CN104020240A - 一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明采用优化样品处理方法及优化检测条件的UPLC-MS/MS建立了离体鱼类性腺内类固醇类性激素的定性检测方法，同时此方法又可以对8种类固醇类性激素进行定量分析，可以实现一次样品制备、一次进样分析，同时完成定性和定量分析，可以比较全面地反映离体鱼性腺内类固醇类性激素的化学组成成分，并且定量分析结果中八种类固醇类性激素的回归方程的相关系数R2均大于0.99，测定方法的精密度、重复性、稳定性良好。本发明的方法通过对多成分类固醇类性激素含量的测定可以比较全面地反映性激素在性腺中累积、传递和代谢过程，为准确评估鱼类的发育时期提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体涉及一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法及其应用。
背景技术
虽然近年来鳗鲡的人工繁殖初见成果，但对于在其性腺发育过程中性腺组织中的性腺激素含量会在不同阶段，并且随着不同激素的注射而有所改变，尤其是雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、17α-羟孕酮、17α，20β-二羟-4-孕烯-3-酮(DHP)、睾酮、表睾酮对鳗鲡的成熟和产卵有着重要的影响。
在过去30年中，有大量的研究证实，睾酮和DHP二者相互协调，共同激发着鳗鲡精子的形成；鱼类中，脑垂体分泌GtH，GtH含两种糖蛋白促性性腺激素(即LH和FSH)，进而促进雄鱼血液中DHP和睾酮的分泌来调控性腺的发育与成熟；而在雌鱼中，这两种激素会促进分泌形成雌二醇，雌二醇会进而刺激肝脏合成与分泌卵黄蛋白原；另一方面同样会刺激滤泡颗粒细胞分泌DHP，DHP是诱导卵巢最后成熟与排卵的重要激素。Katsumi Tsukamoto等对捕获的日本鳗鲡通过RIA和TLC法对它们进行血清类固醇激素的检测，发现在日本鳗鱼排卵期间，DHP约1ng/ml，而在人工催熟的日本鳗鱼的同一期间没有检测这种类固醇激素，同时在人工繁殖的日本鳗鱼的卵黄发生的中后期检测血清中雌二醇(雌甾体类激素)含量为2-3ng/ml，睾酮(精子发生诱导类固醇)在捕获的雄性鳗鱼体内的含量是很高的(2-5ng/ml)，含量类似与人工繁殖的成熟雄鳗中。因此，准确掌握鳗鲡性腺组织中性激素周期性的浓度变化是决定人工繁殖鳗鲡成功与否的关键。
由于类固醇类激素在离体鱼类性腺中的浓度通常很低，而离体鱼类性腺作为鱼类组织中结构最为复杂的器官，不仅蛋白质含量高，而且油脂含量高，干扰物质多，类固醇类激素作为脂溶性的激素，在提取的过程中很容易损耗。因此，本发明的目的在于建立可靠、稳定的定性定量分析方法，并通过有效的富集、分离和纯化过程实现高灵敏度、高专属性分析，为进一步研究类固醇类激素在鱼类性腺内的代谢及消耗过程奠定基础，为人工繁殖鱼类提供科学方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种UPLC-MS/MS检测离体鱼类性腺内类固醇类性激素的方法。所述方法能够对离体鱼类性腺内八种类固醇类性激素：雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)进行同时分析检测。本发明的方法通过对多成分类固醇类性激素含量的测定可以比较全面地反映性激素在性腺中累积、传递和代谢过程，为准确评估鱼类的发育时期提供依据。
为实现上述及其他目的，本发明采用以下技术方案：
一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法，为采用UPLC-MS/MS定性或定量检测离体鱼类性腺内类固醇类性激素，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：称取离体鱼类性腺组织，经前处理，得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：称取未成熟离体鱼类性腺组织样品，加入类固醇类性激素标准品溶液，经和步骤(1)相同的前处理，得对照品溶液；
(3)测定：采用UPLC-MS/MS分别对供试品溶液和对照品溶液进行定性或定量检测。
较佳的，所述鱼类为花鳗鲡鱼或河鳗(日本鳗鲡)。
较佳的，所述类固醇类性激素选自雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮或17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)中的一种或多种。
较佳的，步骤(1)中，所述前处理，包括如下步骤：
1)将离体鱼类性腺组织样品，加入匀浆介质，匀浆，得匀浆液；
2)将所得匀浆液超声，离心，冷冻；
3)将所得冷冻后的样品，离心，取上清液进行过滤，将所得过滤液旋转蒸发浓缩，加步骤1)中所用匀浆介质溶解，静置；
4)离心，取上清液进行过滤，得续滤液作为供试品溶液。
较佳的，步骤1)中，所述匀浆介质为乙腈、甲醇中的任一种。
较佳的，步骤1)中，每1g的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质8-15ml。更佳的，每1g的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质10-15ml。
所述离体鱼类性腺组织样品称取时，应当精密称取。
所述甲醇为100％甲醇。
较佳的，步骤1)中，匀浆时可采用两步匀浆法，亦即，第一步：每1g的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质4-6ml，以5000-10000RPM速度匀浆3-8min，得一次匀浆液；第二步：分离所得一次匀浆液，得一次匀浆液上清液和剩余沉淀，向每1g剩余沉淀中加入4-6ml的匀浆介质，以5000-10000RPM速度匀浆3-8min得二次匀浆液，用匀浆介质清洗匀浆机刀头得匀浆机刀头清洗液，最后合并一次匀浆液上清液、二次匀浆液和匀浆机刀头清洗液。
较佳的，所述两步匀浆法中，第一步中，每1g的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质4-5ml，以5000-10000RPM速度匀浆3-5min。
较佳的，所述两步匀浆法中，第二步中，每1g的剩余沉淀中加入4-5ml的匀浆介质，以5000-10000RPM速度匀浆3-5min。
较佳的，步骤2)中，超声时间为5-10min。更佳的，超声时间为5min。
较佳的，步骤2)中，所述离心为：在0-4℃下，3000-5000RMP离心3-8min；更佳的，所述离心为：在0℃下，4000RMP离心5min。
较佳的，步骤2)中，所述冷冻为：-20℃～-40℃下冷却2-8h；更佳的，所述冷冻为在-40℃下冷冻4--6h。
较佳的，步骤3)中，离心为：在0-4℃的下，以3000-5000RMP离心3-5min；更佳的，所述离心为：在0℃下，以4000RMP离心4min。
较佳的，步骤3)中，过滤是指通过脱脂棉进行过滤。
较佳的，步骤3)中，所述旋转蒸发浓缩的温度为35-50℃；更佳为40℃。
较佳的，步骤4)中，所述过滤是指：取上清液过滤膜，放弃初滤液后，即得续滤液。
较佳的，步骤1)、2)中，采用D-SPE试管(2)；产品信息为：Supertech Q R1A，cat.#55250-1A。
较佳的，步骤3)中，加匀浆介质后转移至D-SPE试管(3)；产品信息为：Supertech QM1，cat.#55260-1B。
较佳的，步骤(2)中，类固醇类性激素标准品溶液的配制方法为：分别精密称取类固醇类性激素标准品适量，加与步骤(1)相同的匀浆介质溶解，得标准品溶液，使标准品溶液中每种类固醇类激素的浓度均相同。更佳的，标准品溶液中每种类固醇类激素的浓度均为100ppm。
较佳的，步骤(2)中，17α-羟孕酮购自TRC公司，雌三醇购自Fluka公司，其余标准品均购自sigma-aldrich公司。
较佳的，雌二醇的CAS号为50-28-2；雌三醇的CAS号为50-27-1；睾酮的CAS号为58-22-0；表睾酮的CAS号为481-30-1；孕酮的CAS号为57-83-0；17α-羟孕酮的CAS号为68-96-2；雌酮的CAS号为53-16-7；17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)的CAS号为1662-06-2。
较佳的，步骤(3)中，所述定性方法为：采用UPLC-MS/MS在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的色谱图，与对照品溶液的色谱图进行比较，根据相对保留时间和特征碎片离子峰的荷质比m/z，确认供试品溶液中类固醇类性激素的特征峰，从而对供试品溶液中类固醇类性激素成分进行定性。
较佳的，所述步骤(3)中，所述定量方法为：采用UPLC-MS/MS在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液和对照品溶液的类固醇类性激素色谱图及其峰面积，按照内标法计算供试品溶液中种类固醇类性激素的含量。
较佳的，所述内标法是指：分别移取一系列不同体积的类固醇类性激素标准品溶液分别加入到未成熟离体鱼类性腺组织样品中，经与制备供试品溶液时相同的前处理，得一系列不同浓度的对照品溶液。采用UPLC进样分析，获得对照品溶液中类固醇类性激素含量与峰面积的线性关系，以每一种类固醇类性激素色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用UPLC检测，将获得的供试品溶液中类固醇类性激素的色谱峰面积，分别代入相应的标准工作曲线的回归方程中，计算可得到相应类固醇类性激素的含量。
较佳的，类固醇类性激素标准品溶液的配置方法为：分别精密称取类固醇类性激素标准品适量，加与步骤(1)相同的匀浆介质溶解，得标准品溶液，使标准品溶液中每种类固醇类激素的浓度均相同。更佳的，标准品溶液中每种类固醇类激素的浓度均为100ppm。
较佳的，步骤(3)中，UPLC所用色谱柱为xBridge-C18(100mm×2.1mm，5μm)。
较佳的，柱温为30～50℃，优选40℃。
较佳的，流速为0.25～0.4ml/min，优选0.30mL/min。
较佳的，流动相中，A相为0.1％甲酸水溶液(体积百分含量)，B相为0.25mol/L的乙酸铵水溶液，A相与B相的体积比为95：5-0：100。
较佳的，分析时间为12min，梯度洗脱。
进一步的，所述梯度洗脱以流动相A相与B相体积比为95：5-0：100梯度变化洗脱。
优选的，所述梯度洗脱的具体程序为：
0～10min，A相：B相体积比为95：5-0：100；
10～12min，A相：B相体积比为0：100-95：5。
较佳的，步骤(3)中，MS/MS的色谱条件为：睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、DHP均采用正离子模式扫描，雌酮、雌二醇、雌三醇均采用负离子模式扫描。
本发明的有益效果为：
(1)如上所述，本发明采用优化样品处理方法及优化检测条件的UPLC-MS/MS建立了离体鱼类性腺内类固醇类性激素的定性检测方法，同时此方法又可以对8种类固醇类性激素进行定量分析，可以实现一次样品制备、一次进样分析，同时完成定性和定量分析。
(2)由于类固醇类激素在离体鱼类性腺中的浓度通常很低，而离体鱼类性腺作为鱼类组织中结构最为复杂的器官，不仅蛋白质含量高，而且油脂含量高，干扰物质多，类固醇类激素作为脂溶性的激素，在提取的过程中很容易损耗。本发明的特殊设计的前处理过程实现了对离体鱼性腺组织内的类固醇类激素的有效富集、分离和纯化，为实现高灵敏度、高专属性分析奠定基础。
(3)为了简化流动相的配制和保护色谱柱，在不影响分离的前提下，我们试验得到了理想的流动相系统：0.1v/v％甲酸水溶液-0.25mol/L乙酸铵水溶液系统，这种流动相系统在梯度洗脱条件下能使被分离化合物保持较好的分离度和峰形。
(4)本发明通过对类固醇类性激素的定性和定量分析，可以比较全面的反映离体鱼性腺内类固醇类性激素的化学组成成分，并且定量分析结果中种类固醇类性激素的回归方程的相关系数R2均大于0.99，测定方法的精密度、重复性、稳定性良好。本发明的方法通过对多成分类固醇类性激素含量的测定可以比较全面的反映性激素在性腺中累积、传递和代谢过程，为准确评估鱼类的发育时期提供依据。
附图说明
图1：图中1列、2列、3列所示分别为空白对照品组溶液的离子流色谱图、对照品组溶液的离子流色谱图、供试品组溶液的离子流色谱图；具体的：A行代表可的松(一种应激反应激素)定性离子流色谱图，B行代表可的松定量离子流色谱图；C行代表雌三醇定性离子流色谱图；D行代表雌三醇定量离子流色谱图；E行代表雌二醇定性离子流色谱图，F行代表雌二醇定量离子流色谱图；G行代表雌酮定性离子流色谱图，H行代表雌酮定量离子流色谱图；I行代表DHP定性离子流色谱图，J行代表DHP定量离子流色谱图；K行代表17α-羟孕酮定性离子流色谱图，L行代表17α-羟孕酮定量离子流色谱图；M行代表孕酮定性离子流色谱图，N行代表孕酮定量离子流色谱图；O行保留时间靠前的峰代表睾酮定性离子流色谱图，保留时间靠后的峰代表表睾酮定性离子流色谱图，P行保留时间靠前的峰代表睾酮定量离子流色谱图，保留时间靠后的峰代表表睾酮定量离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下实施例中采用的材料、试剂和仪器如下：
甲醇、甲酸(分析纯，国药集团)；乙腈(色谱纯，美国天地试剂公司)；雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕甾烯-3-酮(DHP)(供含量测定用，中国药品生物制品检定所)；具塞锥形瓶、移液管及其相关玻璃器皿(上海禾汽玻璃有限公司)；色谱柱：xBridge-C18(250mm×4.6mm，5μm)(沃特世科技有限公司)；超声萃取仪(宁波新芝生物有限责任公司)；Waters超高效液相系统(ACQUITY UPLC)和三重四级杆串联质谱(XEVO-TQ)；PL2002型电子天平；均质仪(Polytron，PT2000，Switerland)；冷冻离心机(Type3K-18，Sigma,Germany)；Heidolph旋转蒸发仪(Hei-VAP Value HB)；Heidolph振动器(Multi Reax)；三洋-40℃超低温冰箱；水由纯水仪(Millipore，法国)纯化得到。
实施例1离体鱼类性腺内类固醇类性激素的定性测定
1实验部分
1.1样品前处理
(1)供试品溶液的制备：
精密称定5.0g的离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，精密加入乙腈20ml，以10000RPM速度匀浆2～4min，分离上清液与剩余沉淀；然后再向沉淀中精密加入乙腈20ml，以10000RPM速度匀浆2～4min，合并两次匀浆的上清液与沉淀至试管(2)中；随后用吸管吸取乙腈清洗刀头，用同一试管(2)下方收集，直至液面到达50mL刻度线；将试管(2)充分混匀震荡，并超声5min；以4000RMP离心5min，再将试管放置于-40℃冰箱的金属试管套中冷冻4-6h；将冷冻好的样品在0℃下4000RMP离心4min，从离心好的试管中液体立即取40mL，并通过脱脂棉过滤至到鸡心瓶，在40℃下旋转蒸发至近干；取0.75mL，70％乙腈洗涤鸡心瓶，并转移至D-SPE试管(3)(Supertech QM1，cat.#55260-1B)，再用0.75mL，70％乙腈重复洗涤一次，并转移至同一D-SPE试管(3)，充分混匀后，以静止2min，以4000RMP离心3min，取1mL上清液经微孔滤膜(0.22μm，特富龙)过滤，取续滤液至1.5mL进样瓶中，作为供试品溶液，用于分析测定。
(2)对照品溶液的制备：
首先，配制类固醇类性激素标准品溶液：分别精密称取雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)标准品适量，加乙腈溶解并定容，摇匀，得到标准品溶液，使标准品溶液中每一种类固醇类激素的浓度均为1ppm，之后经过稀释，使标准品中的每一种类固醇类激素的浓度均为100ppb。
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于不同的50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别向六个(2)试管中加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液50ul、100ul、250ul、500ul、1000ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，得一系列每种类固醇类性激素浓度分别为1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，40.00ng/g的对照品溶液；
(3)空白对照品溶液的制备：
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品，经和供试品溶液相同的前处理，得空白对照品溶液。
1.2色谱条件
UPLC的色谱条件为：色谱柱：xBridge-C18(100mm×2.1mm，5μm)；柱温：40℃；流速：0.30mL/min；进样量：10μl；流动相：0.1v/v％甲酸水溶液-0.25mol/L乙酸铵水溶液，其中，A相为0.1v/v％甲酸水溶液，0.25mol/L乙酸铵水溶液；分析时间：12min；梯度洗脱。梯度洗脱的具体程序为：
MS/MS的色谱条件为：电喷雾离子源(ESI)；睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、DHP均采用正离子模式扫描，雌酮、雌二醇、雌三醇均采用负离子模式扫描；多反应监测(MRM)方式检测。毛细管电压为3.5kV；雾化温度为500℃；雾化作用和喷雾作用均使用氮气，氮气流速分别为950L/h和150L/h。质谱分析的具体条件参数为：
1.3测定
分别吸取体积为10μl的空白对照品溶液、对照品溶液和供试品溶液，采用相同色谱条件的UPLC-MS/MS分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的色谱图，与对照品溶液的色谱图进行比较，根据相对保留时间和特征碎片离子峰的荷质比m/z，确认供试品溶液中类固醇类性激素的特征峰，从而对供试品溶液中类固醇类性激素成分进行定性。
2结果与讨论
2.1前处理条件的优化
对于脂溶性化合物，要求提取液中的有机相的比例越高越好，这样势必会带来较多的脂肪杂质；因此，理想的净化是将干扰物尽可能多的排出出去，同时保证目标化合物不受损失，这些给待测物的净化带来巨大的挑战。
本实验中采用的两步匀浆法会大大增加目标物质的回收率，相较于一步匀浆法回收率提高10％-30％。匀浆后用乙腈冲洗刀头可以减少实验中的损失。
冷冻条件的优化，采用本发明所优化的超低温冷冻净化方法：当温度降低到一定程度时，脂肪等一些杂质会从极性溶剂中的溶解度降低，有些甚至会凝固析出，再通过离心沉淀脂肪然后再快速过滤，能够去除提取液中90％的脂肪杂质。
2.2色谱条件的优化
本实验中分别比较了Acquity UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)、Acquity UPLC HSST3(2.1mm×100mm，1.8μm)、xBridge-C18(250mm×4.6mm，5μm)三种不同的色谱柱以及0.25mol/L乙酸铵水溶液、0.5mol/L乙酸铵水溶液两种流动相B，结果表明xBridge-C18(250mm×4.6mm，5μm)和0.25mol/L乙酸铵水溶液检测的结果的回收率最佳。
2.3方法的选择性、精密度、重复性、稳定性
2.3.1方法选择性
取空白对照品溶液和对照品溶液各10ul，按上述2.2中UPLC-MS/MS优化色谱条件进行测定，所得色谱图见图1的1和2，该实验结果表明，离体花鳗鲡鱼性腺组织的内源性物质不干扰待测物的测定。
2.3.2精密度
首先，配制类固醇类性激素标准品溶液：分别精密称取雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)标准品适量，加乙腈溶解并定容，摇匀，得到标准品溶液，使标准品溶液中每一种类固醇类激素的浓度均为1ppm，之后经过稀释，使标准品中的每一种类固醇类激素的浓度均为100ppb。
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品分别于18个50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、100ul、100ul、100ul、100ul、100ul、500ul、500ul、500ul、500ul、500ul、500ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，分别得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g各6个，进样，分析测定。
在连续三天在相同的时间点，每天精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品分别于3个50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、500ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，分别得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g，进样，分析测定。
花鳗鲡性腺内类固醇类性激素精密度考察结果
2.3.3重复性
首先，配制类固醇类性激素标准品溶液：分别精密称取雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)标准品适量，加乙腈溶解并定容，摇匀，得到标准品溶液，使标准品溶液中每一种类固醇类激素的浓度均为1ppm，之后经过稀释，使标准品中的每一种类固醇类激素的浓度均为100ppb。
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于不同的50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、500ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g)。
重复性试验操作方法：
日内重复性试验，精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品分别于18个50mLD-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、100ul、100ul、100ul、100ul、100ul、500ul、500ul、500ul、500ul、500ul、500ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，分别得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g各6个，进样，分析测定。
日内重复性试验，连续三天在相同的时间点，每天精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品分别于3个50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、500ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，分别得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g，进样，分析测定。
3类固醇类激素的图谱
通过对供试品溶液前处理和色谱条件的优化，以及方法学考察，我们建立了离体鱼类性腺中类固醇类性激素的图谱。取10批离体鱼类性腺样品按上述2.1中供试品前处理的优化条件制备样品，得供试品溶液，再分别吸取体积为10μl的空白对照品溶液、对照品溶液和供试品溶液，按上述2.2中UPLC-MS/MS优化色谱条件进行测定，所得色谱图见图1。其中，图中1列、2列、3列所示分别为空白对照品组溶液的离子流色谱图、对照品组溶液的离子流色谱图、供试品组溶液的离子流色谱图；具体的：A行代表可的松(一种应激反应激素)定性离子流色谱图，B行代表可的松定量离子流色谱图；C行代表雌三醇定性离子流色谱图；D行代表雌三醇定量离子流色谱图；E行代表雌二醇定性离子流色谱图，F行代表雌二醇定量离子流色谱图；G行代表雌酮定性离子流色谱图，H行代表雌酮定量离子流色谱图；I行代表DHP定性离子流色谱图，J行代表DHP定量离子流色谱图；K行代表17α-羟孕酮定性离子流色谱图，L行代表17α-羟孕酮定量离子流色谱图；M行代表孕酮定性离子流色谱图，N行代表孕酮定量离子流色谱图；O行保留时间靠前的峰代表睾酮定性离子流色谱图，保留时间靠后的峰代表表睾酮定性离子流色谱图，P行保留时间靠前的峰代表睾酮定量离子流色谱图，保留时间靠后的峰代表表睾酮定量离子流色谱图。
实施例2离体鱼类性腺内类固醇类性激素成分含量测定
1实验部分
1.1样品前处理
(1)供试品溶液的制备：
精密称定5.0g的离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，精密加入乙腈20ml，以10000RPM速度匀浆3～5min，分离上清液与剩余沉淀；然后再向沉淀中精密加入乙腈20ml，以10000RPM速度匀浆3～5min，合并两次匀浆的上清液与沉淀至试管(2)中；随后用吸管吸取乙腈清洗刀头，用同一试管(2)下方收集，直至液面到达50mL刻度线；将试管(2)充分混匀震荡，并超声5min；以4000RMP离心5min，再将试管放置于-40℃冰箱的金属试管套中冷冻4-6h；将冷冻好的样品在0℃下4000RMP离心4min，从离心好的试管中液体立即取40mL，并通过脱脂棉过滤至到鸡心瓶，在40℃下旋转蒸发至近干；取0.75mL，70％乙腈洗涤鸡心瓶，并转移至D-SPE试管(3)(Supertech QM1，cat.#55260-1B)，再用0.75mL，70％乙腈重复洗涤一次，并转移至同一D-SPE试管(3)，充分混匀后，以静止2min，以4000RMP离心3min，取1mL上清液经微孔滤膜(0.22μm，特富龙)过滤，取续滤液至1.5mL进样瓶中，作为供试品溶液，用于分析测定。
(2)对照品溶液的制备：
首先，配制类固醇类性激素标准品溶液：分别精密称取雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)标准品适量，加乙腈溶解并定容，摇匀，得到标准品溶液，使标准品溶液中每一种类固醇类激素的浓度均为1ppm，之后经过稀释，使标准品中的每一种类固醇类激素的浓度均为100ppb。
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于不同的50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液50ul、100ul、250ul、500ul、1000ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，得一系列每种类固醇类性激素浓度分别为1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，40.00ng/g的对照品溶液；
(3)空白对照品溶液的制备：
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品，经和供试品溶液相同的前处理，得空白对照品溶液。
1.2色谱条件
UPLC的色谱条件为：色谱柱：xBridge-C18(100mm×2.1mm，5μm)；柱温：40℃；流速：0.30mL/min；进样量：10μl；流动相：0.1v/v％甲酸水溶液-0.25mol/L乙酸铵水溶液，其中，A相为0.1v/v％甲酸水溶液，0.25mol/L乙酸铵水溶液；分析时间：12min；梯度洗脱。梯度洗脱的具体程序为：
MS/MS的色谱条件为：电喷雾离子源(ESI)；睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、DHP均采用正离子模式扫描，雌酮、雌二醇、雌三醇均采用负离子模式扫描；多反应监测(MRM)方式检测。毛细管电压为3.5kV；雾化温度为500℃；雾化作用和喷雾作用均使用氮气，氮气流速分别为950L/h和150L/h。质谱分析的具体条件参数为：
1.3测定
采用UPLC进样分析，获得一系列对照品溶液中类固醇类性激素含量与峰面积的线性关系，以每一种类固醇类性激素色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再取体积为250ul的供试品溶液，采用UPLC检测，将获得的供试品溶液中类固醇类性激素的色谱峰面积，分别代入相应的标准工作曲线的回归方程中，计算可得到相应类固醇类性激素的含量。
2结果与讨论
2.1优化的前处理条件
根据实施例1中优化选择的前处理条件可知，测定8种类固醇性激素含量的前处理的优选条件为：取样品组织5.0g，加入的匀浆介质为离体鱼类性腺组织样品的5-6倍量；匀浆介质加入体积量为所述离体鱼类性腺组织样品质量的的5-6倍；以10000RPM速度匀浆3～4min，分离第一次匀浆的上清液与沉淀部分；再向沉淀部分加入的匀浆介质为离体鱼类性腺组织样品的5-6倍量；匀浆介质加入体积量为所述离体鱼类性腺组织样品质量的的5-6倍，以10000RPM速度匀浆3～4min，分两次匀浆；合并两次匀浆的上清液与沉淀；混匀震荡，并超声5min；以4000RMP离心5min，再将试管放置于-40℃冰箱的金属试管套中冷冻4-6h；将冷冻好的样品在0℃下4000RMP离心4min，从离心好的试管中液体立即取40mL，并通过脱脂棉过滤至到鸡心瓶，在40℃下旋转蒸发至近干；取0.5mL0％乙腈洗涤鸡心瓶，并转移至D-SPE试管(3)(Supertech QM1，cat.#55260-1B)，再用0.5mL0％乙腈重复洗涤一次，并转移至同一D-SPE试管(3)，充分混匀后，以静止2min，以4000RMP离心3min，取1mL上清液经微孔滤膜(0.22μm，特富龙)过滤，取续滤液至1.5mL进样瓶中，作为供试品溶液，用于分析测定。
2.2优化的色谱条件
根据实施例1中优化选择的前处理条件可知，测定8种类固醇类性激素含量的色谱的优化条件为：色谱柱：xBridge-C18(100mm×2.1mm，5μm)；柱温：40℃；流速：0.30mL/min；进样量：10μl；流动相：0.1v/v％甲酸水溶液-0.25mol/L乙酸铵水溶液，其中，A相为0.1v/v％甲酸水溶液，B相为0.25mol/L乙酸铵水溶液；分析时间：12min。
2.3 8种类固醇类性激素含量测定方法的精密度、重复性、稳定性
2.3方法的选择性、精密度、重复性、稳定性
取空白对照品溶液和对照品溶液各10ul，按上述2.2中UPLC-MS/MS优化色谱条件进行测定，所得色谱图见图1的1和2，该实验结果表明，离体花鳗鲡鱼性腺组织的内源性物质不干扰待测物的测定。
2.3.2精密度
首先，配制类固醇类性激素标准品溶液：分别精密称取雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)标准品适量，加乙腈溶解并定容，摇匀，得到标准品溶液，使标准品溶液中每一种类固醇类激素的浓度均为1ppm，之后经过稀释，使标准品中的每一种类固醇类激素的浓度均为100ppb。
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于不同的50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、500ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g)。
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品分别于18个50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、100ul、100ul、100ul、100ul、100ul、500ul、500ul、500ul、500ul、500ul、500ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，分别得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g各6个，进样，分析测定。在连续三天在相同的时间点，每天精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品分别于3个50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、500ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，分别得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g，进样，分析测定。测定保留时间及峰面积，精密度具体结果如下表所示。从结果可知，精密度和稳定性良好。
花鳗鲡性腺内类固醇类性激素精密度考察结果
2.3.3重复性
首先，配制类固醇类性激素标准品溶液：分别精密称取雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)标准品适量，加乙腈溶解并定容，摇匀，得到标准品溶液，使标准品溶液中每一种类固醇类激素的浓度均为1ppm，之后经过稀释，使标准品中的每一种类固醇类激素的浓度均为100ppb。
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于50mL D-SPE试管(2)(SupertechQ R1A，cat.#55250-1A)，加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、500ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g)。
重复性试验操作方法：
日内重复性试验，精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品分别于18个50mLD-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、100ul、100ul、100ul、100ul、100ul、500ul、500ul、500ul、500ul、500ul、500ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，分别得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g各6个，进样，分析测定。
日内重复性试验，连续三天在相同的时间点，每天精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品分别于3个50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，分别加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、500ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，分别得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g，进样，分析测定。
2.4 8种类固醇类性激素含量测定方法的线性关系
采用UPLC进样分析，获得一系列每种类固醇类性激素浓度分别为1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，40.00ng/g的对照品溶液中类固醇类性激素含量与峰面积的线性关系，以每一种类固醇类性激素色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。
8种类固醇类性激素的回归方程和线性范围
根据上表可知，标准回归方程以色谱峰面积为纵坐标(Y)，化合物质量为横坐标(X)，同时，8种成分在一定线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的相关系数均大于0.993。
2.5 8种类固醇类激素含量测定方法的回收率
首先，配制类固醇类性激素标准品溶液：分别精密称取雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)标准品适量，加乙腈溶解并定容，摇匀，得到标准品溶液，使标准品溶液中每一种类固醇类激素的浓度均为1ppm，之后经过稀释，使标准品中的每一种类固醇类激素的浓度均为100ppb。
精密称定5.0g的未成熟离体花鳗鲡鱼性腺组织样品于不同的50mL D-SPE试管(2)(Supertech Q R1A，cat.#55250-1A)，加入已配制好的类固醇类性激素标准品溶液100ul、500ul、2000ul，经和供试品溶液相同的前处理，得三种不同浓度的待测溶液2.00，10.00，40.00ng/g。
按2.2的优化条件测定，结果如下表所示。由表可知，8种成分的含量测定方法的平均回收率均大于90％，RSD均小于15％，其测定结果的回收率良好。
8种类固醇类性激素加样回收率结果
注：R-1：加标浓度2.00ng/g
R-2：加标浓度10.00ng/g
R-3：加标浓度40.00ng/g
2.6实际样品中8种类固醇类性激素成分含量的测定
取9批不同时期已注射鲤鱼脑垂体溶剂的离体花鳗鲡鱼性腺样品按上述2.1优化的前处理条件处理得供试品溶液，取体积为250ul的供试品溶液采用2.2的优化条件测定，将获得的供试品溶液中类固醇类性激素的色谱峰面积，分别代入相应的标准工作曲线的回归方程中，计算可得到相应类固醇类性激素的含量。具体结果见下表。
9批离体鱼类性腺样品中8种类固醇类性激素的含量比较(空格表示未检测到)
由表可知，9批离体鱼类性腺中8种类固醇类激素，其中，发育前期睾酮的含量平均值为0.96ng/g；表睾酮的含量平均值为9.3ng/g；雌酮的含量平均值为1.01ng/g；雌二醇的含量平均值为1.04ng/g；雌三醇的含量平均值为12.73ng/g，孕酮的含量平均值为1.01ng/g，17α-羟孕酮的含量平均值为8.66ng/g，DHP未检测到；发育中期睾酮的含量平均值为1.36ng/g；表睾酮的含量平均值为7.37ng/g；雌酮的含量平均值为1.00ng/g；雌二醇的含量平均值为2.15ng/g；雌三醇的含量平均值为11.00ng/g，孕酮的含量平均值为0.97ng/g，17α-羟孕酮的含量平均值为17.17ng/g，DHP含量平均值为0.63ng/g；发育后期睾酮的含量平均值为2.11ng/g；表睾酮的含量平均值为2.00ng/g；雌酮的未检测到；雌二醇的含量平均值为2.96ng/g；雌三醇的含量平均值为22.23ng/g，孕酮的含量平均值为2.26ng/g，17α-羟孕酮的含量平均值为77.61ng/g，DHP含量平均值为1.32ng/g。
此外，我们还对河鳗(日本鳗鲡)、鲢鱼、鳙鱼的性腺内类固醇类激素进行了检测，均能实现对8种主要类固醇类激素的定性和定量分析。
综上所述，本发明的一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法及其应用，可以对离体鱼类性腺内8种主要的类固醇类性激素同时进行有效的定性和定量分析，可以比较全面的反映性激素在性腺中累积、传递和代谢过程，为准确评估鱼类的发育时期提供依据。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法，为采用UPLC-MS/MS定性或定量检测离体鱼类性腺内类固醇类性激素，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：称取离体鱼类性腺组织，经前处理，得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：称取未成熟离体鱼类性腺组织样品，加入类固醇类性激素标准品溶液，经和步骤(1)相同的前处理，得对照品溶液；
(3)测定：采用UPLC-MS/MS分别对供试品溶液和对照品溶液进行定性或定量检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述类固醇类性激素选自雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮或17α,20β-二羟基-4-孕烯-3-酮中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述前处理，包括如下步骤：
1)将离体鱼类性腺组织样品，加入匀浆介质，匀浆，得匀浆液；
2)将所得匀浆液超声，离心，冷冻；
3)将所得冷冻后的样品，离心，取上清液进行过滤，将所得过滤液旋转蒸发浓缩，加步骤1)中所用匀浆介质溶解，静置；
4)离心，取上清液进行过滤，得续滤液作为供试品溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述匀浆介质为乙腈、甲醇中的任一种。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，每1g的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质8-15ml。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中，匀浆时可采用两步匀浆法，亦即，第一步：每1g的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质4-6ml，以5000-10000RPM速度匀浆3-8min，得一次匀浆液；第二步：分离所得一次匀浆液，得一次匀浆液上清液和剩余沉淀，向每1g剩余沉淀中加入4-6ml的匀浆介质，以5000-10000RPM速度匀浆3-8min得二次匀浆液，用匀浆介质清洗匀浆机刀头得匀浆机刀头清洗液，最后合并一次匀浆液上清液、二次匀浆液和匀浆机刀头清洗液。
7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，超声时间为5-10min；所述离心为：在0-4℃下，3000-5000RMP离心3-8min；所述冷冻为：-20℃～-40℃下冷却2-8h。
8.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，离心为：在0-4℃的下，以3000-5000RMP离心3-5min；所述旋转蒸发浓缩的温度为35-50℃。
9.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，UPLC所用色谱柱为xBridge-C18；UPLC所用流动相中，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.25mol/L的乙酸铵水溶液。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，MS/MS的色谱条件为：睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮和DHP均采用正离子模式扫描，雌酮、雌二醇和雌三醇均采用负离子模式扫描。
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