CN104880529B - 检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库 - Google Patents

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CN104880529B CN201510348861.3A CN201510348861A CN104880529B CN 104880529 B CN104880529 B CN 104880529B CN 201510348861 A CN201510348861 A CN 201510348861A CN 104880529 B CN104880529 B CN 104880529B
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Abstract

本发明涉及一种用于检测动物源食品中残留药物的液质数据库及其使用方法，该数据库的制备包括如下步骤：(1)标准工作溶液的制备；(2)分析前处理，采用快速酶解+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作；(3)一次性进样色谱分析；(4)构建液质谱库。

Description

检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体而言，涉及一种用于检测动物源食品中残留药物的液质数据库及其使用方法。
背景技术
动物源食品在国际农产品贸易中占相当比重，针对动物源食品中药物残留的法规限制越来越严格，以日本06年5月实施的“肯定列表”制度为例，其对236种兽药和饲料添加剂制定了具体限量标准，而在国内食品安全领域，从早期的“氯霉素、硝基呋喃”到后来的“孔雀石绿、瘦肉精”，因药物残留导致的食品安全事件频发凸显我国食品安全监管控制体系技术支撑能力不足，迫切需要建立多种类残留快速筛选方法。目前，针对动物源食品中药物残留检测技术和方法已由单残留分析发展到了单种类多残留分析，03年以来，以物质种类界分的多残留检测标准占据了残留分析国家和行业标准的70％以上。同时期，质谱分析已经成为多残留检测的主要技术手段，以欧盟2002/657/EC法规为蓝本的技术指标规则也为国际上所承认和接受。随着残留分析技术的发展，多种类残留分析在信息量、检测效率等多方面具有优势使其成为研发热点，且质谱设备领域如Q-TOF，Q-Trap等串联质谱仪的实用化，以高级质谱技术为基础的谱库比对分析逐渐成熟也为多种类残留快速分析提供了技术可能。然而，无论是在方法开发、验证和标准化还是在法规完善等方面，同时检测多种类残留都存在较多困难：
(1)不同种类兽药物化性质差别很大，极性覆盖范围宽，在不同基质中残留形态不一，个别兽药尚需衍生化方能有效检测，因此在通用前处理方法和色谱一次进样分析上难以实现有效突破；
(2)法规对不同兽药(禁用药物和限用药物)的限量要求和使用规定不一，多种类残留检测验证规则尚未完善；
(3)方法开发需要的空白基质难以获得，混合标准溶液制备困难；
(4)仪器的分析能力。在构建液质谱库方面，尽管有商业化谱库如AB公司法医毒物数据库(1250种目标分析物)、兽药数据库(139种目标分析物)；Freiburg大学医院的小分子药物数据库等，但存在如下应用局限：
1)仅有MS/MS数据，无色谱体系信息特征；
2)无在线信息特征；
3)无统一前处理方法和仪器分析相偶联；
4)缺乏基质标准数据。
因此，在现有条件下，很难有效实现基于液质谱库技术的多种类残留快速筛查分析。
发明内容
鉴于目前国内外在动物源食品多种类残留药物分析中存在的样品通用性前处理、仪器快速分析和筛选方法验证等技术难点。本发明以建立动物源食品中高风险药物多种类残留快速筛选检测体系为目的，通过采用多溶剂体系分段组合提取、建立样品高通量通用性前处理技术、综合优化色谱体系实现多目标分析物宽极性范围液相色谱有效保留与分离、并通过构建涵盖色谱-质谱多维信息的液相色谱-质谱/质谱数据库及依据法规要求和检测实践进行筛选方法验证等关键技术内容的研发，突破多种类残留分析技术难关，建立一个以多种类残留通用性前处理技术、快速分离体系和液质谱库为技术特征的开放性快速分析平台和有效筛查检测技术体系。
本发明针对103种限量值在1.0μg/kg以上高风险残留药物(B类残留物质)作为检测目标，该组药物见表1，
表1.目标分析物化学信息
本发明首先涉及一种检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库的构建方法，所述的动物源食品为动物肌肉类食品或奶类食品，具体包括如下步骤，
(1)标准工作溶液的制备；
a.雄性激素类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括群勃龙、甲基睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、去氢睾酮、去氢甲睾酮，配制溶剂为乙腈；
b.孕激素类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括甲羟孕酮、甲羟孕酮乙酸酯、甲地孕酮、乙酸酯孕酮、美仑孕酮、乙酸酯17α-羟孕酮，配制溶剂为乙腈；
c.糖皮质激素类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括倍氯米松、氟氢可的松乙酸酯、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松、可的松，配制溶剂为甲醇；
d.5-硝基咪唑类药物及其代谢产物混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括异丙硝唑、特硝唑、羟基甲硝哒唑、羟基二甲硝咪唑、羟基异丙硝唑，配制溶剂为乙腈；
e.硝基呋喃代谢产物以及2-硝基苯甲醛衍生化硝基呋喃代谢产物混合标准储备溶液(0.01g/L)：呋喃西林代谢产物、呋喃妥因代谢产物、呋喃唑酮代谢产物、呋喃他酮代谢产物及它们各自的2-硝基苯甲醛衍生化物，配制溶剂为乙腈；
f.氟喹诺酮类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括沙拉沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、司帕沙星、双氟沙星、达氟沙星、麻保沙星、奥比沙星、依诺沙星、氟甲喹，配制溶剂为乙腈；
g.喹诺酮类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括吡哌酸、恶喹酸、吡咯酸、萘啶酸，配制溶剂为乙腈；
h.β-受体激动剂类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括沙丁胺醇、叔丁喘宁、莱克多巴胺、沙美特罗、非诺特罗、甲氧酪胺、氯丙那林、喷布洛尔，配制溶剂为乙腈；
i&j.磺胺类物质及其增效剂混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括磺胺嘧啶、磺胺-5-(对)甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺-6-(间)甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺醋酰、磺胺二甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲异嘧啶、磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺硝苯、磺胺苯酰、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺、磺胺脒、甲氧苄啶，配制溶剂为乙腈；
k.大环内酯类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括螺旋霉素、吉他霉素、替米考星、麦迪霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、交沙霉素、泰乐霉素、竹桃霉素、红霉素，配制溶剂为乙腈；
l.林可霉素标准储备溶液(0.01g/L)，配制溶剂为乙腈；
m.四环素类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素，配制溶剂为乙腈；
n.聚醚类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌素、马杜霉素、拉沙洛菌素，配制溶剂为甲醇；
o.染料类物质混合标准储备溶液(0.01g/L)：包括孔雀石绿、隐色孔雀石绿，配制溶剂为甲醇；
99种物质混合标准工作溶液(0.5mg/L)：移取上述各混合标准储备溶液(硝基呋喃代谢产物及其2-硝基苯甲醛衍生物混合标准储备溶液除外)0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，该溶液-20℃可稳定1个月；
103种物质混合标准工作溶液(0.5mg/L)：移取上述各混合标准储备溶液(硝基呋喃代谢产物混合标准储备溶液除外)0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，该溶液-20℃可稳定1个月；
硝基呋喃代谢产物混合标准工作溶液(0.5mg/L)：分别移取硝基呋喃代谢产物混合标准储备溶液0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，该溶液-20℃可稳定3个月。
(2)分析前处理，采用快速酶解(释放结合态残留)+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作，具体的提取净化过程如下：
称取均质样品2g(精确到0.01g)，置于50mL聚四氟乙烯离心管中(如需做添加样品，在此步骤加入适当浓度的混合标准工作溶液，并于暗处放置30min)，加入乙酸铵缓冲液(0.2mol/L,pH 5.2)3.75mL，Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液200μL，β-葡糖苷酸/硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，50℃水浴振荡2h，放冷至室温，于10℃，15000rpm离心5min，得上清为提取液A，留取待用。离心残渣中加入1％甲酸乙腈溶液5mL，涡旋混匀，50℃水浴振荡30min，放冷至室温，于10℃，15000rpm离心5min，将上清于30℃吹至1mL，加入甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液3mL，得提取液B，留取待用。离心残渣中，加入0.1mol/L盐酸溶液3.8mL，2-硝基苯甲醛溶液(称取2-硝基苯甲醛0.15g，甲醇溶解，定容至10mL，)200μL，(如制备硝基呋喃代谢产物添加，可在此步骤加入适当浓度的硝基呋喃代谢产物混合标准工作溶液，并注意要调节加入的液体体积总和为4mL)，涡旋混匀，50℃水浴振荡30min，放冷至室温，于10℃，15000rpm离心5min，得上清为提取液C，分别取提取液A、B、C各400μL于Eppendorf管中，于4℃，20000rpm离心10min，取上清600μL，加入甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液400μL，超声1min，过0.22μM微孔滤膜，液相色谱-串联质谱测定。
(3)一次性进样色谱分析
使用色谱柱为Kinetex C18柱，采用乙腈为有机相，甲酸作为离子化增强剂，甲酸盐作为峰形优化剂，以水相/酸性乙腈的组合作为优化的流动相体系；
具体条件为：色谱柱：Kinetex C18,2.6μm，2.1mm×100mm i.d.；
流速：0.2mL/min；
进样量：10μL；
柱温：30℃；
梯度洗脱程序：(A：0.1％甲酸-乙腈溶液；B：甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液)
0～2min：5％A；
～8min：20％A；
～15min：95％A；
～16min：100％A；
～19min：100％A；
20min：5％A；
(4)构建液质谱库
采用四级杆/离子阱串联质谱的高级采集模式：预设定多反应检测(sMRM)-信息依赖性采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)；
质谱参数确定过程如下：使用初始流动相按目标分析物类别稀释混标储备溶液至浓度为0.2mg/L，然后使用恒流注射泵以5μL/min的流速注入质谱离子源中进行参数优化，
分别使用Q1MS、Q1Multiple Ions、Product Ion、MRM等扫描模式确定目标分析物的母离子，子离子，并使用Ramp功能优化并确定解聚电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)等化合物参数；
质谱条件(API 4000和API 4000Q-TRAP)：
a)离子源：电喷雾离子源；
b)扫描方式：正离子扫描；
c)检测方式：sMRM-IDA-EPI
d)电喷雾电压：5500V；
e)雾化气压力：40psi；
f)气帘气压力：30psi；
g)辅助气压力：45psi；
h)离子源温度：475℃；
i)sMRM参数设置：MRM检测窗口设为60s，目标物扫描时间设为1.4s；
j)IDA规则：响应阈值：3000cps；动态背景扣除；最强离子选择为1到3；
k)增强子离子扫描(EPI)参数设置：扫描质量数范围为70～1000Da；扫描速度为10000Da/s；扫描累加次数为1；碰撞能量为35eV；扩展碰撞能量为15eV；
针对103种B类物质的质谱结果，构建液质谱库。
数据库的构建中使用的建库软件是AB SCIEX公司的Analyst1.5，建库的标准根据设计思路设定为：
(1)给出每个目标分析物使用本研究设定液相色谱条件体系下的RT值；
(2)给出每个目标分析物的相关化学信息(如名称、化学式、分子量、CAS号、化合物类别、ID、分子结构式等)；
(3)给出每个目标分析物至少5张不同条件下的按照3.2.2项所述采集的EPI谱图，即CE为20eV、35eV、50eV及CE为35eV、CES为15eV时4张EPI谱图，此外，至少还要有一张在色谱条件下CE为35eV、CES为15eV时的EPI谱图；
(4)尽量给出不同基质中目标分析物的EPI谱图。
前3条建库标准是必须满足的条件，第4条为根据实际情况的可选标准。
根据以上条件选用的色谱体系和质谱条件实现了包含本发明所述的103种高残留B类物质在内的115种兽药多残留的高效分离。尽管有个别化合物保留时间接近，但其提取离子流图谱均能实现质谱分离，可以进行定量分析，此外，EPI谱库目标分析物碎片信息特征，代表化合物定性的结构“指纹”信息，可以对目标分析物准确定性。由此获得的包含所述B类残留物质的液质信息的液质谱库，能够实现对所述动物源食品中高风险药物多种类残留快速筛选。
在上述色谱和质谱条件下，除了103种B类物质之外，A类12种共115种目标分析物的总离子流图、典型的选择离子流图、各目标分析物提取离子流图及选用CES扩展时(即CE35eV，CES 15eV)的数据库谱图如图1～图4。
本发明还涉及由上述方法构建获得的用于检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库，所述的动物源食品为动物肌肉类食品或奶类食品；
所述的高风险药物为限量值在1.0μg/kg以上高风险残留药物(B类残留物质)作为检测目标，该组药物见表1。
本发明还涉及所述检测动物源食品中高风险药物多种类残留快速筛选液质谱库在检测动物源食品中的药物残留的应用。
本发明还涉及使用所述液质谱库对目标动物源食品中的高风险药物残留进行定性或定量分析的方法，所述方法包括如下步骤，
(1)制备标准溶液，
(2)分析前处理，采用快速酶解(释放结合态残留)+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作，
(3)对待测样本进行色谱和液质分析，获得液质谱图，对比所述液质谱库，进行定性或定量分析检测。
所述的定性分析采用谱库检索进行，定性标准如下：
(1)样品中化合物提取离子流的保留时间与标准溶液或添加样品中目标分析物提取离子流的保留时间相比，变化幅度不超过5％。
(2)目标分析物的母离子/子离子(传输离子对)必须同时出现，且传输离子对的信噪比(S/N)≥3。
(3)样品中化合物EPI谱图与谱库中相近浓度水平(同一个浓度数量级)标准溶液或基质标准溶液EPI谱图相比，谱图匹配纯度(Purity值)≥60。
所述的定量分析的定量方法如下：
使用外标单点法定量，按式(1)计算目标分析物的含量。
X = c × V × 1000 m × R × 1000 - - - ( 1 )
式(1)中：
X-样品中目标分析物含量，μg/kg；
c-样品溶液中目标分析物的浓度，μg/L；
V-样品溶液的定容体积，mL；
m-样品的质量，g；
R-回收率，％。
附图说明
图1.A类物质、B类物质共115种目标分析物的总离子流图。
图2.A类物质、B类物质共115种目标分析物的典型选择离子流图。
图3.A类物质、B类物质共115种目标分析物提取离子流图，图3A，提取离子流图-1，图3B，提取离子流图-2。
图4.B类物质的目标分析物谱库数据图，图4A，谱库数据图-1，图4B，谱库数据图-2。
图5 3段式提取分段测定质量色谱图及第3段硝基呋喃代谢产物提取离子流图。
具体实施方式
实施例1.标准工作溶液的制备
99种物质混合标准工作溶液(0.5mg/L)：移取上述各混合标准储备溶液(硝基呋喃代谢产物及其2-硝基苯甲醛衍生物混合标准储备溶液除外)0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，该溶液-20℃可稳定1个月；
101种物质混合标准工作溶液(0.5mg/L)：移取上述各混合标准储备溶液(硝基呋喃代谢产物混合标准储备溶液除外)0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，该溶液-20℃可稳定1个月；
硝基呋喃代谢产物混合标准工作溶液(0.5mg/L)：分别移取硝基呋喃代谢产物混合标准储备溶液0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，该溶液-20℃可稳定3个月。
实施例2.分析前处理方法
针对103种目标化合物(B组物质)前处理优化，试验设计概念如下：(1)可能的情况下，前处理过程越简单越好；(2)选择广适性提取溶剂；(3)降低溶剂用量，同时尽可能避免溶剂转换造成目标分析物损失；其次，对目标分析物和基质的分析如下：(1)目标分析物中激素类物质、β-受体激动剂类物质需要酶解过程释放结合态残留药物；(2)硝基呋喃代谢产物测定需要酸解和衍生化过程；(3)选择的样品基质种类差别较大，有固态的动物组织(如肌肉)，有液态的动物源产品(牛奶)；(4)目标分析物中有禁用物质和限用物质。
具体的提取净化过程如下：
称取均质样品2g(精确到0.01g)，置于50mL聚四氟乙烯离心管中(如需做添加样品，在此步骤加入适当浓度的混合标准工作溶液，并于暗处放置30min)，加入乙酸铵缓冲液(0.2mol/L,pH 5.2)3.75mL，Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液200μL，β-葡糖苷酸/硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，50℃水浴振荡2h，放冷至室温，于10℃，15000rpm离心5min，得上清为提取液A，留取待用。离心残渣中加入1％甲酸乙腈溶液5mL，涡旋混匀，50℃水浴振荡30min，放冷至室温，于10℃，15000rpm离心5min，将上清于30℃吹至1mL，加入甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液3mL，得提取液B，留取待用。离心残渣中，加入0.1mol/L盐酸溶液3.8mL，2-硝基苯甲醛溶液(称取2-硝基苯甲醛0.15g，甲醇溶解，定容至10mL，)200μL，(如制备硝基呋喃代谢产物添加，可在此步骤加入适当浓度的硝基呋喃代谢产物混合标准工作溶液，并注意要调节加入的液体体积总和为4mL)，涡旋混匀，50℃水浴振荡30min，放冷至室温，于10℃，15000rpm离心5min，得上清为提取液C，分别取提取液A、B、C各400μL于Eppendorf管中，于4℃，20000rpm离心10min，取上清600μL，加入甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液400μL，超声1min，过0.22μM微孔滤膜，液相色谱-串联质谱测定。
针对上述设计思路，经过试验，确定了如前处理程序。前处理步骤中，乙酸铵缓冲液的加入是提供酶解的pH值环境，加入Na2EDTA-Mcllvaine溶液是促进四环素和大环内酯类物质的提取，以防止它们与组织或提取环境中的二价或三价金属阳离子形成螯合物[18]。第二阶段选用乙腈作为提取溶剂是因为：(1)乙腈可以和水混溶，也是广适性提取溶剂[13]；(2)相比甲醇、乙酸乙酯等常用提取试剂，乙腈提取液基质干扰相对较小；(3)乙腈可以沉淀蛋白；(4)乙腈可以使酶变性，降低提取过程中对分析物的降解作用。对乙腈进行1％甲酸酸化是我们在研究磺胺和沙星多残留提取时确定的提取溶剂，同时酸化乙腈是提取多残留的有效溶剂。对1％甲酸乙腈提取液进行浓缩的目的主要是调节有机相和水相的比例以适应色谱起始流动相。第三阶段进行的是呋喃代谢产物的酸解和衍生化。由于之前(第一阶段)进行了酶解，酸解的时间可以在较短的时间内完成，而衍生化的速度很快，30min内可以完成酸解和衍生化，期间控制衍生化试剂和盐酸溶液的体积主要是保证稀释倍数的统一。方法最后采用20000rpm冷冻离心的目的也是尽可能的去除基质中的大分子物质，而调节体积主要是均一化稀释倍数。
此3段式提取步骤中，有如下关键点：(1)酶解条件对目标物的提取的影响；(2)呋喃代谢产物在第一节段和第二阶段的提取过程中，结合态的呋喃代谢产物是否会解离为游离态而被提取；(3)酸解和衍生化时间对目标物的提取的影响。为确定这几个关键点，我们使用能力验证样品(动物给药后获得的阳性样品)对该方法进行了验证。实验设计和结果见表8。
表8 3段式前处理方法设计验证及结果表
a除表中列出的关键点外，其余前处理过程均参照2.3.2所述进行。
b该回收率是以使用CNAL认可的方法(这两类目标分析物均采用同位素内标法定量，回收率范围90％～110％)测得的值为基准换算而得。
C在目标分析物保留时间窗口内，无明显提取离子流色谱峰。
针对B组物质，我们期望的STC为0.5μg/kg，使用呋喃他酮代谢产物阳性肌肉基质，我们在0.5μg/kg水平上进行了混标添加，对3段提取液进行分别测定，结果见图5。
图5可见，由于未进行进一步的冷冻高速离心，样品基质效应较大，有明显的基质干扰峰。但是3段式提取的总体效果明显可见；部分化合物在第一阶段就被完全提取，而部分化合物在第一和第二阶段均有提取，在第三阶段，几乎没有别的目标分析物，而呋喃代谢产物是主要的提取目标物，由于使用了AMOZ的阳性基质，与混标中的AMOZ产生了信号叠加，故AMOZ响应较高。
综上，在设计和优化B组103种物质的前处理过程中，我们针对不同种类的目标分析物的不同的化学性质和残留特性，设计了合理的提取流程和尽量提高样品通量的操作方法，引入并成功运用了“高速冷冻离心技术”、“Dilute and Shoot”通用性样品前处理概念，实现了103种目标分析物的有效前处理。结果证明，“Dilute and Shoot”是最简单的样品制备策略，尤其适用于多种类残留的测定。
实施例3.一次性进样色谱分析体系研究
1.色谱柱的选择
多目标分析物的液相色谱分离目前通常考虑使用超微颗粒(粒径＜2μm)色谱柱，但本研究采用常规HPLC系统，其耐压上限是400Bar，故无法使用超高效液相色谱柱。为实现设计的分离目的，考虑系统压力限制将色谱柱的粒径范围控制在2μm～3μm之间，色谱柱长度范围为100mm～150mm；此外，由于化合物种类较多，极性范围跨度较大，在色谱柱类型方面就选择了适宜于分离宽极性范围的C18色谱柱。通过上述限定，本研究依据极性(参考LogD值选择)选择了每类化合物中的一种，一共4种物质作为分析物代表筛查了4种类型的液相色谱柱。筛选条件及结果见表2。
表2 色谱柱选择性实验设计及分离分析结果
由上表可见，相比其他色谱柱，Kinetex C18柱分离度和灵敏度均较好。虽然该色谱柱粒径最小，但其柱背压仍在常规液相耐压范围内。而且填充颗粒采用了先进的核-壳技术，与传统完全多孔硅胶柱相比，能明显改善分离度和灵敏度。研究确定使用该型色谱柱为优选分离柱。
2.流动相体系的选择及其他色谱条件的确定
对质谱分析常用流动相(水、甲酸-水溶液、乙酸-水溶液、甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈、甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液等)及组成使用103种混合标准工作液进行了筛选。在综合考虑分离度、灵敏度和分析时间等因素的基础上，最终确定采用乙腈为有机相，甲酸作为离子化增强剂，甲酸盐作为峰形优化剂，以水相/酸性乙腈的组合作为优化的流动相体系。
对进样量、柱温和流速等液相色谱参数进行优化，主要的考量因素包括色谱分辨、灵敏度、重现性和基质效应等。通过使用103种目标物混合标准溶液在筛选目标浓度水平(0.5μg/kg)上进行色谱分离试验并确定优化值。
在优化相关参数和比较多次试验结果的基础上，本研究确定的一次性液相色谱分离体系的具体条件为：色谱柱：Kinetex C18,2.6μm，2.1mm×100mm i.d.；流速：0.2mL；进样量：10μL；柱温：30℃。梯度洗脱程序：(A：0.1％甲酸-乙腈溶液；B：甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液)0-2min：5％A；8min：20％A；15min：95％A；16-19min：100％A；20-35min：5％A。
实施例4.液质谱库构建——质谱采集方法的建立
质谱采集方法的建立
本研究采用了四级杆/离子阱串联质谱的高级采集模式：预设定多反应检测(sMRM)-信息依赖性采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)。该采集模式的建立，首先要确定目标分析物在色谱体系中保留时间，其次建立多反应监测(MRM)质谱方法，然后设定触发EPI采集的条件(即IDA设定)，最后是确定EPI采集的条件设定。
为建立相应的质谱采集方法，首先对103种目标分析物的质谱参数进行试验设定。研究采用先分类优化化合物参数(包括母离子、子离子及解聚电压、碰撞能量等)，再选取代表化合物优化离子源参数(包括雾化气压力、离子源温度等)。
①化合物参数优化确定。有关RT参数的设定依据色谱分离结果。质谱参数确定过程如下：使用初始流动相按目标分析物类别稀释混标储备溶液至浓度为0.2mg/L，但要注意同一类别中有相同分子量的目标分析物要单独配制(因为被研究使用仪器为标准分辨，无法区分同分异构体)，然后使用恒流注射泵以5μL/min的流速注入质谱离子源中进行参数优化。分别使用Q1MS、Q1Multiple Ions、Product Ion、MRM等扫描模式确定目标分析物的母离子，子离子(每种目标分析物至少选取2对传输离子备用，在后续试验中根据响应的信噪比和空白基质中的干扰情况选取最优的一对离子作为sMRM的采集离子)，并使用Ramp功能优化并确定解聚电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)等化合物参数，103种物质化合物参数优化结果见表3。
表3 103种目标分析物优化质谱条件及参考保留时间
注:目标分析物的保留时间仅供参考，因为化合物数量较多，一些目标分析物保留时间十分接近，流动相的细微变化都会导致保留时间的变动，个别化合物的前后顺序会有变动。
②离子源参数的优化确定。采用流动注射分析(FIA)优化，因仪器对优化离子对的数目有限制本研究采用代表化合物进行优化，代表化合物选取原则是采用化合物参数优化时响应相对较低的目标分析物，经试验，离子源参数优化结果如下：气帘气压力：30psi；喷雾电压：5500V；离子源温度：475℃；雾化气压力：40psi；辅助气压力：45psi。
③IDA条件设定。在IDA条件设定中，最重要的是响应阈值的测定，在筛选目标浓度水平(0.025μg/kg)上分析基质标准(使用“空白基质”提取液配制的标准溶液)，以最低响应物质响应强度的1/2为度设定响应阈值。需要说明的是，该阈值具有基质依赖性，不同的基质阈值有所不同，通常情况下，阈值设定原则为尽可能保证所有满足筛查目标浓度的响应均可触发EPI采集，同时尽量提高阈值以减少数据采集量(易于分析)。本研究中考察了两种动物源基质(动物肌肉、奶)，以最低值设定为3000cps。
其次，在IDA设定种还要选择仪器动态背景扣除功能，能有效减少无效数据的产生。
④EPI参数的设定。
a)EPI采集质量数范围：本研究中103种目标分析物分子离子峰的质量数范围为140Da～940Da，碎片离子质量数范围80Da～880Da，故EPI采集质量数范围设定在70Da～1000Da；
b)EPI采集扫描速度：本研究使用设备为AB SCIEX 5500Q-Trap质谱仪，EPI采集共有1000Da/s、10000Da/s和20000Da/s 3档速度，为保证数据质量，选择10000Da/s为EPI采集扫描速度，这样既兼顾103种目标分析物的分析采集速率，又保证了谱图质量；
c)EPI采集DP值和EP值的设定：为保证谱库数据质量，对103种目标分析物DP值和EP值进行分段统计，取高比例区段的中位值为最终设定值。
经分析，目标化合物DP值在60V～100V区段比例加大，取中位值80V为EPI采集的DP设定值。同样的，目标组化合物EP值在9V～11V区段比例较大，取中位值10V作为EPI采集的EP设定值。确定DP和EP设定值后，对DP值和EP值EPI采集，证实设定的DP值和EP值对这类化合物的EPI数据采集质量无明显影响；
d)EPI采集碰撞能量(CE)值的设定，参照表3，一般常见化合物的CE值在20eV～30eV，但是个别化合物如结晶紫的CE值在45～60eV时，才有质量较高的碎片数据。为此，先固定CE值为35，再设定扩展CE值(CES)为5、10、15等3种组合考查EPI谱图质量。最后选取CE为35eV，CES为15eV(相当于CE分别为20eV、35eV、50eV时3张谱图的累加平均)作为EPI采集的CE设定，该设定值能够较好的兼顾高、中、低碰撞能量段，可获得高质量的数据谱图。在上述色谱和质谱条件下，115种目标分析物(A类物质+B类物质)的总离子流图如图1所示；典型的选择离子流图如图2所示；各目标分析物提取离子流图如图3所示，选用CES扩展时(即CE35eV，CES 15eV)的数据库谱图如图4所示。
实施例5.液质谱库构建——液质谱库构建
通过以上实施例4的方法，建立了包括B类103种目标分析物在内的115种高残留风险的化合物的质谱高级采集方法(sMRM-IDA-EPI)，可利用此模式进行筛查采集(使用sMRM的采集离子对)，然后对符合筛查规则(浓度响应超过筛选目标浓度)的目标物进行EPI采集，获取详细的离子信息以进行定性分析。
液质谱库构建
①在线EPI谱图数据采集。使用103种目标物混合标准工作液使用流动相稀释后配制浓度为筛选目标浓度水平的混合标准溶液，上机分析以sMRM-IDA-EPI方式采集在线EPI数据，使用Analyst1.5软件构建谱库，并完善目标分析信息(如中英文名称、化学式、CAS号、化学结构图等)。
②离线EPI谱图数据采集。使用分类配制的标准储备液(如同类中有同分异构体，需要单独进样)使用流动相稀释至0.2mg/L，直接质谱进样，参照在线EPI条件采集离线EPI数据，此外再单独采集3个CE水平(低、中、高)EPI谱图，可依据化合物实际性质采用优化的碰撞能量。将上述采集数据录入谱库。
③液质谱库判定使用规则。谱库检索是最有效的定性手段之一，但是在液质谱库检索的匹配规则制定方面目前尚无任何法规和技术规定。本研究依据欧盟和美国相关规定确定了保留时间和信噪比的判定规则；EPI谱图比对临界匹配因子的确定采用10个“空白基质”(肌肉、奶样品各5个)配制基质标准，与EPI谱库中的标准EPI图谱使用Analyst 1.5软件进行匹配分析，获取纯度值(purity)，获取平均值和标准偏差。经比对，所有目标物Purity平均值减去标准偏差均大于60，为最大限度控制假阴性率，本研究确定purity值60为临界匹配因子。综上，研究确定的谱库检索规则为：
a)样品中化合物提取离子流的保留时间与标准溶液或添加样品中目标分析物提取离子流的保留时间相比，变化幅度不超过5％；
b)表3中所列目标分析物的母离子/子离子(传输离子对)必须同时出现，且传输离子对的信噪比(S/N)≥3；
c)谱图匹配纯度(Purity值)或临界匹配因子≥60。
谱库比对定性功能强大，因其提供的信息较多。根据欧盟2002/657/EC规定，本研究采集模式可获得确证点数≥5.5(欧盟最严格的禁用兽药仅要求确证点数≥4)。因此如果谱库检索匹配的话，可以对目标分析物进行快速定性确证。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用于对本发明保护范围的确定。

Claims (7)

1.一种检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库的构建方法，具体包括如下步骤，
(1)标准工作溶液的制备；
(2)分析前处理，采用快速酶解释放结合态残留+快速固相萃取的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作；
(3)一次性进样色谱分析；
(4)构建液质谱库；
所述的动物源食品为动物肌肉类食品或奶类食品，
所述的高风险药物为限量值在1.0μg/kg以上高风险残留药物103种，具体为：
a.雄性激素8种：群勃龙、甲基睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、去氢睾酮、去氢甲睾酮；
b.孕激素6种：甲羟孕酮、甲羟孕酮乙酸酯、甲地孕酮、乙酸酯孕酮、美仑孕酮、乙酸酯17α-羟孕酮；
c.糖皮质激素6种：倍氯米松、氟氢可的松乙酸酯、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松、可的松；
d.硝基咪唑及代谢物5种：异丙硝唑、特硝唑、羟基甲硝哒唑、羟基二甲硝咪唑、羟基异丙硝唑；
e.硝基呋喃代谢产物4种：呋喃西林代谢产物、呋喃妥因代谢产物、呋喃唑酮代谢产物、呋喃他酮代谢产物；
f.氟喹诺酮类14种：沙拉沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、司帕沙星、双氟沙星、达氟沙星、麻保沙星、奥比沙星、依诺沙星、氟甲喹；
g.喹诺酮类4种：吡哌酸、恶喹酸、吡咯酸、萘啶酸；
h.β激动剂类8种：沙丁胺醇、叔丁喘宁、莱克多巴胺、沙美特罗、非诺特罗、甲氧酪胺、氯丙那林、喷布洛尔；
i.磺胺类24种：磺胺嘧啶、磺胺-5-(对)甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺-6-(间)甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺醋酰、磺胺二甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲异嘧啶、磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺硝苯、磺胺苯酰、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺、磺胺脒；
j.磺胺增效剂1种：甲氧苄啶；
k.大环内酯类11种：螺旋霉素、吉他霉素、替米考星、麦迪霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、交沙霉素、泰乐霉素、竹桃霉素、红霉素；
l.林可霉素；
m.四环素类4种：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素；
n.聚醚类5种：盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌素、马杜霉素、拉沙洛菌素；
o.染料类2种：孔雀石绿、隐色孔雀石绿；
其中，步骤(1)所述的标准工作溶液的制备方法为：
a.雄性激素类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括群勃龙、甲基睾酮、诺龙、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、去氢睾酮、去氢甲睾酮，配制溶剂为乙腈；
b.孕激素类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括甲羟孕酮、甲羟孕酮乙酸酯、甲地孕酮、乙酸酯孕酮、美仑孕酮、乙酸酯17α-羟孕酮，配制溶剂为乙腈；
c.糖皮质激素类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括倍氯米松、氟氢可的松乙酸酯、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松、可的松，配制溶剂为甲醇；
d.硝基咪唑类药物及其代谢产物混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括异丙硝唑、特硝唑、羟基甲硝哒唑、羟基二甲硝咪唑、羟基异丙硝唑，配制溶剂为乙腈；
e.硝基呋喃代谢产物混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：呋喃西林代谢产物、呋喃妥因代谢产物、呋喃唑酮代谢产物、呋喃他酮代谢产物配制溶剂为乙腈；
f.氟喹诺酮类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括沙拉沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、司帕沙星、双氟沙星、达氟沙星、麻保沙星、奥比沙星、依诺沙星、氟甲喹，配制溶剂为乙腈；
g.喹诺酮类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括吡哌酸、恶喹酸、吡咯酸、萘啶酸，配制溶剂为乙腈；
h.β受体激动剂类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括沙丁胺醇、叔丁喘宁、莱克多巴胺、沙美特罗、非诺特罗、甲氧酪胺、氯丙那林、喷布洛尔，配制溶剂为乙腈；
i&j.磺胺类物质及磺胺增效剂混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括磺胺嘧啶、磺胺-5-(对)甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺-6-(间)甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺醋酰、磺胺二甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲异嘧啶、磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺硝苯、磺胺苯酰、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺、磺胺脒、甲氧苄啶，配制溶剂为乙腈；
k.大环内酯类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括螺旋霉素、吉他霉素、替米考星、麦迪霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、交沙霉素、泰乐霉素、竹桃霉素、红霉素，配制溶剂为乙腈；
l.林可霉素标准储备溶液，浓度0.01g/L，配制溶剂为乙腈；
m.四环素类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素，配制溶剂为乙腈；
n.聚醚类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌素、马杜霉素、拉沙洛菌素，配制溶剂为甲醇；
o.染料类物质混合标准储备溶液，浓度0.01g/L：包括孔雀石绿、隐色孔雀石绿，配制溶剂为甲醇；
除e类以外99种物质混合标准工作溶液，浓度0.5mg/L：移取上述各混合标准储备溶液0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀；
103种物质混合标准工作溶液，浓度0.5mg/L：移取上述各混合标准储备溶液0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀；
e类硝基呋喃代谢产物混合标准工作溶液，浓度0.5mg/L：分别移取硝基呋喃代谢产物混合标准储备溶液0.5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀；
步骤(2)的具体步骤如下，
(1)称取均质样品2g，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入浓度0.2mol/L，pH 5.2乙酸铵缓冲液3.75mL，Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液200μL，β-葡糖苷酸/硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，50℃水浴振荡2h，放冷至室温；
(2)于10℃，15000rpm离心5min，得上清为提取液A，留取待用；
(3)离心残渣中，加入1％甲酸乙腈溶液5mL，涡旋混匀，50℃水浴振荡30min，放冷至室温；
(4)于10℃，15000rpm离心5min，将上清于30℃吹至1mL，加入浓度5mmol/L甲酸铵-浓度0.1％甲酸-水溶液3mL，得提取液B，留取待用；
(5)离心残渣中，加入0.1mol/L盐酸溶液3.8mL，2-硝基苯甲醛溶液200μL，，涡旋混匀，50℃水浴振荡30min，放冷至室温；
(6)于10℃，15000rpm离心5min，得上清为提取液C；
(7)分别取提取液A、B、C各400μL于Eppendorf管中，于4℃，20000rpm离心10min，取上清600μL，加入浓度5mmol/L的甲酸铵-浓度0.1％的甲酸-水溶液400μL，超声1min，过0.22μM微孔滤膜，液相色谱-串联质谱测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，针对e类硝基呋喃代谢产物时，所述前处理具体步骤中，步骤(5)为：离心残渣中，加入0.1mol/L盐酸溶液3.8mL，2-硝基苯甲醛溶液200μL，加入适当浓度的硝基呋喃代谢产物混合标准工作溶液，并调节加入的液体体积总和为4mL，涡旋混匀，50℃水浴振荡30min，放冷至室温。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的一次性进样色谱分析方法如下，
使用色谱柱为Kinetex C18柱，采用乙腈为有机相，甲酸作为离子化增强剂，甲酸盐作为峰形优化剂，以水相/酸性乙腈的组合作为优化的流动相体系；
具体条件为：色谱柱：Kinetex C18,2.6μm，2.1mm×100mm i.d.；
流速：0.2mL；
进样量：10μL；
柱温：30℃；
梯度洗脱程序如下表：
A洗脱液为：0.1％甲酸-乙腈溶液；
B洗脱液为：浓度5mmol/L甲酸铵-0.1％甲酸-水溶液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述构建液质谱库方法为：
采用四级杆/离子阱串联质谱的高级采集模式：预设定多反应检测-信息依赖性采集-增强子离子扫描；
API 4000和API 4000Q-TRAP下质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：sMRM-IDA-EPI
电喷雾电压：5500V；
雾化气压力：40psi；
气帘气压力：30psi；
辅助气压力：45psi；
离子源温度：475℃；
sMRM参数设置：MRM检测窗口设为60s，目标物扫描时间设为1.4s；
IDA规则：响应阈值：3000cps；动态背景扣除；最强离子选择为1到3；
增强子离子扫描参数设置：扫描质量数范围为70～1000Da；扫描速度为10000Da/s；扫描累加次数为1；碰撞能量为35eV；扩展碰撞能量为15eV；
针对103种高风险药物的质谱结果，构建液质谱库。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，数据库的构建中使用的建库软件是ABSCIEX公司的Analyst1.5，建库的标准根据设计思路设定为：
步骤(1)，给出每个目标分析物使用本研究设定液相色谱条件体系下的RT值；
步骤(2)，给出每个目标分析物的相关化学信息，所述相关化学信息包括名称、化学式、分子量、CAS号、化合物类别、ID、分子结构式；
步骤(3)，给出每个目标分析物至少5张不同条件下采集的EPI谱图。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括步骤(4)，给出不同基质中目标分析物的EPI谱图。
7.由权利要求1-6任一所述方法制备获得的检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库在检测动物源食品中的药物残留的应用，
所述的动物源食品为肌肉类食品或奶类食品；
所述的高风险药物为权利要求1所述的限量值在1.0μg/kg以上高风险残留药物；
所述检测动物源食品中的药物残留的应用包括如下步骤：
(1)制备标准溶液，
(2)分析前处理，采用快速酶解+快速固相萃取的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作，
(3)对待测样本进行色谱和液质分析，获得液质谱图，对比所述液质谱库，进行定性或定量分析检测；所述的定性分析采用谱库检索进行，定性标准为：
1)样品中化合物提取离子流的保留时间与标准溶液或添加样品中目标分析物提取离子流的保留时间相比，变化幅度不超过5％；
2)目标分析物的母离子/子离子必须同时出现，且传输离子对的信噪比≥3；
3)样品中化合物EPI谱图与谱库中相近浓度水平标准溶液或基质标准溶液EPI谱图相比，谱图匹配纯度≥60；
所述的定量分析的方法如下：
使用外标单点法定量，按式(1)计算目标分析物的含量，
式(1)：
其中：
X-样品中目标分析物含量，μg/kg；
c-样品溶液中目标分析物的浓度，μg/L；
V-样品溶液的定容体积，mL；
m-样品的质量，g；
R-回收率，％。
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