

（3）、进行升温，首先120℃保持1min，以10℃/min上升至230℃，保持5min，再以10℃/min上升至280℃，保持3min；

（4）、电子轰击源，电离电压为70eV，接口温度为280℃；

（5）、溶剂延迟10min；

（6）、选取SIM模式，监测离子。

作为优选，所述样品提取中捣碎的鲜肉要精确到0.01g，结果更加准确。

本发明的有益效果是：本发明采用气质法，建立了比现有文献报道都简单的动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺等四种β-肾上腺素能受体兴奋剂的前处理方法，在样品提取中主要采用高氯酸一种提取溶剂，不仅步骤少，可以避免目标物的损失，提高了实验的准确度，溶剂用的种类少了可以避免因实验带来的环境污染。4种兴奋剂在50-1000μg/L的范围具有良好线性，相关系数在0.995以上, 加标回收率在84.32～103.15%之间，RSD在1.35～4.78%之间，准确可靠在气相色谱定性的基础上，从结构上得到化合物特征碎片离子质谱图，避免了假阳性结果的出现，并且其最低检出限和加标回收率符合目前国内外检测要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法中4种兴奋剂的总离子流图。

具体实施方式

一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法，仪器包括：气相色谱--质谱联用仪、高速冷冻离心机、固相萃取小柱WCX、SCX、MCX、固相萃取装置和氮吹仪；试剂包括：高氯酸、甲醇、氨水、甲苯、N,O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺即BSTFA和纯度≥98%的标准品。

所述气相色谱--质谱联用仪为安捷伦7890-5975C相色谱--质谱联用仪，色谱、质谱结构精准。

所述标准品包括沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、硫酸特布他林和莱克多巴胺，为四种β-兴奋剂。

一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法的步骤为：

a、标准溶液的配制：准确称取四种标准品1mg，用甲醇定容至10mL，配成0.1g/L的标准储备液，至于4℃冰箱中避光保存。使用时用甲醇逐级稀释储备液，配制成50、100、500、1000μg/L的标准溶液；

b、样品提取：准确称取捣碎的鲜肉2g于50mL离心管中，加入5%的高氯酸10mL，涡旋混合，超声提取30min，于高速离心机10000r/min离心15min，倾出上清液后再用5%的高氯酸10mL重复提取，合并上清液，待净化；

c、样品净化：依次用3mL甲醇和3mL去离子水活化平衡固相萃取小柱WCX，取1.3上清液以1mL/min的流速过柱，然后分别用3mL去离子水和3mL甲醇淋洗SPE柱，抽干后用5%氨化甲醇5mL淋洗柱子，收集洗脱液，经氮吹干后备用；

d、衍生化：吹干物加入衍生化试剂BSTFA+1%TMCS80μL，于具塞试管中涡旋混合器充分混匀，在80℃的烘箱中加热30min，氮气吹干，加甲苯0.5mL溶解供GC-MS分析，同时标准溶液氮气吹干，也按样品同步进行衍生化；

e、气相色谱或质谱：

（1）、检测气相色谱或质谱条件：HP-5ms石英毛细管柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度为280℃，载气为高纯氦气，纯度≥99.999%；

（2）、以不分流方式进样，进样量为1μl；

（3）、进行升温，首先120℃保持1min，以10℃/min上升至230℃，保持5min，再以10℃/min上升至280℃，保持3min；

（4）、电子轰击源，电离电压为70eV，接口温度为280℃；

（5）、溶剂延迟10min；

（6）、选取SIM模式，监测离子。

所述样品提取中捣碎的鲜肉要精确到0.01g，结果更加准确。

试验结果：

1、线性范围及方程

将事先配制好的系列标准溶液（50、100、500、1000μg/L）经方法d进行衍生化后，上机检测，绘制标准工作曲线，线性方程、线性范围及线性相关系数见表1，总离子流图见图1。

表1 四种兴奋剂的线性方程

名称	线性范围（μg/L）	线性方程	r
				特布他林	50-1000	y=167.98+3047	0.9956
克伦特罗	50-1000	y=231.12+3047	0.9945
				沙丁胺醇	50-1000	y=367.45-1563	0.9978
莱克多巴胺	50-1000	y=139.59+45	0.9969

由表1可知4种兴奋剂的线性范围在50-1000μg/L，相关系数在0.995以上，线性良好。

2.2 加标回收及检测限

在猪肉中添加了10μg/kg的4种兴奋剂，进行GC-MS测定，其回收率及精密度见表3，按S/N=3计算4种兴奋剂的最低检出限，结果表2

表2 四种兴奋剂的加标回收试验

名称	添加量（μg/kg）	测定值（μg/kg）	回收率（%）	RSD（%）	检出限（μg/kg）
						特布他林	10	8.43	84.3	1.35	0.5
克伦特罗	10	9.14	91.4	2.87	0.5
						沙丁胺醇	10	10.31	103.1	1.92	0.5
莱克多巴胺	10	8.94	89.4	4.78	1.0

由表2可知4中兴奋剂的加标回收率在84.32～103.15%之间，RSD在1.35～4.78%之间，表明本方法准确可靠。

2.3 提取溶剂浓度的选择

鲜肉样品经均质匀浆后，加入混合标准溶液使样品终浓度为10μg/kg的，采用1%、5%、10%、15%、20%五个浓度梯度的高氯酸溶液提取目标物，提取液经过净化浓缩检测后确定最佳的提取溶剂浓度。

表3  不同浓度高氯酸的提取加标回收率

由表3可知，1%的高氯酸提取效果较差，5%、10%、15%、20%的高氯酸提取效果都较好，在不影响实验结果的前提下，综合考虑实验成本和环境保护，优先选择5%的高氯酸。

2.4 固相萃取柱的选择

鲜肉样品经均质匀浆后，加入混合标准溶液使样品终浓度为10μg/kg，选取三种不同的阳离子交换固相萃取小柱MCX、WCX、SCX，直接浓缩、净化，收集洗脱液，经氮吹干后进行浓缩衍生化后检测确定最佳的固相萃取小柱。

表4  不同固相萃取小柱的净化效果

净化效果	MCX	SCX	WCX
				除杂效果	一般	好	好
四种兴奋剂平均回收率（%）	59.2；85.4；92.9；84.1	75.4；63.9；73.6；55.7	93.6；107.5；89.3；91.4

由表4可知，除杂效果SCX、WCX较好，四种兴奋剂的加标回收率WCX最佳，所以选择WCX作为实验的净化萃取装置。

2.5 衍生化条件的确定

鲜肉样品经均质匀浆后，加入混合标准溶液使样品终浓度为10μg/kg，选用硅烷化试剂BSTFA+1%TMCS进行衍生，当衍生化条件相同时，衍生试剂的用量分别为50、80、100、120μl，经检测分析确定最佳衍生试剂的用量；同样当选择20、30、45、60min进行衍生，经检测分析确定最佳衍生时间。

表5  不同衍生试剂用量的检测结果

衍生化试剂用量（μl）	50	80	100	120
					四种兴奋剂平均回收率（%）	38.2；55.1；32.4；69.5	91.5；97.6；101.6；85.2	90.6；94.5；99.3；86.4	93.1；92.3；94.3；87.5

表6  不同衍生时间的检测结果

衍生化时间（min）	20	30	45	60
					四种兴奋剂平均回收率（%）	47.2；45.2；52.4；39.5	95.5；92.6；98.7；86.1	94.6；92.5；99.4；87.1	97.1；94.9；95.8；85.5

由表5、表6可知，衍生化试剂用量80μl，衍生化时间30min，是本实验的最佳衍生化条件。

本发明的有益效果是：本发明采用气质法，建立了比现有文献报道都简单的动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺等四种β-肾上腺素能受体兴奋剂的前处理方法，在样品提取中主要采用高氯酸一种提取溶剂，不仅步骤少，可以避免目标物的损失，提高了实验的准确度，溶剂用的种类少了可以避免因实验带来的环境污染。4种兴奋剂在50-1000μg/L的范围具有良好线性，相关系数在0.995以上, 加标回收率在84.32～103.15%之间，RSD在1.35～4.78%之间，准确可靠在气相色谱定性的基础上，从结构上得到化合物特征碎片离子质谱图，避免了假阳性结果的出现，并且其最低检出限和加标回收率符合目前国内外检测要求。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法，其特征在于：仪器包括：气相色谱--质谱联用仪、高速冷冻离心机、固相萃取小柱WCX、SCX、MCX、固相萃取装置和氮吹仪；试剂包括：高氯酸、甲醇、氨水、甲苯、N,O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺即BSTFA和纯度≥98%的标准品。

2.根据权利要求1所述的一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法，其特征在于：所述气相色谱--质谱联用仪为安捷伦7890-5975C气相色谱--质谱联用仪。

3.根据权利要求1所述的一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法，其特征在于：所述标准品包括沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、硫酸特布他林和莱克多巴胺。

4.根据权利要求1所述的一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法，其特征在于：该步骤为：

a、标准溶液的配制：准确称取四种标准品1mg，用甲醇定容至10mL，配成0.1g/L的标准储备液，至于4℃冰箱中避光保存。使用时用甲醇逐级稀释储备液，配制成50、100、500、1000μg/L的标准溶液；

b、样品提取：准确称取捣碎的鲜肉2g于50mL离心管中，加入5%的高氯酸10mL，涡旋混合，超声提取30min，于高速离心机10000r/min离心15min，倾出上清液后再用5%的高氯酸10mL重复提取，合并上清液，待净化；

c、样品净化：依次用3mL甲醇和3mL去离子水活化平衡固相萃取小柱WCX，取1.3上清液以1mL/min的流速过柱，然后分别用3mL去离子水和3mL甲醇淋洗SPE柱，抽干后用5%氨化甲醇5mL淋洗柱子，收集洗脱液，经氮吹干后备用；

d、衍生化：吹干物加入衍生化试剂BSTFA+1%TMCS80μL，于具塞试管中涡旋混合器充分混匀，在80℃的烘箱中加热30min，氮气吹干，加甲苯0.5mL溶解供GC-MS分析，同时标准溶液氮气吹干，也按样品同步进行衍生化；

e、气相色谱或质谱：

（1）、检测气相色谱或质谱条件：HP-5ms石英毛细管柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm，进样口温度为280℃，载气为高纯氦气，纯度≥99.999%；

（2）、以不分流方式进样，进样量为1μl；

（3）、进行升温，首先120℃保持1min，以10℃/min上升至230℃，保持5min，再以10℃/min上升至280℃，保持3min；

（4）、电子轰击源，电离电压为70eV，接口温度为280℃；

（5）、溶剂延迟10min；

（6）、选取SIM模式，监测离子。

5.根据权利要求4所述的一种气质法快速测定畜禽肉中β-兴奋剂的前处理方法，其特征在于：所述样品提取中捣碎的鲜肉在称取过程中要精确到0.01g。