CN107462640A - 同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，以目标化合物相应的同位素为内标，水样经过滤、液液萃取浓缩后、经中性氧化铝小柱净化、浓缩后，用乙腈‑乙酸铵溶液定容，涡旋振荡过滤后用液质联用仪检测。本发明首次采用液质联用仪对养殖用水中的孔雀石绿和结晶紫同时测定，灵敏度高、定性可靠、定量准确，本发明方法采用有效校正前处理过程中的误差和损失、回收率较高较稳定的液质联用内标法对水中的孔雀石绿和结晶紫进行检测，测定结果准确可靠，灵敏度高，重现性好，定量准确。为相关部门监管水产养殖中孔雀石绿和结晶紫的违规使用提供了技术支持，本发明方法有很好的应用前景。

Description

同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法
技术领域
本发明属于环境质量安全检测技术领域，是一种用高效液相色谱-串联质谱法同时检测养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法。
背景技术
孔雀石绿又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，是一种带有金属光泽的绿色结晶体，工业上常用做染料；结晶紫作为染色剂在细胞学、组织学和细菌学等方面应用极广。在水产养殖中，渔民经常用孔雀石绿和结晶紫进行水体的消毒，杀灭寄生虫、预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等。在鱼类的运输过程以及市场、饭店水箱中暂养销售时也有人将它们用作消毒剂，以延长鱼类的存活时间。孔雀石绿和结晶紫是小分子物质，进入机体后代谢还原成脂溶性的衍生物—隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，在组织中长时间残留，其化学官能团三苯甲烷具有致癌、致畸、致突变等毒副作用，对动物的免疫系统和繁殖系统有着较大的影响。我国农业行业标准《无公害食品渔用药物使用准则》(NY5071-2002)将孔雀石绿列为禁用药物，在所有动物性食品中禁用。美国、韩国、日本、英国等许多国家已禁止将结晶紫用于水产养殖业。但是由于孔雀石绿和结晶紫价格低廉、疗效好，相关替代药品尚未发现，在水产养殖业中违规使用屡有发生，水产品中检出孔雀石绿和结晶紫的报道屡见报端，这对人们的身体健康、水产品的出口贸易和养殖对象赖以生存的水体环境等，都产生了不良的影响。
目前，有关孔雀石绿、结晶紫的检测方法主要是针对水产品等动物源性食品，用于对水产品质量安全的监督。而有关水体中孔雀石绿、结晶紫检测方法的报道相对较少。对动物源性食品的检测，总体上存在着前处理过程复杂、耗时长、检测结果具有滞后性的特点，这一点在水产品市场的抽样检测中尤为突出，常常是检测工作历时一周结果出来了，市场上相应的水产品已经被消费者食用了。孔雀石绿和结晶紫作为禁用渔药，迫切需要开发灵敏可靠的检测方法来监控其违规使用情况，这不仅局限于水产品本身，从养殖对象赖以生存的水体环境着手进行水体中孔雀石绿和结晶紫的监控显得极为必要。通过对水中孔雀石绿和结晶紫的检测，一方面可以从水产养殖源头上监控其使用情况，进一步完善无公害水质的检测指标，另一方面可以检测出在哪一具体环节有违规添加，有利于相关部门的监督,为水产品的质量安全提供技术保证。
目前，检测孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量的常用方法有液相色谱法、液质联用法等。因为孔雀石绿和结晶紫的代谢产物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫为脂溶性的，在水中溶解度极小，含量极低，多吸附于水底的沉积物中。因而本发明只对水中孔雀石绿和结晶紫的检测方法进行研发，不涉及隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的检测方法。
高效液相色谱法通过保留时间定性、外标法定量，存在定性不准确回收率较低的弊端。水中孔雀石绿和结晶紫的残留通常很低，为ng/L级别，需要灵敏度高、定性可靠、定量准确的方法，本发明采用的液质联用内标法可以达到上述要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫的方法。
为了达到上述目的，本发明提供一种同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，以目标化合物对应的同位素为内标，水样经过滤、液液萃取浓缩后、经中性氧化铝小柱净化、浓缩后，用乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)1mL定容，涡旋振荡过滤后用液质联用仪检测。
本方法孔雀石绿和结晶紫的检出限均为1ng/L，定量限均为2ng/L。孔雀石绿和结晶紫在2ng/L～20ng/L添加浓度范围内时，回收率为70％～120％，本方法的批内相对标准偏差≤10％，批间相对标准偏差≤15％。
优选方式下，上述同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，具体步骤为：
(1)将待测养殖水样经孔径为0.45μm的水系纤维滤膜过滤，除去固体杂质和色素，备用；
(2)移取经步骤(1)处理的待测养殖水样100.0mL，置于250mL分液漏斗中；向分液漏斗中加入质量浓度为100ng/mL的氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液20.0μL、1.5mL盐酸羟胺溶液、2.5mL对-甲苯磺酸溶液，振摇混匀，加入10.0mL乙腈、35.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，将下层溶液转移至125mL鸡心瓶中；继续向分液漏斗中加入10.0mL乙腈、35.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，合并下层溶液于上述125mL鸡心瓶中，于(42±2)℃水浴中减压浓缩至近干；用5mL乙腈溶解残留物，振荡混匀；将用5mL乙腈活化过的中性氧化铝小柱安装在固相萃取装置上，将鸡心瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤鸡心瓶两次，每次2.5mL，将洗涤液依次过柱，收集全部流出液，于42℃±2℃的水浴中减压浓缩至近干，向鸡心瓶中加入1.0mL乙腈--5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)，涡旋振荡1min，样液经0.22μm针孔式有机相滤膜过滤后，得到试样液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；
(3)移取适量的孔雀石绿与结晶紫混合标准工作溶液，加入氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液，用乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)配制成一系列浓度的标准上机溶液，进高效液相色谱-串联质谱仪分析，绘制标准曲线；
所述高效液相色谱-串联质谱仪分析的检测条件为：
色谱条件：
a)色谱柱：Waters BEH C18反相色谱柱，2.1mm×100mm，粒度1.7μm；
b)柱温：40℃；
c)流速：0.3mL/min；
d)进样量：1μL；
e)流动相：A:0.1％的甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱；洗脱程序为：0min，A为50％，B为50％；2～3min，A为20％，B为80％；4min，A为50％，B为50％；4～5min，A为50％，B为50％。
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；
去溶剂气温度：500℃；
雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量：900L/Hr；碰撞气为氩气，输出压力为0.06MPa；
离子模式：多反应监测扫描模式；
选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压等质谱参数分别为：孔雀石绿母离子329，定量子离子313，碰撞能量35，锥孔电压54，定性子离子208，碰撞能量37，锥孔电压54；氘代孔雀石绿母离子334，定量子离子318，碰撞能量40，锥孔电压54；结晶紫母离子372，定量子离子356，碰撞能量38，锥孔电压60，定性子离子251，碰撞能量42，锥孔电压60；氘代结晶紫母离子378，定量子离子362，碰撞能量39，锥孔电压60；
进一步优化，步骤(3)标准曲线绘制时，孔雀石绿和结晶紫混合标准溶液的浓度梯度为：0.2ng/mL、0.4ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL和10.0ng/mL，每毫升该溶液含有氘代孔雀石绿和氘代结晶紫各为2.0ng。
(4)测定：
①定性测定：在与标准工作溶液相同的测定条件下对试样液进行测定，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物保留时间的相对标准偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相近的标准溶液中定性离子相对丰度一致；
基峰与次强碎片离子丰度比要求
次强碎片离子相对丰度/(％) 允许偏差/(％)
>50 ±20
20～50，不含20 ±25
10～20，不含10 ±30
≤10 ±50
②定量测定：
取相应的标准工作溶液，作多点校准，按内标法对试样溶液定量；标准溶液及试样溶液中目标化合物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。孔雀石绿和结晶紫以各自的同位素为内标进行定量；
③空白实验
除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；
④结果计算和表述
按公式(a)计算试样中目标化合物的残留量：
式中：Xi―试样中目标化合物的残留量，ng/L；Ci—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/L；C0—空白样品中目标化合物的浓度，ng/L；V1—最终样液定容体积，mL；V2—样品体积，mL；
注：测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字；
⑤方法灵敏度、准确度和精密度：
灵敏度：孔雀石绿和结晶紫的检出限均为1ng/L，定量限均为2ng/L；
准确度：孔雀石绿和结晶紫在2ng/L～20ng/L添加浓度范围内时，回收率为70％～120％。
精密度：本方法的批内相对标准偏差≤10％，批间相对标准偏差≤15％。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
1.现有的检测方法多是对水产品中的孔雀石绿和结晶紫及其代谢物进行检测，部分研究对水中的孔雀石绿及其代谢物进行检测，对水中结晶紫的检测方法研究较少，本发明首次将养殖用水中孔雀石绿和结晶紫采用同一前处理方法同时进行测定，与分别检测孔雀石绿和结晶紫的方法相比，缩短了检测时间，过程更高效，节约了有机溶剂，过程更环保。
2.目前，检测孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量的常用方法有液相色谱法、液质联用法和酶标法等。高效液相色谱法通过保留时间定性、外标法定量，存在定性不准确回收率较低的弊端。酶标法为快速筛查法多用于定性，存在定量不准确的局限性。水中孔雀石绿和结晶紫的残留未经生物富集，含量通常很低，为ng/L级别，需要灵敏度高、定性可靠、定量准确的方法，本发明采用液相色谱串联质谱仪对水中孔雀石绿和结晶紫进行检测，通过保留时间和特征母离子子离子一一对应的关系来定性，具有灵敏度高、定性定量更为准确的优点。
3.孔雀石绿和结晶紫作为一种水体消毒剂，在育苗、养殖、运输和暂养阶段，都可能添加，本发明通过对水中孔雀石绿和结晶紫的同时检测，可以确定违规添加的具体阶段，使孔雀石绿和结晶紫的违规使用监控从事后监督(对水产品中药物残留的检测)进步到事前监督。
4.鉴于孔雀石绿和结晶紫的代谢物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫均为脂溶性化合物，在水中溶解度很小，含量极低，主要在动物组织中长时间残留，因而本发明只对水溶性的孔雀石绿和结晶紫的检测方法进行研究，实用性更强。
5.与水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的检测方法相比，本发明具有前处理简单、耗时短、上机制备液干扰杂质少的优点。
6.本发明采用有效校正前处理过程中的误差和损失、回收率较高较稳定的内标法对孔雀石绿和结晶紫进行定量，与外标法相比，结果重现性好，定量更为准确。
7.与有关文献上水中孔雀石绿和结晶紫的检测方法相比，本发明增加了固相萃取净化步骤，因为养殖用水中色素、藻类和浮游生物等含量较高，采取净化步骤可以消除上机样液对色谱图基线稳定性的影响，同时避免造成色谱柱的堵塞，因而本发明采用中性氧化铝小柱作为固相萃取净化小柱。
综上所述，本发明建立了有效校正前处理过程中的误差和损失、回收率较高较稳定的液质联用内标法对水中孔雀石绿和结晶紫同时进行检测，过程简单、高效、灵敏、特异性强，为孔雀石绿和结晶紫违规使用的调查研究提供了技术支持。本发明首次采用同一前处理方法，通过液液萃取、中性氧化铝小柱净化，对养殖用水中的孔雀石绿和结晶紫同时上机检测，与分别检测孔雀石绿和结晶紫的方法相比，节省了时间和有机溶剂，工作更高效过程更环保；采用液质联用仪检测、内标法定量克服了外标法定量的不准确和前处理过程的不完善等现有检测方法的不足之处，有效提高了孔雀石绿和结晶紫的提取效率以及定性定量的准确性。
附图说明
图1孔雀石绿(329/313、329/208)的选择离子流色谱图；
图2氘代孔雀石绿(334/318)的选择离子流色谱图；
图3结晶紫(372/356、372/251)的选择离子流色谱图；
图4氘代结晶紫(378/362)的选择离子流色谱图.
具体实施方式
下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的技术内容：
本发明为利用高效液相色谱-串联质谱法分析养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留的方法，水样经过滤、液液萃取浓缩后、经中性氧化铝小柱净化、浓缩后用50％的乙腈-乙酸铵混合溶液1mL定容，涡旋振荡，经0.22μm针孔式有机系滤膜过滤后，用配有ESI源的液质联用仪采用正离子模式检测，内标法定量。
养殖用水包括养殖场用水、育苗池用水、暂养池用水和运输过程中用水等，在养殖过程中孔雀石绿和结晶紫常被用来预防和治疗水霉病、鳃霉病以及杀灭寄生虫等，不可避免地带来水中的药物残留和环境污染问题，其中育苗池因为养殖密度大，产品距离上市时间长，用药最为普遍，因此，我们选择育苗池用水作为验证的实施例。
实施例1育苗池水中孔雀石绿和结晶紫残留的测定。
1.本实施例选用的仪器及设备：LC-MS/MS液相色谱串联质谱仪
(1)液相色谱部分(Waters公司I-class)，使用Waters BEH C18反相色谱柱，(2.1mm╳100mm，1.7μm)
(2)TQ-S质谱仪(Waters公司)，配有ESI离子源，三重四级杆，碰撞池，真空系统，气路控制系统；
(3)电子天平：感量0.01mg(德国赛多利斯公司)
(4)溶剂过滤器：配有0.45μm水系滤膜(天津津腾公司)
(5)旋转蒸发仪(BUCHI公司)
(6)涡旋混合器(德国IKA公司)
(7)固相萃取仪(Waters公司)
(8)超纯水仪(德国赛多利斯公司)
(9)微孔滤膜：0.22μm，尼龙66针孔式滤膜(天津津腾公司)
(10)分液漏斗振荡器(东京RIKAKIKAI公司)
2.试剂与标准溶液配制
(1)乙腈、二氯甲烷：色谱纯(德国Merck公司)
(2)盐酸羟胺：分析纯(国药集团化学试剂有限公司)
(3)对-甲苯磺酸：分析纯(天津科密欧化学试剂有限公司)
(4)二甘醇：分析纯(国药集团化学试剂有限公司)
(5)中性氧化铝小柱：1g/6mL，(Waters公司)，使用前用5mL乙腈活化
(6)甲酸：优级纯(天津科密欧化学试剂有限公司)
(7)0.1％的甲酸水溶液：1mL甲酸加到1L水中
(8)乙酸铵：优级纯(天津科密欧化学试剂有限公司)
(9)5mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g无水乙酸铵溶于1L水中，冰乙酸调PH到4.5
(10)冰乙酸：优级纯(天津科密欧化学试剂有限公司)
(11)乙腈-乙酸铵混合溶液：500mL乙腈和500mL乙酸铵溶液混合摇匀、备用
(12)孔雀石绿、结晶紫：标准品(购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)
(13)氘代孔雀石绿、氘代结晶紫：标准品(购于ViTEGA公司)
(14)孔雀石绿和结晶紫标准储备溶液：分别称取孔雀石绿、结晶紫、氘代孔雀石绿和氘代结晶紫标准品各10mg，用乙腈溶解并定容至10mL，配成浓度分别为1.0mg/mL的标准储备液，―20℃冷冻保存。
(15)孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液：分别准确移取孔雀石绿和结晶紫标准储备溶液适量，用乙腈稀释并定容，配成浓度为1.0μg/mL的标准工作溶液，2℃～8℃冷藏保存。
(16)氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液：分别准确移取氘代孔雀石绿和氘代结晶紫标准储备溶液适量，用乙腈稀释并定容，配成浓度为100ng/mL的标准工作溶液，2℃～8℃冷藏保存。
整个实验过程用水均为超纯水。
3.样品处理的步骤
(1)过滤水样
将水样经水系纤维滤膜(孔径0.45μm)过滤，备用；
(2)萃取和净化
移取水样100.0mL，置于250mL分液漏斗中。向分液漏斗中加入质量浓度为100ng/mL的氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液20.0μL、1.5mL盐酸羟胺溶液、2.5mL对-甲苯磺酸溶液，振摇混匀。加入10.0mL乙腈、35.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，将下层溶液转移至125mL鸡心瓶中；继续向分液漏斗中加入10.0mL乙腈、35.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，合并下层溶液于上述125mL鸡心瓶中，于(42±2)℃水浴中减压浓缩至近干。用5mL乙腈溶解残留物，振荡混匀。将用5mL乙腈活化过的中性氧化铝小柱安装在固相萃取装置上，将鸡心瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤鸡心瓶两次，每次2.5mL，将洗涤液依次过柱，收集全部流出液，于(42±2)℃的水浴中减压浓缩至近干，向鸡心瓶中加入1.0mL乙腈-乙酸铵混合溶液，涡旋振荡1min，样液经0.22μm针孔式有机相滤膜过滤后供高效液相色谱-串联质谱仪测定。；
(3)标准曲线的绘制
移取孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液适量、氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液适量，用乙腈-乙酸铵溶液配制成一系列浓度的标准上机溶液，浓度分别为：0.2ng/mL、0.4ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL和10.0ng/mL，每毫升该溶液含有氘代孔雀石绿和氘代结晶紫各为2.0ng，进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线。
注：水样保存：应在2～25℃的环境下避光保存，3天内完成过滤、萃取和检测。
4.实验所用的仪器条件
色谱条件如下：
a)色谱柱：Waters BEH C18反相色谱柱，2.1mm╳100mm，1.7μm
b)柱温：40℃；
c)流速：0.3mL/min；
d)进样量：1μL；
e)流动相：A:0.1％的甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱；洗脱程序如表1所示；
表1流动相梯度洗脱条件
时间/(min) A/(％) B/(％)
0 50 50
2 20 80
3 20 80
4 50 50
5 50 50
质谱条件如下：
a)离子化模式：电喷雾离子源(ESI)；
b)扫描方式：正离子模式；
c)去溶剂气温度：500℃；
d)雾化气、干燥气：高纯氮气；
e)碰撞气：高纯氩气，0.06MPa；
f)气体流量：900L/Hr；
g)离子模式：多反应选择监测扫描模式；
选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数见表2；
表2选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数
5样品检测与结果计算
(1)定性测定
在相同测定条件下，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物保留时间的相对标准偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，其偏差应符合表3要求；
表3基峰与次强碎片离子丰度比要求
次强碎片离子相对丰度/(％) 允许偏差/(％)
>50 ±20
20～50，不含20 ±25
10～20，不含10 ±30
≤10 ±50
(2)定量测定
取试样溶液和相应的标准工作溶液，作多点校准，按内标法以峰面积定量；标准溶液及试样溶液中目标化合物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。孔雀石绿和结晶紫以各自的同位素为内标进行定量，标准溶液特征离子质量色谱图参见图1-4。
(3)空白实验
除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。
(4)结果计算和表述
采用MassLynx软件对数据进行处理，以浓度为横坐标，以外标和相应内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，然后对样品峰进行分析处理，即可得到待测样液中目标化合物的浓度，按公式(a)计算试样中目标化合物的残留量：
式中：Xi―试样中目标化合物的残留量，ng/L；Ci—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/L；C0—空白样品中目标化合物的浓度，ng/L；V1—最终样液定容体积，mL；V2—样品体积，mL；
注：测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
6.结果
本方法孔雀石绿和结晶紫的检出限均为1ng/L，定量限为2ng/L。孔雀石绿和结晶紫在2ng/L～20ng/L添加浓度范围内时，回收率为70％～120％，本方法的批内相对标准偏差≤10％，批间相对标准偏差≤15％。
育苗池水中孔雀石绿和结晶紫残留量的加标回收率和精密度的测定结果为：孔雀石绿添加浓度为4ng/L时，三批次的平均回收率分别为87.2％、95.4％和98.3％，批内相对标准偏差分别为4.8％、3.6％和7.0％，批间相对标准偏差为6.1％；结晶紫添加浓度为4ng/L时，三批次的平均回收率分别为83.7％、91.6％和97.8％，批内相对标准偏差分别为5.4％、4.3％和3.9％，批间相对标准偏差为7.8％；具体如表4所示。
表4育苗池水中孔雀石绿和结晶紫残留量测定的加标回收率和精密度
以上仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，其特征在于，以目标化合物相应的同位素为内标，水样经过滤、液液萃取浓缩后、经中性氧化铝小柱净化、浓缩后，用乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)1mL定容，涡旋振荡过滤后用液质联用仪检测。
2.根据权利要求1所述同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)将待测养殖水样经孔径为0.45μm的水系纤维滤膜过滤，除去固体杂质和色素，备用；
(2)移取经步骤(1)处理的待测养殖水样100.0mL，置于250mL分液漏斗中；向分液漏斗中加入质量浓度为100ng/mL的氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液20.0μL、1.5mL盐酸羟胺溶液、2.5mL对-甲苯磺酸溶液，振摇混匀，加入10.0mL乙腈、35.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，将下层溶液转移至125mL鸡心瓶中；继续向分液漏斗中加入10.0mL乙腈、35.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，合并下层溶液于上述125mL鸡心瓶中，于42±2℃水浴中减压浓缩至近干；用5mL乙腈溶解残留物，振荡混匀；将用5mL乙腈活化过的中性氧化铝小柱安装在固相萃取装置上，将鸡心瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤鸡心瓶两次，每次2.5mL，将洗涤液依次过柱，收集全部流出液，于42℃±2℃的水浴中减压浓缩至近干，向鸡心瓶中加入1.0mL乙腈--5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)，涡旋振荡1min，样液经0.22μm针孔式有机相滤膜过滤后，得到试样液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；
(3)移取适量的孔雀石绿与结晶紫混合标准工作溶液，加入氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液，用乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)配制成一系列浓度的标准上机溶液，进高效液相色谱-串联质谱仪分析，绘制标准曲线；
所述高效液相色谱-串联质谱仪分析的检测条件为：
色谱条件：
a)色谱柱：Waters BEH C18反相色谱柱，2.1mm×100mm，粒度1.7μm；
b)柱温：40℃；
c)流速：0.3mL/min；
d)进样量：1μL；
e)流动相：A:0.1％的甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱；洗脱程序为：0min，A为50％，B为50％；2～3min，A为20％，B为80％；4min，A为50％，B为50％；4～5min，A为50％，B为50％。
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；
去溶剂气温度：500℃；
雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量：900L/Hr；碰撞气为氩气，输出压力为0.06MPa；
离子模式：多反应监测扫描模式；
选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数分别为：孔雀石绿母离子329，定量子离子313，碰撞能量35，锥孔电压54，定性子离子208，碰撞能量37，锥孔电压54；氘代孔雀石绿母离子334，定量子离子318，碰撞能量40，锥孔电压54；结晶紫母离子372，定量子离子356，碰撞能量38，锥孔电压60，定性子离子251，碰撞能量42，锥孔电压60；氘代结晶紫母离子378，定量子离子362，碰撞能量39，锥孔电压60；
(4)测定：
①定性测定：在与标准工作溶液相同的测定条件下对试样液进行测定，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物保留时间的相对标准偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相近的标准溶液中定性离子相对丰度一致；
②定量测定：
取相应的标准工作溶液，作多点校准，按内标法对试样溶液定量；标准溶液及试样溶液中目标化合物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。孔雀石绿和结晶紫以各自的同位素为内标进行定量；
③空白实验
除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；
④结果计算和表述
按公式(a)计算试样中目标化合物的残留量：
<mrow> <msub> <mi>X</mi> <mi>i</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <mo>(</mo> <msub> <mi>C</mi> <mi>i</mi> </msub> <mo>-</mo> <msub> <mi>C</mi> <mn>0</mn> </msub> <mo>)</mo> <mo>&amp;times;</mo> <msub> <mi>V</mi> <mn>1</mn> </msub> </mrow> <msub> <mi>V</mi> <mn>2</mn> </msub> </mfrac> <mo>-</mo> <mo>-</mo> <mo>-</mo> <mrow> <mo>(</mo> <mi>a</mi> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>
式中：Xi―试样中目标化合物的残留量，ng/L；Ci—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/L；C0—空白样品中目标化合物的浓度，ng/L；V1—最终样液定容体积，mL；V2—样品体积，mL；
⑤方法灵敏度、准确度和精密度：
灵敏度：孔雀石绿和结晶紫的检出限均为1ng/L，定量限均为2ng/L；
准确度：孔雀石绿和结晶紫在2ng/L～20ng/L添加浓度范围内时，回收率为70％～120％。
精密度：本方法的批内相对标准偏差≤10％，批间相对标准偏差≤15％。
3.根据权利要求2所述同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，其特征在于，步骤(3)标准曲线绘制时，孔雀石绿和结晶紫混合标准溶液的浓度梯度为：0.2ng/mL、0.4ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL和10.0ng/mL，每毫升该溶液含有氘代孔雀石绿和氘代结晶紫各为2.0ng。
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