CN107941980A

CN107941980A - 水产品中利福平残留的超高效液相色谱串联质谱快速测定方法

Info

Publication number: CN107941980A
Application number: CN201711199298.3A
Authority: CN
Inventors: 李诗言; 王扬; 丁雪燕; 吴洪喜; 何中央
Original assignee: ZHEJIANG PROVINCE AQUATIC PRODUCT TECHNOLOGY PROMOTION STATION
Current assignee: ZHEJIANG PROVINCE AQUATIC PRODUCT TECHNOLOGY PROMOTION STATION
Priority date: 2017-11-26
Filing date: 2017-11-26
Publication date: 2018-04-20

Abstract

本发明公开了一种适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱‑串联质谱快速测定方法，包括以下步骤：样品提取，样品净化，带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备，将带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液以及样品待测液在相同的色谱、质谱条件下依次进行测定；采用串联四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)采集利福平的定量离子对和定性离子对信息；以多反应监测提取的利福平定量离子对与利福平稳定同位素内标物离子对的峰面积比值为纵坐标，利福平的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，将样品的利福平与内标物峰面积比值带入线性方程，获得样品中目标物的含量。

Description

水产品中利福平残留的超高效液相色谱串联质谱快速测定方法

技术领域

本发明属于水产品检测技术领域，具体涉及一种适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)快速测定方法。

背景技术

利福平(Rifampicin,CAS:13292-46-1)是通过对利福霉素B进行化学改造后得到的一种半合成抗生素，属于安莎类抗生素且具有广谱的抗菌作用，能够用于治疗多种细菌感染性疾病，而且与其他药物之间无交叉抗药性，对结核病的疗效尤为突出，是治疗结核病的一线人用药物。利福平属于兽用禁用药物，我国于2005年发布的农业部公告第560号已将其列入兽药废止目录。但是利福平药物价格便宜，抗菌效果好，非常容易被养殖人员获取，因此该药在水产品养殖中存在人为非法使用的可能。

近年来关于生物基质中利福平检测的相关研究报道较少，最新研究方法多采用超高效液相色谱-串联质谱法。如安静等人2015年在《中国临床药理学杂志》第31卷第21期发表了《超高效液相色谱质谱联用法测定儿童血浆中利福平、利福喷丁和利福布》的研究论文：该报道方法采用超高效液相色谱串联质谱法对血浆样品中的利福平进行检测，以扎来普隆为内标，采用HSS T3色谱柱为分析柱，以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，以正离子多反应监测(MRM)模式进行质谱分析(离子对为m/z 823.4>791.4)，血浆中利福平的检出限为50ng/mL。基质效应是生物样品进行质谱定量分析所面对的最主要问题，而内标法定量可以校正基质效应对检测的影响，其中目标化合物的稳定同位素(由分析物分子中原子被其稳定同位素，如²D,¹³C等取代后获得)是LC-MS/MS分析最适合的内标。安静等人的方法采用药物扎来普隆作为利福平测定的内标，内标色谱保留时间和利福平相差较大，基质效应校准值易发生偏离，不一定适用于除血浆外的其他生物基质。此外，按照欧盟EC/657/2002条例关于质谱检测准确定性需要4个确证点(Identification Point，IP)的要求，上述方法仅有m/z 823.4>791.4一对离子对，仅获得2分，假阳性风险较高。目前关于水产品中利福平残留的液相色谱-串联质谱检测方法未见报道，水产品生物基质种类多且复杂，现有的利福平检测方法并不能满足其检测需求。食品安全问题责任重大，缺乏准确有效的利福平检测技术为相关监管工作带来了巨大难度，因此建立一种稳定、可靠、准确的水产品中利福平测定方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种采用超高效液相色谱-串联质谱仪快速、准确地定性定量测定水产品中利福平的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)快速测定方法，包括以下步骤：

(A)、样品提取：

称取2.5g均浆样品于离心管中，加入含有0.25μg利福平稳定同位素内标物的溶液(为浓度为1.0μg/mL利福平-D3 0.25mL)，静置后加入2～3g(较佳为2.5g)无水硫酸钠后采用7.5～12.5mL乙腈(较佳为8mL)作为试剂提取，漩涡震荡提取后，于4℃高速离心，移取上清液至比色管中，用乙腈定容至10mL～15mL(较佳为10mL)；

(B)、样品净化：

移取步骤(A)所得的提取液(部分)直接上样至Oasis PRiME HLB固相萃取柱上(保持流速1ml/20S)，收集全部流出液后于4℃高速离心，过0.2μm滤膜，得样品待测液；

(C)、带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备：

带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备方法为：先配制利福平浓度为0.0005～0.100μg/mL浓度梯度的利福平乙腈溶液作为标准溶液，然后再上述标准溶液中分别添加利福平稳定同位素内标工作溶液，从而使所得的带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液中，利福平稳定同位素内标(利福平-D3)的浓度均为0.025μg/mL；

(D)、液相色谱-串联四级杆质谱仪测定：

将带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液以及样品待测液在相同的色谱、质谱条件下依次进行测定；

(E)、定性依据和定量分析：

采用串联四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)采集利福平的定量离子对和定性离子对信息，实现定性和定量分析；以多反应监测提取的利福平定量离子对与利福平稳定同位素内标物(利福平-D3)离子对的峰面积比值为纵坐标，利福平的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，将样品的利福平与内标物峰面积比值带入线性方程，获得样品中目标物的含量。

备注说明：按照欧盟EC/657/2002法规关于质谱定性需要4个确证点(Identification Point，IP)的要求，低分辨质谱选择一个母离子，对应两个个子离子刚好能获得4分，即，LC-MS/MS分析方法选择一个母离子，对应两个子离子刚好能获得4个确证点，从而同时实现定性和定量分析。

作为本发明的改进，所述步骤(C)中：

色谱条件为：

C18分析色谱柱2.1×100mm，2.6μm(Accucore C₁₈RP-MS，2.6μm，2.1×100mm)；柱温：40℃；流速：0.30mL/min；进样量：2μL；洗脱梯度：0～1.0min，30％B；1.0～5.0min，30％～90％B；5.0～6.0min，90％B；6.0～6.5min，90％～30％B；6.5～8.5min，30％B；

流动相A为在5mmol/L乙酸铵水溶液且含0.02％的甲酸(体积分数)，即，每100mL的5mmol/L乙酸铵水溶液中添加0.02mL的甲酸；

流动相B为纯乙腈；

质谱条件为：

离子源为电喷雾离子源；检测方式为正离子多反应监测(MRM)模式；电喷雾电压为5500kV；离子源温度为500～600℃；雾化器(GS1)压力为210kPa；辅助气(GS2)压力为280kPa；气帘气(CUR)压力为105kPa；利福平及同位素内标氘代利福平的质谱信息如下表(利福平与内标物的质谱分析参数表)；

*定量离子。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(C)中，利福平稳定同位素内标工作溶液为浓度为1.0μg/mL的利福平-D3乙腈溶液。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(A)的高速离心为4000～6000r/min离心2～8分钟(较佳为5 000r/min离心5分钟)，离心温度为4±1℃；

所述步骤(B)的高速离心为10000～14000r/min高速离心8～12min(较佳为12000r/min离心10min)，离心温度为4±1℃。

作为本发明的进一步改进，所述加入含有0.25μg利福平稳定同位素内标物的溶液为，加入浓度为1.0μg/mL利福平稳定同位素内标工作液0.25mL。

本发明采用稳定同位素内标法定量，适用水产品多种基质，有效避免质谱基质效应对检测的影响。采用纯乙腈作为提取试剂，同时采用无水硫酸钠进行除水，保证利福平的稳定性。采用prime-hlb小柱对样品提取液进行净化，同时省略了氮吹步骤，提高了检测效率。

本发明与现有技术相比具有以下显著效果：

(1)本发明首次发明了通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱稳定同位素内标法测定水产品中的利福平残留，填补了技术空白。

(2)本发明技术方案采用采用乙腈作为利福平的提取剂同时辅以无水硫酸钠除水，在有效提取利福平的同时能够保证其稳定性。

(3)本发明技术方案采用超高速冷冻离心对提取液进行离心处理，离心转速达到10000r/min，温度为4℃；通过超高速冷冻离心能够有效去除样品基质中蛋白干扰物，提高检测效率。

(4)本发明技术方案利用通过式Oasis PRiME HLB固相萃取净化方式，省去常规固相萃取净化方法中的活化和淋洗步骤，且净化后无需氮吹浓缩，极大地简化了样品前处理程序，实现了水产品中利福平的快速测定。

(5)本发明技术方案采用采用利福平稳定同位素化合物(Rifampicin-D₃,CAS:1262052-36-7)作为内标，能够有效校准前处理的损失和质谱基质效应，定量结果更准确，基质适用范围更广。同时采用超高效液相色谱-串联质谱准技术进行定性、定量分析，相比液相色谱法具有更高的灵敏度和准确度。

(6)本发明技术方案的超高效液相色谱使用C₁₈色谱柱，采用5mmol乙酸铵水溶液(含0.02％的甲酸)与乙腈作为流动相，梯度洗脱，8.5分钟内完成色谱分离，利福平的保留时间为3.01min，峰形尖锐、对称，适用于质谱分析。

综上所述，本发明第一次实现了水产品中利福平药物的快速定性、定量测定。本发明采用乙腈提取目标物，高速离心沉淀蛋白干扰基质，再通过通过型Oasis PRiME HLB固相萃取小柱去除脂肪、磷脂等脂类干扰物，实现了多种水产品基质中利福平的提取及净化程序；同时通过优化后的色谱、质谱检测条件，采用稳定同位素内标法校准基质效应，利用三重四级杆质谱定量灵敏度高的特点，建立了利福平的准确定量方法，为水产品中利福平的快速测定提供了新的技术手段，先进性与创新性非常明显。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是利福平标准物质的二级质谱图。

图2是利福平及利福平稳定同位素(利福平-D3)的超高效液相色谱-串联质谱多反应离子监测质谱图；

图2中：

A为利福平定量离子对为823.4>791.4的多反应离子监测质谱图；

B为利福平定性离子对为823.4>399.1的多反应离子监测质谱图；

C为利福平-D3离子对为826.4>794.4的多反应离子监测质谱图。

图3是利福平的线性方程。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行阐述，然而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属技术领域的普通技术人员依据本发明公开的内容，均可实现本发明的结果。

1试剂和材料

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，色谱用水符合GB/T 6682-2008规定的一级水。

1.1乙腈色谱纯

1.2乙酸铵，无水硫酸钠(650℃灼烧4小时)

1.3甲酸色谱纯

1.4利福平(Rifampicin,CAS:13292-46-1)标准品(纯度为94.4％)；利福平-D(1262052-36-7)标准品(纯度为98.8％)；

1.5 Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200mg/6mL)。

2仪器设备

2.1 4500Qtap超高液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)；

2.2振荡器；

2.2电子天平：精确至0.001g和0.0001g；

2.3超高速离心机：12000r/min，具有低温功能。

实施例1、一种水产品中利福平的超高效液相色谱串联质谱检测方法，依次进行以下步骤：

1)、试剂溶液与标准溶液的配制

①试剂溶液

5mmol乙酸铵水溶液(含0.02％甲酸)：准确称取0.3860g(5mmol)乙酸铵于1L容量瓶中，加入0.20mL甲酸，用水定容至1L。

②标准溶液的配置

利福平标准储备溶液：准确称取利福平标准品0.0100g(精确至0.0001g)，用乙腈定容到100mL的棕色容量瓶中，此标准溶液浓度为100μg/mL，置于-18℃避光保存，有效期为半年；

利福平标准中间液：准确移取1mL利福平标准储备溶液(100μg/mL)，用乙腈定容到100mL的棕色容量瓶中，此标准溶液浓度为1.0μg/mL，置于-18℃避光保存，有效期3个月；

利福平标准工作液：准确移取25mL利福平标准中间液(1.0μg/mL)，用乙腈定容到250mL的棕色容量瓶中，此标准溶液浓度为0.1μg/mL，置于4℃避光保存，有效期1个月。

利福平稳定同位素内标储备溶液：准确称取利福平-D3标准品0.0100g(精确至0.0001g)，用乙腈定容到100mL的棕色容量瓶中，此标准溶液浓度为100μg/mL，置于-18℃避光保存，有效期为半年；

利福平稳定同位素内标工作溶液：准确移取1mL利福平-D3标准储备溶液(100μg/mL)，用乙腈定容到100mL的棕色容量瓶中，此标准溶液浓度为1.0μg/mL，置于4℃避光保存，有效期1个月。

检测时依次分别适量移取0.1μg/mL的利福平标准工作液配置成利福平浓度分别为0.0005、0.002、0.005、0.010、0.050和0.100μg/mL这6个浓度梯度的标准溶液，在上述6个浓度梯度的标准溶液中分别添加利福平稳定同位素内标工作溶液，从而使6个浓度梯度的标准溶液中利福平稳定同位素内标(利福平-D3)的浓度均为0.025μg/mL，即，获得6个带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液。

2)、制备待测样品溶液

①、准确称取2.5g均浆后的待测样品于50mL离心管中，加入浓度为1.0μg/mL利福平稳定同位素内标工作液0.25mL，静置后加入2.5g无水硫酸钠和8mL乙腈试剂，漩涡震荡(漩涡震荡的频率为2000rpm)提取10min后，于4℃以5000r/min离心5min，移取全部上清液至10mL容量瓶中，再乙腈定容至10mL。

②、准确移取上述提取液1mL上样到Oasis PRiME HLB固相萃取柱上，保持一秒一滴的流速(1ml/20S)，收集全部流出液，于4℃以12 000r/min高速离心10min，吸取上清液过0.2μm滤膜后得样品待测液；

3)、仪器分析条件：

将步骤1)中配置的6个带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液注入液相色谱-串联质谱仪，正离子多反应监测(MRM)模式测定，确定利福平及其稳定同位素内标的出峰位置，方法具体如下：

色谱条件为：

色谱柱：Accucore C₁₈RP-MS，2.6μm，2.1×100mm，或相当者；

流速：0.3mL/min；

柱温：40℃；

进样体积：2μL；

流动相由5mmol乙酸铵水溶液(含0.02％的甲酸，又称流动相A)和乙腈(又称流动相B)组成；梯度洗脱程序见表1：

表1液相色谱-串联质谱法的梯度洗脱程序表

质谱条件为：

离子源为电喷雾离子源；检测方式为正离子多反应监测(MRM)模式；电喷雾电压为5500kV；离子源温度为500～600℃；雾化器(GS1)压力为210kPa；辅助气(GS2)压力为280kPa；气帘气(CUR)压力为105kPa；通过针泵进样确定利福平的主要二级碎片(见图1)，选择m/z 823.4>791.4和m/z 823.4>399.1离子对为利福平定量和定性离子对，利福平及氘代利福平的具体质谱信息见表2。

表2.利福平与内标物的质谱分析参数

注：*表示定量离子。

4)、样品测定

将步骤1)所得的6个带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液按照步骤3)方法进行测定，实际样品按步骤2)操作所获得的上清液(即，步骤2中所得的样品待测液)按步骤3)方法进行测定。

5)、定性分析

对应步骤4)，在相同试验条件下，样品中待测物与同时检测的标准物质具有相同的保留时间(允许偏差小于±2.5％)，样品定性离子的相对离子丰度与浓度接近(只要峰面积接近既可判断为浓度接近)的标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度，％	＞50	＞20～50	＞10～20	≤10
					允许的最大偏差，％	±20	±25	±30	±50

6)、定量分析

以标准工作溶液中利福平定量离子对823.4>791.4峰面积和利福平稳定同位素内标(利福平-D3)离子对826.4>794.4峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中利福平浓度(ng/mL)为横坐标绘制标准工作曲线，线性方程Y＝0.0388X-0.00000000797，线性相关系数r为0.9998，如图3所述。

以步骤4)所述的样品待测液测定所得的利福平定量离子对823.4>791.4峰面积和利福平稳定同位素内标(利福平-D3)离子对826.4>794.4峰面积的比值为纵坐标，代入上述线性方程中，从而获得样品待测液中利福平浓度。

根据样品待测液中利福平浓度，经换算获得均浆样品中利福平浓度。

换算关系具体为：均浆样品中利福平(ng/g)＝样品待测液中利福平浓度(ng/mL)×10mL÷2.5g。

注1：在上述色谱、质谱条件下，利福平及利福平稳定同位素内标(利福平-D3)的液相色谱-串联质谱总离子流图及多反应离子监测(MRM)质谱图参见图2。

实验1、灵敏度、准确度、精密度

对空白(不含利福平)鲤鱼、大黄鱼、对虾和中华鳖样品按照步骤(2)进行处理，获得上述4种水产品的待测基质液(即，样品待测液)，加入利福平标准物质分别配置上机液。当进样浓度为0.5ng/mL时，4种水产品中利福平的信噪比(S/N)分别为40.5、25.2、36.5和50.1，取灵敏度最低的大黄鱼基质判定本方法的检测低限，按照3倍信噪比(S/N＝3)确定本发明水产品中利福平的最低检出限为0.3μg/kg。

用事先已知不含利福平的鲤鱼、大黄鱼、对虾和中华鳖样品，加入已知浓度的利福平标准溶液，进行了添加回收率试验，使其在样品中的浓度分别为2.0μg/kg、10μg/kg和50μg/kg(对应于分析溶液中的浓度应分别为0.5ng/mL、2.5ng/mL和12.5μg/mL)，每组重复6次，得到的样品添加回收率见表4。

结果表明，本发明所建立的水产品中利福平液质联用检测方法的灵敏度、准确度与精密度满足痕量检测的监测要求。

表4、对虾、鲫鱼、大黄鱼、中华鳖样品中添加回收率试验对应的结果(n＝6)

对比例1、取消实施例1中的“同位素内标法”，即，将扎来普隆作为内标；其余等同于实施例1。

对比例2、将实施例1中“作为利福平的提取剂”由“乙腈”改成“80％乙腈溶液”；其余等同于实施例1。

对比例3、将实施例1步骤2)制备待测样品溶液中的“无水硫酸钠”改成“无水硫酸镁”；其余等同于实施例1。

对比例4、将实施例1的2处离心时的温度由“4℃”改成“常规的室温15℃”，其余等同于实施例1。

对比例5、将实施例1中的“5mmol乙酸铵水溶液(含0.02％甲酸)”改成常规的5mmol乙酸铵水溶液；其余等同于实施例1。

备注说明：上述对比例均获得其各自对应的线性方程。

将上述对比例按照上述本发明所述方法确定产品中利福平的最低检出限为依次为5μg/kg、20μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、1μg/kg。

另：对比例1的大黄鱼和对虾作为基质样品时，还会造成方法回收率高于120％，影响定量结果准确性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱快速测定方法，其特征在于包括以下步骤：

(A)、样品提取：

称取2.5g均浆样品于离心管中，加入含有0.25μg利福平稳定同位素内标物的溶液，静置后加入2～3g无水硫酸钠后采用7.5～12.5mL乙腈作为试剂提取，漩涡震荡提取后，于4±1℃高速离心，移取上清液至比色管中，用乙腈定容至10mL～15mL；

(B)、样品净化：

移取步骤(A)所得的提取液直接上样至Oasis PRiME HLB固相萃取柱上，收集全部流出液后于4±℃高速离心，过0.2μm滤膜，得样品待测液；

带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液的制备方法为：先配制利福平浓度为0.0005～0.100μg/mL浓度梯度的利福平乙腈溶液作为标准溶液，然后再上述标准溶液中分别添加利福平稳定同位素内标工作溶液，从而使所得的带有利福平稳定同位素内标的利福平浓度梯度标准工作溶液中，利福平稳定同位素内标的浓度均为0.025μg/mL；

(D)、液相色谱-串联四级杆质谱仪测定：

(E)、定性依据和定量分析：

采用串联四级杆质谱的多反应监测模式(MRM)采集利福平的定量离子对和定性离子对信息；以多反应监测提取的利福平定量离子对与利福平稳定同位素内标物离子对的峰面积比值为纵坐标，利福平的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，将样品的利福平与内标物峰面积比值带入线性方程，获得样品中目标物的含量。

2.根据权利要求1所述的适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱快速测定方法，其特征在于所述步骤(C)中：

色谱条件为：

C18分析色谱柱2.1×100mm，2.6μm；柱温：40℃；流速：0.30mL/min；进样量：2μL；洗脱梯度：0～1.0min，30％B；1.0～5.0min，30％～90％B；5.0～6.0min，90％B；6.0～6.5min，90％～30％B；6.5～8.5min，30％B；

流动相A为在5mmol/L乙酸铵水溶液且含0.02％的甲酸，流动相B为纯乙腈；

质谱条件为：

离子源为电喷雾离子源；检测方式为正离子多反应监测(MRM)模式；电喷雾电压为5500kV；离子源温度为500～600℃；雾化器(GS1)压力为210kPa；辅助气(GS2)压力为280kPa；气帘气(CUR)压力为105kPa；利福平及同位素内标氘代利福平的质谱信息如下表；

*定量离子。

3.根据权利要求2所述的适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱快速测定方法，其特征在于：

所述步骤(C)中，利福平稳定同位素内标工作溶液为浓度为1.0μg/mL的利福平-D3乙腈溶液。

4.根据权利要求3所述的适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱快速测定方法，其特征在于：

所述步骤(A)的高速离心为4000～6000r/min离心2～8分钟，离心温度为4±1℃；

所述步骤(B)的高速离心为10000～14000r/min高速离心8～12min，离心温度为4±1℃。

5.根据权利要求3所述的适用于水产品中利福平药物残留的超高效液相色谱-串联质谱快速测定方法，其特征在于：

所述加入含有0.25μg利福平稳定同位素内标物的溶液为，加入浓度为1.0μg/mL利福平稳定同位素内标工作液0.25mL。