CN106596819B - 一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法 - Google Patents

一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106596819B
CN106596819B CN201611046606.4A CN201611046606A CN106596819B CN 106596819 B CN106596819 B CN 106596819B CN 201611046606 A CN201611046606 A CN 201611046606A CN 106596819 B CN106596819 B CN 106596819B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
solution
veterinary drug
kinds
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611046606.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106596819A (zh
Inventor
陈树兵
陈先锋
李双
朱海强
方科益
劳华均
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NINGBO ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU TECHNICAL CENTER OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA
Original Assignee
NINGBO ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU TECHNICAL CENTER OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NINGBO ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU TECHNICAL CENTER OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA filed Critical NINGBO ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU TECHNICAL CENTER OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA
Priority to CN201611046606.4A priority Critical patent/CN106596819B/zh
Publication of CN106596819A publication Critical patent/CN106596819A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106596819B publication Critical patent/CN106596819B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，特点是具体步骤如下：（1）基于载体辅助液液萃取技术通过一次性前处理，完成涵盖了理化性质差异很大的常见8大类，共计99种兽药残留的提取、净化工作；（2）混合标准溶液组成和基质标准曲线制备；（3）利用超高效液相色谱‑三重四极杆串联质谱联用测定待测样品中99种兽药残留的浓度；优点是该方法的前处理和仪器分析过程针对不同理化性质的化合物兼容性强，检测效率高，可操作性强，检测限能满足所有受试的目标物并且降低了检测成本。

Description

一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法
技术领域
本发明涉及一种兽药残留检测方法，尤其是涉及一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法。
背景技术
兽药的种类很多，残留毒理学意义较大的兽药按其用途可以分类主要包括：抗生素类、合成抗菌素类、抗寄生虫类、生长促进剂和杀虫剂等。根据联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)兽药残留联合立法委员会的定义，兽药残留(veterinary drugresidues)是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及与兽药有关的杂质。[1]由于兽药残留的对人体的危害极大，因此动物源性食品中的兽药残留是世界各国食品安全检测的重要指标，我国政府也制定了一系列法律法规和技术标准限制兽药残留的超标。
然而，综观近年来中国畜牧业的发展，由于养殖条件的差异和利益驱使等因素的影响，兽药残留超标现象时有发生。据报道，我国每年食品中毒人数高达2万～4万人，而专家估计这个数字尚不到实际发生数的1/10。2009年，广州市民食用含“瘦肉精”猪肝70多人食物中毒。刘军等对135份鲜牛乳中的四环素类抗生素残留进行了检测，金霉素、土霉素、四环素残留的检出率分别为8％、18％、14％；张莉等对哈尔滨市市售鸡肉、鸡肝中的土霉素残留进行了检测，阳性率分别为64％，80％。另外，动物源性食品中激素类药物残留的情况也非常普遍，郭子侠等对北京市售的动物鞭、胎盘、蛇、甲鱼等动物原料生产的保健食品进行了检测，检出率分别为32.6％，47.8％，32.6％和15.2％；还对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸡蛋、鱼、牛奶等七类动物性食品中的雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、睾酮类5种性激素进行了调查，结果显示7类上述食品的激素检出率均超过20％。2012年，肯德基供应商-六和集团被曝光对原料鸡养殖过程中所用抗生素种类达18种，其中很多抗生素停药期不停用；此外还有一些养鸡场在使用国家禁用的地塞米松激素类药物。
这些事件的屡有发生对兽药残留检测技术提出了更高的要求。目前，我国可以用于兽药残留检测的国家标准多达数十个，但大多是按照兽药类别建立的仅仅适用于某一种动物源性食品中某一类兽药残留的分析方法。这些方法的样品前处理过程各异，耗时较长，检测项目覆盖范围小，无法满足多残留筛查的需求。因此，研究建立动物源性食品中多种类兽药残留高通量筛查技术对于有效提高监管工作效率，保障我国人民的食品安全具有非常重要的意义。
兽药残留分析方法包括了样品前处理技术和仪器分析技术。由于兽药残留水平很低，样品基质复杂、干扰物质多，不易进行分离、纯化，因此样品前处理是整个兽药残留分析检测过程中耗时最长、劳动强度最大、同时也是产生误差最多的一个环节。常见的兽药残留样品前处理技术有固相萃取、固相微萃取、基质分散固相萃取、免疫亲和色谱技术、分子印迹技术、超临界流体萃取、加速溶剂萃取等，这些前处理方法在兽药残留分析中的应用各有其特点,但都存在有选择性限制的缺点，样品处理通量也不够高。为了能够同时分析检测不同物理和化学性质的多种兽药残留，需要发展非选择性的高通量样品制备方法。
QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，safe)法因其具有快速、简单、便宜、有效、耐用和安全可靠等特点而得名，在农药多残留检测中得到了广泛的应用。随着应用推广的不断展开，QuEChERS法在兽药残留检测方面的应用也日趋增多。牛乳、鸡蛋、肝脏、肌肉组织中的磺胺类、喹诺酮类、苯并咪唑类、阿维菌素类等兽药残留的QuEChERS检测方法均有报道。尽管目前QuEChERS法在兽药残留高通量分析检测方面已经有了较多的应用，但已有的研究表明应用QuEChERS方法在测定例如青霉素类、四环素类、喹诺酮类等极性较强的兽药时，存在着回收率低，无法满足残留分析要求的不足。
载体辅助液液萃取(Supported Liquid-Liquid Extraction，SLLE)是一项重要的样品前处理技术，它以硅藻土等为固体载体，保留吸附含水提取溶液中的待测化合物，再以与其不相容的有机溶剂洗脱达到样品提取、净化、浓缩的目的，在农药残留、药物分析等领域有着广泛的应用。与传统液液萃取相比，SLLE无需借助分液漏斗及大量有机溶剂多次提取待测组分，操作步骤简单、溶剂用量小、不易发生乳化、重现性好等优点。
仪器分析技术随着质谱的发展和推广，一次分析检测完成多个或多类残留已成为可能。近年来，动物源食品中兽药残留正逐渐由用液相色谱-三重四级杆质谱(LC-MS/MS)进行目标型检测向用高分辨质谱(HRMS)进行精确质量非目标型全扫描检测转变。传统的LC-MS/MS在定量分析上有一定的优势，但也存在不足，如：只有质谱方法中涵盖的化合物才可被检测到，分析化合物数量有限，需要对每种化合物进行参数优化，比较耗时，对基质的干扰比较敏感，相关的样品制备方法较为复杂；分辨率低，不能有效区分分子量相近的化合物，会造成假阳性结果等。与LC-MS/MS相比，HRMS主要依靠精确质量数(可精确到小数点第4位)和保留时间来对待测物进行定性识别。
静电场轨道阱高分辨质谱(Orbitrap MS)是近年来新兴的一种傅里叶转换高分辨质谱，其参数设定简单，基于真实高分辨能力的高准确度，真实的同位素峰型分布测定能力，其精确质量数可以给出元素组成，从而提供待测物结构信息，能够更彻底地排除基质干扰，将质量数非常相近的样品背景基质干扰物质和待测物区分开，大大降低了分析检测中对色谱分离的要求。Orbitrap MS可通过全扫描进行非定向和未知化合物的筛选，需要增加目标化合物时，不必再次处理样品和进样，重新分析已有的全扫描数据即可；还可进行多级扫描，通过再打碎得到MS/MS谱图进行谱库检索或者与标准物质比对来确证待测物。
刘鑫等利用Quadrupole Orbitrap MS同时检测了鸡肉中喹诺酮类、磺胺类、β-受体激动剂类等81种兽药残留，试样经乙腈超声提取，浓缩后用体积分数50％乙腈溶液定容后上机测定。试验结果表明：各组分线性关系良好，线性回归系数均在0.98以上。取10ng/mL基质加标液，重复进样5次，各组分重复性良好，RSD均在15％以内。实际样品中待测组分的结果确认借助通过标准物质建立的二级质谱库检索比对来完成。Hurtaud-Pessel等通过两步萃取，利用LTQ-Orbitrap-MS全扫描方式筛查了肉类样品中青霉素、先锋霉素、磺胺类等多种兽药的残留情况。
尽管已有一些学者开始研究动物源性食品中多种兽药残留的分析方法，但这些方法样品前处理过程往往仅适用于某一些动物源性食品，检测的项目也仅仅局限于某一类或几类兽药的残留，还不能完全满足动物源性食品中多种类兽药残留的监控要求。因此，亟需建立一种能完全满足动物源性食品中多种类兽药残留检测的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，该方法的前处理和仪器分析过程针对不同理化性质的化合物兼容性强，检测效率高，可操作性强，检测限能满足所有受试的目标物并且降低了检测成本。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，具体步骤如下：
(1)样品前处理
称取液体样品5.00g或者浓度为1g/mL的固体水溶液5mL于50mL离心管中，加入5mL提取液，10mL乙腈，涡旋充分混匀，以4500r/min离心5min，上清液转移至另一50mL离心管中，再在上清液中加入1g硫酸铵，充分混匀后离心5min，得到上层乙腈相和下层水相，取下层水相过硅藻土柱，下接50ml离心管，并加入0.5ml二甲基亚砜得到上样液；将上样液上硅藻土柱后平衡15分钟，然后将上层乙腈相过硅藻土柱进行洗脱，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗离心管中残余的上样液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脱液用纯乙腈定容至25ml；将定容液均分为2份，分别置于15ml具刻度离心管中，在微弱的氮气流下吹干至1ml，用纯水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml离心管中，于-4℃，15000r/min下离心10min，然后取400μL上清液置于带衬管的进样瓶中进样分析；同时做试剂空白样品；其中所述提取液的制备方法为：称取4.3g的草酸和3.7g的乙二胺四乙酸二钠，用500ml的水溶解，氨水调pH至3.0；
(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备
A.混合标准溶液组成：
磺胺类包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲异嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶，磺胺喹恶啉，磺胺二甲恶唑，磺胺二甲异恶唑，磺胺甲恶唑，磺胺噻唑，磺胺氯哒嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧苄胺嘧啶和磺胺胍，各成分浓度均为1.0μg/mL；
喹诺酮类包括乙胺嘧啶,环丙沙星，恩诺沙星，氧氟沙星，诺氟沙星，沙拉沙星，培氟沙星，奈啶酸，奥索利酸，氟甲奎，吡哌酸，西诺沙星，麻保沙星，司帕沙星，双氟沙星，单诺沙星，奥比沙星，洛美沙星和依诺沙星，各成分浓度均为1.0μg/mL；
激素类包括可的松，泼尼松，甲基泼尼松龙，炔诺酮，炔雌醇，醋酸美仑孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羟孕酮，雌酮，氢化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睾酮，泼尼松龙，雌二醇，己烯雌酚，甲睾酮，表睾酮，丙酸睾酮，苯甲酸雌二醇，追宝龙，诺龙，甲孕酮和17α-羟基孕酮，各成分浓度均为0.1μg/mL；
红霉素类包括红霉素，替米考星，竹桃霉素，泰乐霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分浓度均为0.1μg/mL；
孔雀石绿类包括孔雀石绿，隐色孔雀石绿，结晶紫和隐色结晶紫，各成分浓度均为0.1μg/mL；
青霉素类包括氨苄青霉素，乙氧萘青霉素，邻氯青霉素，头孢氨苄，双氯青霉素，青霉素G和阿莫西林，各成分浓度均为1.0μg/mL；
四环素类包括土霉素，强力霉素，金霉素和四环素，各成分浓度均为1.0μg/mL；
氨苯砜类包括金刚乙胺，苯乙醇胺A，N-乙酰氨苯砜，氨苯砜，金刚烷胺，吡喹酮和氯丙嗪，各成分浓度均为0.1μg/mL；
B.基质标准曲线定量：
在空白样品中分别加入上述8类混合标准溶液0μL，10μL，20μL，40μL，100μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；其中响应值＝标准品峰面积/标准品质量；
(3)超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定
A.高效液相分离
色谱柱：Hypersile Gold C18色谱柱，若测定激素成分则采用的型号为100mm x2.1mm，1.9μm，若测定混合标准溶液中的其余成分则采用的型号为100mm x 2.1mm，3μm；若测定激素成分，则流动相A：含有0.1wt％氨水的甲醇溶液；流动相B：含有0.1wt％氨水的水-甲醇溶液，其中水与甲醇的体积比为95：5；
若测定混合标准溶液中的其余成分则：流动相A：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸铵的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为95：5；流动相B：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸铵的水-乙腈溶液，其中水与乙腈的体积比为95:5；
流速：0.3mL/min；
进样量：10mL；
若测定激素成分HPLC洗脱程序如下：
；
若测定混合标准溶液中的其余成分则HPLC洗脱程序如下：
B.质谱检测
离子源：HESI-II；
喷雾电压：若测定激素成分则采用正离子模式3800V/负离子模式2700V；若测定混合标准溶液中的其余成分则采用正离子模式3800V；
气化温度：350℃；
鞘气压：N2，35arb；
辅助气压：N2，10arb；
离子传输管管温度：300℃；
质量范围：m/z 100-1000；分辨率R＝70000；
(4)浓度计算方法
样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：
X＝2*C*V/m，式中：
X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；
C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L
V—定容体积，单位为mL；
m－试样体积或质量，单位为g。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，相较于现有大多数兽药残留的检测方法的检测项目往往是一类兽药，或者是性质相近的某几类兽药。本发明能够基于载体辅助液液萃取技术通过一次性前处理，完成涵盖了理化性质差异很大的常见8大类，共计99种兽药残留的提取、净化工作，同时结合四级杆静电场轨道阱高分辨质谱实现了99种兽药残留的高通量、高灵敏度筛查。另外，本发明所提出的前处理技术可以有效解决无论是脂溶性还是水溶性兽药的提取、净化，因此本发明预期也可以应用于动物源性食品中未列入本发明所列出的兽药项目的筛查。
综上所述，本发明首次建立了适合于畜类、禽类、液态乳、奶粉、鱼类等动物组织的样品前处理的载体辅助液液萃取技术，利用四级杆静电场轨道阱质谱的高分辨率定性、定量优势，建立了动物源性食品中常见兽药残留的高通量、高灵敏度筛查技术，解决了兽药残留检测前处理方法种类多、耗时长、效率低的问题，实现了动物源性食品中常见兽药残留的“一步式”多残留筛查，为提高政府监管部门的监管工作效率，保证动物源性食品安全提供了基础。
附图说明
图1为16种磺胺类和喹诺酮类标准物质的色谱图；
图2为16种磺胺类和喹诺酮类标准物质的色谱图；
图3为8种磺胺类和喹诺酮类标准物质的色谱图；
图4为15种激素类标准物质的色谱图；
图5为11种激素类标准物质的色谱图；
图6为10种红霉素类标准物质的色谱图；
图7为4种孔雀石绿类标准物质的色谱图；
图8为7种青霉素类标准物质的色谱图；
图9为4种四环素类标准物质的色谱图；
图10为7种氨苯砜类标准物质的色谱图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
下面用实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此，保护范围以权力要求为准。
1、材料和设备
1.1主要试剂和材料
如非特别说明，所列试剂均为色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
乙腈；甲醇；超纯水：18.2MΩ；氨水:分析纯；甲酸；乙酸铵；草酸：分析纯；乙二胺四乙酸二钠；二甲基亚砜：分析纯；提取液：称取4.3g的草酸和3.7g的乙二胺四乙酸二钠，用500ml的水溶解，氨水调PH至3.0；草酸缓冲液(100mmol/L)：称取0.9g的草酸，用90ml的水溶解，氨水调PH至5.0，加水至100ml既得；乙腈-水溶液(95:5，体积比)：含有0.1％甲酸，5mM乙酸铵；水-乙腈溶液(95:5，体积比)：含有0.1％甲酸，5mM乙酸铵；水溶液：水中含有0.1％的氨水；水-甲醇溶液(95:5，体积比)：含有0.1％的氨水；硅藻土柱Chromabond XTR(10mL)或相当者：上样体积为10ml，在分别用10ml乙腈，分3次进行洗脱。
1.2仪器设备
Q-Exactive液相色谱质谱联用系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)，配备ESI源；Hypersile Gold C18色谱柱(50mm x 2.1mm，1.9μm；100mm x 2.1mm，3μm，美国Thermo Fisher)；电子天平：感量分别为0.1mg和0.01g；超纯水器；旋涡混合仪；超声波清洗仪；超低温冰箱；氮吹仪；酸度计；15ml具刻度离心管。
2、动物源食品中128种兽药残留的高通量检测方法
2.1样品前处理
称取液体样品5.00g或者浓度为1g/mL的固体水溶液5mL于50mL离心管中，加入5mL提取液，10mL乙腈，涡旋充分混匀，以4500r/min离心5min，上清液转移至另一50mL离心管中，再在上清液中加入1g硫酸铵，充分混匀后离心5min，得到上层乙腈相和下层水相，取下层水相过硅藻土柱，下接50ml离心管，并加入0.5ml二甲基亚砜得到上样液；将上样液上硅藻土柱后平衡15分钟，然后将上层乙腈相过硅藻土柱进行洗脱，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗离心管中残余的上样液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脱液用纯乙腈定容至25ml；将定容液均分为2份，分别置于15ml具刻度离心管中，在微弱的氮气流下吹干至1ml，用纯水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml离心管中，于-4℃，15000r/min下离心10min，然后取400μL上清液置于带衬管的进样瓶中进样分析；同时做试剂空白样品；
2.2混合标准溶液组成和基质标准曲线制备
A.混合标准溶液组成：
磺胺类包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲异嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶，磺胺喹恶啉，磺胺二甲恶唑，磺胺二甲异恶唑，磺胺甲恶唑，磺胺噻唑，磺胺氯哒嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧苄胺嘧啶和磺胺胍，各成分浓度均为1.0μg/mL；
喹诺酮类包括乙胺嘧啶,环丙沙星,恩诺沙星,氧氟沙星,诺氟沙星,沙拉沙星,培氟沙星,奈啶酸,奥索利酸,氟甲奎,吡哌酸,西诺沙星,麻保沙星,司帕沙星,双氟沙星,单诺沙星,奥比沙星,洛美沙星和依诺沙星，各成分浓度均为1.0μg/mL；
激素类包括可的松，泼尼松，甲基泼尼松龙，炔诺酮，炔雌醇，醋酸美仑孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羟孕酮，雌酮，氢化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睾酮，泼尼松龙，雌二醇，己烯雌酚，甲睾酮，表睾酮，丙酸睾酮，苯甲酸雌二醇，追宝龙，诺龙，甲孕酮和17α-羟基孕酮，各成分浓度均为0.1μg/mL；
红霉素类包括红霉素，替米考星，竹桃霉素，泰乐霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分浓度均为0.1μg/mL；
孔雀石绿类包括孔雀石绿，隐色孔雀石绿，结晶紫和隐色结晶紫，各成分浓度均为0.1μg/mL；
青霉素类包括氨苄青霉素，乙氧萘青霉素，邻氯青霉素，头孢氨苄，双氯青霉素，青霉素G和阿莫西林，各成分浓度均为1.0μg/mL；
四环素类包括土霉素，强力霉素，金霉素和四环素，各成分浓度均为1.0μg/mL；
氨苯砜类包括金刚乙胺，苯乙醇胺A，N-乙酰氨苯砜，氨苯砜，金刚烷胺，吡喹酮和氯丙嗪，各成分浓度均为0.1μg/mL；
B.基质标准曲线定量：
在空白样品中分别加入上述8类混合标准溶液0μL，10μL，20μL，40μL，100μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据，其中响应值＝标准品峰面积/标准品质量；
2.3超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定
A.高效液相分离
色谱柱：Hypersile Gold C18色谱柱，若测定激素成分则采用的型号为100mm x2.1mm,1.9μm，若测定混合标准溶液中的其余成分则采用的型号为100mm x 2.1mm,3μm；
若测定激素成分，则流动相A：含有0.1wt％氨水的甲醇溶液；流动相B：含有0.1wt％氨水的水-甲醇溶液，其中水与甲醇的体积比为95：5；
若测定混合标准溶液中的其余成分则：流动相A：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸铵的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为95:5；流动相B：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸铵的水-乙腈溶液，其中水与乙腈的体积比为95:5；
流速：0.3mL/min；
进样量：10mL；
若测定激素成分HPLC洗脱程序如下：
若测定混合标准溶液中的其余成分则HPLC洗脱程序如下：
B.质谱检测
离子源：HESI-II；
喷雾电压：若测定激素成分则采用正离子模式3800V/负离子模式2700V；若测定混合标准溶液中的其余成分则采用正离子模式3800V；
气化温度：350℃；
鞘气压：N2，35arb；
辅助气压：N2，10arb；
离子传输管管温度：300℃；
质量范围：m/z 100-1000；分辨率R＝70000；
2.4浓度计算方法
样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：
X＝2*C*V/m，式中：
X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；
C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L
V—定容体积，单位为mL；
m－试样体积或质量，单位为g。
3、验证试验
3.1定性定量
实际样品分析中各组分阳性样品的确认，在Thermo公司的高分辨筛查软件Exactfinder的辅助下完成。Exactfinder是一款基于高分辨色谱质谱联用的数据处理辅助软件，用于多组分同时筛查及完全未知物的定性定量分析。对化合物的定性确认，除了精确质量数外，Exactfinder还提供保留时间、同位素分布、主要二级碎片确认和二级质谱图相识度比对等多种方法，综合判断，以得到准确度定性结果，避免假阳性检测结果的出现。Q-Exactive能够得到化合物准确的同位素峰形，可以用来作定性确认，标准物质的色谱图见附图1-10。
3.2测定低限和回收率
吸取适量混合标准溶液，用空白基质溶液稀释成所需浓度的标准校准溶液。样品中添加标准溶液，按上述动物源食品中128种兽药残留的高通量检测方法的处理过程操作，测定后计算样品添加的回收率。样品添加回收率实验数据参见以下表1-表7所示。
表1 12种磺胺类和喹诺酮类药物的添加浓度及其回收率范围的实验数据
注*化合物的排列顺序按照保留时间(RT)的先后。
表2 13种激素类药物的添加浓度及其回收率范围的实验数据
注*化合物的排列顺序按照保留时间(RT)的先后。
表3 10种红霉素类药物的添加浓度及其回收率范围的实验数据
注*化合物的排列顺序按照保留时间(RT)的先后。
表.4 4种孔雀石绿类药物的添加浓度及其回收率范围的实验数据
注*化合物的排列顺序按照保留时间(RT)的先后。
表5 7种青霉素类药物的添加浓度及其回收率范围的实验数据
注*化合物的排列顺序按照保留时间(RT)的先后。
表6 4种四环素类药物的添加浓度及其回收率范围的实验数据
注*化合物的排列顺序按照保留时间(RT)的先后。
表7 7种氨苯砜类药物的添加浓度及其回收率范围的实验数据
注*化合物的排列顺序按照保留时间(RT)的先后。
上述兽药残留最低检测限均满足欧盟和我国对食品的残留限量要求。所有上述化合物回收率范围均在40％-120％之间，精密度范围在15％以内，其中80％以上的化合物的回收率在60％-110％之间，绝大部分上述化合物满足分析要求。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (1)

1.一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)样品前处理
称取液体样品5.00g或者浓度为1g/mL的固体水溶液5mL于50mL离心管中，加入5mL提取液，10mL乙腈，涡旋充分混匀，以4500r/min离心5min，上清液转移至另一50mL离心管中，再在上清液中加入1g硫酸铵，充分混匀后离心5min，得到上层乙腈相和下层水相，取下层水相过硅藻土柱，下接50ml离心管，并加入0.5ml二甲基亚砜得到上样液；将上样液上硅藻土柱后平衡15分钟，然后将上层乙腈相过硅藻土柱进行洗脱，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗离心管中残余的上样液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脱液用纯乙腈定容至25ml；将定容液均分为2份，分别置于15ml具刻度离心管中，在微弱的氮气流下吹干至1ml，用纯水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml离心管中，于-4℃，15000r/min下离心10min，然后取400μL上清液置于带衬管的进样瓶中进样分析；同时做试剂空白样品；其中所述提取液的制备方法为：称取4.3g的草酸和3.7g的乙二胺四乙酸二钠，用500ml的水溶解，氨水调pH至3.0；
(2)混合标准溶液组成和基质标准曲线制备
A.混合标准溶液组成：
磺胺类包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲异嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶，磺胺喹恶啉，磺胺二甲恶唑，磺胺二甲异恶唑，磺胺甲恶唑，磺胺噻唑，磺胺氯哒嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧苄胺嘧啶和磺胺胍，各成分浓度均为1.0μg/mL；
喹诺酮类包括乙胺嘧啶,环丙沙星,恩诺沙星,氧氟沙星,诺氟沙星,沙拉沙星,培氟沙星,奈啶酸,奥索利酸,氟甲奎,吡哌酸,西诺沙星,麻保沙星,司帕沙星,双氟沙星,单诺沙星,奥比沙星,洛美沙星和依诺沙星，各成分浓度均为1.0μg/mL；
激素类包括可的松，泼尼松，甲基泼尼松龙，炔诺酮，炔雌醇，醋酸美仑孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羟孕酮，雌酮，氢化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睾酮，泼尼松龙，雌二醇，己烯雌酚，甲睾酮，表睾酮，丙酸睾酮，苯甲酸雌二醇，追宝龙，诺龙，甲孕酮和17α-羟基孕酮，各成分浓度均为0.1μg/mL；
红霉素类包括红霉素，替米考星，竹桃霉素，泰乐霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分浓度均为0.1μg/mL；
孔雀石绿类包括孔雀石绿，隐色孔雀石绿，结晶紫和隐色结晶紫，各成分浓度均为0.1μg/mL；
青霉素类包括氨苄青霉素，乙氧萘青霉素，邻氯青霉素，头孢氨苄，双氯青霉素，青霉素G和阿莫西林，各成分浓度均为1.0μg/mL；
四环素类包括土霉素，强力霉素，金霉素和四环素，各成分浓度均为1.0μg/mL；氨苯砜类包括金刚乙胺，苯乙醇胺A，N-乙酰氨苯砜，氨苯砜，金刚烷胺，吡喹酮和氯丙嗪，各成分浓度均为0.1μg/mL；
B.基质标准曲线定量：
在空白样品中分别加入上述8类混合标准溶液0μL，10μL，20μL，40μL，100μL，以浓度为横坐标，仪器响应值为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；其中响应值＝标准品峰面积/标准品质量；
(3)超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定
A.高效液相分离
色谱柱：Hypersile Gold C18色谱柱，若测定激素成分则采用的型号为100mmx 2.1mm,1.9μm，若测定混合标准溶液中的其余成分则采用的型号为100mmx 2.1mm,3μm；
若测定激素成分，则流动相A：含有0.1wt％氨水的甲醇溶液；流动相B：含有0.1wt％氨水的水-甲醇溶液，其中水与甲醇的体积比为95:5；
若测定混合标准溶液中的其余成分则：流动相A：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸铵的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为95:5；流动相B：含有0.1wt％甲酸以及5mM乙酸铵的水-乙腈溶液，其中水与乙腈的体积比为95:5；
流速：0.3mL/min；
进样量：10mL；
若测定激素成分HPLC洗脱程序如下：
若测定混合标准溶液中的其余成分则HPLC洗脱程序如下：
B.质谱检测
离子源：HESI-II；
喷雾电压：若测定激素成分则采用正离子模式3800V/负离子模式2700V；若测
定混合标准溶液中的其余成分则采用正离子模式3800V；
气化温度：350℃；
鞘气压：N2，35arb；
辅助气压：N2，10arb；
离子传输管管温度：300℃；
质量范围：m/z 100-1000；分辨率R＝70000；
(4)浓度计算方法
样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：
X＝2*C*V/m，式中：
X－试样中待测物含量，单位为μg/kg；
C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/L
V—定容体积，单位为mL；
m－试样体积或质量，单位为g。
CN201611046606.4A 2016-11-23 2016-11-23 一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法 Active CN106596819B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611046606.4A CN106596819B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611046606.4A CN106596819B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106596819A CN106596819A (zh) 2017-04-26
CN106596819B true CN106596819B (zh) 2018-01-02

Family

ID=58593025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611046606.4A Active CN106596819B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106596819B (zh)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107228912A (zh) * 2017-05-26 2017-10-03 河南省兽药饲料监察所 一种动物性食品中79种抗菌药物的筛查方法
CN107462640A (zh) * 2017-06-14 2017-12-12 大连市水产技术推广总站 同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法
CN107290470B (zh) * 2017-06-22 2019-05-31 中山市农产品质量监督检验所 一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法
CN107255686B (zh) * 2017-08-14 2020-03-27 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种测定养殖水中多兽药残留的分析方法
CN107607645B (zh) * 2017-09-13 2020-10-27 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种同时检测鱼肉中多种类兽药残留的方法
CN107490649B (zh) * 2017-09-15 2020-05-12 河南省兽药饲料监察所 一种畜禽排泄物中62种抗菌药物的筛查方法
CN107576744A (zh) * 2017-09-29 2018-01-12 沈阳出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 一种检测动物源性食品中兽药残留的方法
CN107561190A (zh) * 2017-09-30 2018-01-09 中国动物疫病预防控制中心 一种羊奶及其制品中药物的检测方法
CN107748212B (zh) * 2017-09-30 2021-01-26 中国动物疫病预防控制中心 一种羊奶及其制品中检测药物的方法
CN108037192B (zh) * 2017-10-18 2020-02-11 华中农业大学 一种能同时检测动物可食性产品和饲料中五类药物的液相色谱-串联质谱法
CN107727769B (zh) * 2017-10-24 2020-11-27 蒋万枫 一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法
CN108318613A (zh) * 2018-01-11 2018-07-24 四川国测检测技术有限公司 一种环境样品中抗生素的检测方法
CN108693288B (zh) * 2018-05-25 2020-12-15 无锡微色谱生物科技有限公司 一种利用dpx枪头式分散固相微萃取柱萃取及分析喹诺酮类药物的方法
CN109001188B (zh) * 2018-08-12 2021-09-14 河北农业大学 一种金刚烷胺和金刚乙胺的特异性分子印迹聚合物、化学发光试剂盒、检测方法及应用
CN109307697B (zh) * 2018-11-05 2021-02-23 济南大学 一种检测吡喹酮的电致化学发光传感电极的制备方法及应用
CN109596730B (zh) * 2018-12-14 2021-11-23 沈阳药科大学 一种同时测定脂肪食品样品中的激素和抗生素的方法
CN110243980B (zh) * 2019-06-21 2022-03-11 宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种食品中92种禁用工业染料的高通量检测方法
CN110530991A (zh) * 2019-08-12 2019-12-03 上海市动物疫病预防控制中心(上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心) 一种同步检测畜禽肉中152种化学污染物的高分辨质谱方法
CN110376307A (zh) * 2019-08-13 2019-10-25 深圳市深大检测有限公司 水产品中孔雀石绿的残留检测方法
CN110470763A (zh) * 2019-08-23 2019-11-19 北京六角体检测技术有限公司 一种同时检测水产品中孔雀石绿、硝基呋喃代谢物和氯霉素残留量的方法
CN111812250A (zh) * 2020-08-14 2020-10-23 湖南省食品质量监督检验研究院 一种水产品中药物残留的快速检测方法
CN113219099A (zh) * 2021-05-18 2021-08-06 河北医科大学 家禽类动物羽毛中喹诺酮类药物残留的检测方法
CN114200053A (zh) * 2021-12-10 2022-03-18 碳元复兴(厦门)科技有限公司 一种沼液中多种类兽药残留的同时检测方法
CN115586275B (zh) * 2022-10-17 2024-09-27 中国水产科学研究院东海水产研究所 水产品中甲基睾酮的液相色谱-串联质谱测定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103529153A (zh) * 2013-07-26 2014-01-22 宁波检验检疫科学技术研究院 一种大豆中多种农药残留的通用快速检测方法
CN103713056A (zh) * 2013-11-25 2014-04-09 宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种同时分析检测动物组织中残留兽药组分的方法
CN104880529A (zh) * 2015-06-23 2015-09-02 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库
CN105699565A (zh) * 2015-06-23 2016-06-22 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7680553B2 (en) * 2007-03-08 2010-03-16 Smp Logic Systems Llc Methods of interfacing nanomaterials for the monitoring and execution of pharmaceutical manufacturing processes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103529153A (zh) * 2013-07-26 2014-01-22 宁波检验检疫科学技术研究院 一种大豆中多种农药残留的通用快速检测方法
CN103713056A (zh) * 2013-11-25 2014-04-09 宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种同时分析检测动物组织中残留兽药组分的方法
CN104880529A (zh) * 2015-06-23 2015-09-02 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库
CN105699565A (zh) * 2015-06-23 2016-06-22 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Evaluation of a multi-class, multi-residue liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for analysis of 120 veterinary drugs in bovine kidney;Marilyn J. Schneider et al.;《Drug Testing Analysis》;20121231;第4卷;page 91-102 *
Multi-residue screening of 100 multi-class veterinary drugs in milk powder by liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry;Jian Kang et al.;《Analytical Methods》;20141231;第6卷;page 8337–8349 *
QuEChERS结合液相色谱-串联质谱法快速测定猪肉中多类兽药残留;张科明 等;《色谱》;20160930;第34卷;860-867页 *
液相色谱-串联质谱法快速筛查测定 浓缩果蔬汁中的156种农药残留;李岩 等;《色谱》;20090331;第27卷;127-137页 *
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类、硝基咪唑类兽药残留;黄子敬 等;《分析试验室》;20141031;第33卷;1184-1188页 *
高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中35种兽药残留量;陈刚 等;《理化检验-化学分册》;20141231;第50卷;809-814页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106596819A (zh) 2017-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106596819B (zh) 一种动物源食品中99种兽药残留的高通量检测方法
CN106124653B (zh) 虾中5种硝基呋喃类代谢物和氯霉素多残留的检测方法
Maurer Liquid chromatography–mass spectrometry in forensic and clinical toxicology
Bargańska et al. Determination of antibiotic residues in honey
CN104880529B (zh) 检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库
CN107727769B (zh) 一种快速筛查与确证牛奶中兽药残留的方法
CN104807921B (zh) 高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法
Gates et al. Automated metabolic profiling of organic acids in human urine. I. Description of methods.
CN105021756B (zh) 一种禽蛋中金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍残留的多联检测方法
CN109856271A (zh) 同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类抗生素残留量的方法
Lin et al. Determination of multiresidue analysis of β-agonists in muscle and viscera using liquid chromatograph/tandem mass spectrometry with Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe methodologies
CN106353412B (zh) 一种快速定性定量检测粮食中农残含量的方法
CN104297406A (zh) 一种广谱鉴定β-受体激动剂类药物的方法
Wu et al. Determination of ractopamine in pig hair using liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection
Decheng et al. Trace analysis of progesterone and 21 progestins in milk by ultra-performance liquid chromatography coupled with high-field quadrupole-orbitrap high-resolution mass spectrometry
CN115963199A (zh) 一种人/动物体液中类固醇激素的定量检测方法和应用
Han et al. Determination of four amide fungicides in grape wine by gas chromatography coupled with tandem mass spectrometry
Guan et al. Quantification of clenbuterol in equine plasma, urine and tissue by liquid chromatography coupled on‐line with quadrupole time‐of‐flight mass spectrometry
Fedeniuk et al. Validation of a gas chromatography–mass spectrometry method for the determination of pg/ml levels of 17β-estradiol and 17β-trenbolone in bovine serum
Wang et al. Rapid screening and quantification of multi-class multi-residue veterinary drugs in pork by a modified QuEChERS protocol coupled to UPLC-Q-Orbitrap HRMS
Reig et al. A chromatography method for the screening and confirmatory detection of dexamethasone
CN106404976A (zh) 一种动物固体排泄物中克伦特罗的测定方法
CN106226433A (zh) 一种氟苯尼考溶液中替米考星残留量的测定方法
Zhou et al. Simultaneous determination of 31 endocrine disrupting chemicals in fish plasma by solid‐phase extraction coupled with ultra‐performance liquid chromatography‐tandem mass spectrometry
Su et al. Optimization, validation, and application of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of 47 banned drug and related chemical residues in livestock urine using graphitized carboxyl multi-walled carbon nanotubes-based QuEChERS extraction

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant