CN102141552A

CN102141552A - 一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备

Info

Publication number: CN102141552A
Application number: CN2010101024715A
Authority: CN
Inventors: 姜合作; 刘丽宏; 李鹏飞; 马萍; 吴诚; 童卫杭
Original assignee: GENERAL HOSPITAL OF SECOND ARTILLERY OF CHINESE PLA
Current assignee: GENERAL HOSPITAL OF SECOND ARTILLERY OF CHINESE PLA
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2011-08-03

Abstract

本发明提供了一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备方法。以子囊霉素为内标，先用硫酸锌溶液处理全血样本，然后用乙腈沉淀，采用C₁₈键合相硅胶为固定相，以乙腈-1mM乙酸铵为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测，离子选择通道分别为m/z 821.3→m/z 768.3(他克莫司)和m/z 809.4→m/z 756.4(内标子囊霉素)。本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到1.0ng/ml，各项方法学指标均可满足他克莫司临床血药浓度监测和大规模临床研究的需要。

Description

一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备

所属技术领域

本发明涉及一种基于液相色谱质谱技术开发的全血中他克莫司定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱质谱技术对全血中他克莫司进行高灵敏度定量检测的方法。

本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。

背景技术

他克莫司(tacrolimus，简称FK506)是从链霉菌属培养物中分离得到的大环内酯类新型免疫抑制剂，能有效抑制T淋巴细胞激活。FK506与内源性细胞受体结合，形成一个亲免素复合物，从而发挥药理作用。目前FK506已在肝、肾、心、胰等器官移植中广泛用于抗排斥及自身免疫系统相关疾病的治疗。FK506的血药浓度与免疫抑制强度和毒副反应相关，不仅治疗窗窄而且药动学个体差异大，临床使用FK506需要进行血药浓度监测。

目前临床常规监测FK506全血浓度的方法主要有微粒子捕捉酶免疫发光技术(microparticle enzyme immunoassay，MEIA)和酶联吸附免疫分析技术(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。ELISA法和MEIA法对体内FK506及其代谢产物产生交叉免疫反应，使实际测得结果为FK506及其代谢物之和。

液相色谱质谱技术(LC-MS/MS)是近年来迅速发展的定量分析技术，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内药物分析、新生儿遗传疾病筛查和药物代谢研究等领域的实用方法。研究开发一种结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的FK506血药浓度的LC-MS/MS检测试剂盒，使其能广泛应用于我国FK506临床研究和常规血药浓度监测中，将有助于提高FK506检测质量、促进检测方法标准化和规范化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒，以满足他克莫司临床血药浓度监测和大规模临床研究的需要。

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。

技术方案

本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定人全血样本中FK506浓度的新型试剂盒。试剂盒以子囊霉素为内标，先用硫酸锌溶液处理全血样本，然后用乙腈沉淀，取上清液进行LC-MS/MS检测，记录FK506和内标的峰面积。采用内标法，根据待测样本中的FK506/内标峰面积比值即可计算出FK506浓度。测定结果为全血样本中FK506浓度。

本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤：

1.他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制：精密称取5mg他克莫司对照品，置10mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，配制成0.5mg/mL的他克莫司储备液。精密量取他克莫司储备液0.5mL，置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，配制成5μg/mL的他克莫司母液。分别精密量取他克莫司母液0、0.01、0.03、0.1、0.3、0.5mL，分别置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，所配制他克莫司标准曲线样本浓度分别为0、1、3、10、30、50ng/mL，分装，贴签标记，完成操作。分别精密量取他克莫司母液0.025、0.1、0.4mL，置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，所配制他克莫司质控样本浓度分别为2.5、10、40ng/mL，分装，贴签标记，完成操作。

2.样本处理液的配制：精密称取14.38g ZnSO₄·7H₂O，置500mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即为100mmol/L硫酸锌溶液，分装，贴签标记，完成操作。

3.内标液的配制：精密称取1mg子囊霉素对照品，置50mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，配制成20μg/mL的储备液，精密量取上述子囊霉素储备液1mL，置1000mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，即为20ng/mL子囊霉素溶液，分装，贴签标记，完成操作。

4.流动相调节液的配制：精密称取38.5g乙酸铵，置500mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即为1mol/L乙酸铵溶液，分装，贴签标记，完成操作。

本发明的试剂盒使用方法如下：

精密取全血样本100μL置1.5mL EP管中，加入样本处理液100μL，再加入内标液300μL，涡流混匀2min，静置30min，离心5min(12000rpm)，取上清液进样20μL进行LC-MS/MS定量分析。

有益效果

本发明试剂盒采用LC-MS/MS定量检测全血中FK506浓度，检测结果为FK506原型药物浓度，能更准确的说明药物浓度-效疗-不良反应三者之前的关系。同时，本发明试剂盒首次实现FK506定量检测技术国产化，可替代目前临床常规MEIA和ELISA法，用于服用FK506患者的血药浓度测定。它的推广应用将有助于提高FK506检测质量、促进检测方法标准化和规范化，使临床FK506血药浓度的监测更为快捷、准确、可靠。

附图说明

图1他克莫司样本处理和检测过程

图2他克莫司(A)和内标子囊霉素(B)[M+H]⁺的二级全扫描质谱图

图3LC-MS/MS测定人全血中他克莫司和内标子囊霉素的典型色谱图

A空白全血

B空白全血加入1.0ng·mL^-1他克莫司和20ng·mL^-1内标子囊霉的色谱图

C口服给予他克莫司胶囊2mg后1h的全血样本

I.他克莫司(FK506)II.子囊霉素(internal standard)

图4他克莫司典型标准曲线图

具体实施方式

1、适用仪器

液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，配备电喷雾离子源(ESI)。

2、样本要求

采集静脉全血样本，置于抗凝管中，血样采集后应立即放置于2～8℃冰箱存放备测。

3、检验方法

全血样本前处理：

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子方式检测；离子喷射电压：5500V；温度：550℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi.；气体2(GS2，N₂)压力：55psi.；气帘气体(N₂)压力：20psi.；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium；用于定量分析的离子反应为m/z 821.3→m/z 768.3(他克莫司，DP电压：42V；CE电压：29eV)，用于定性考察的离子反应为m/z 821.3→m/z 576.3(他克莫司，DP电压：42V；CE电压：33eV)，内标定量离子对m/z809.4→m/z 756.4(子囊霉素，DP电压：55V；CE电压：31eV)。

色谱条件：

色谱柱：C₁₈柱(10×4.6mm，5μm粒径)；

流动相：乙腈-流动相调节液蒸馏水稀释1000倍，梯度洗脱；

流速：1.20mL·min^-1(分流)；柱温：60℃；进样量：20μL。

表1梯度洗脱条件

测定法：

取处理好的标准曲线样本、质控样本和待测样本溶液各20μL注入液质联用仪，记录色谱图。

质控要求：

每1分析批样本随行1条标准曲线和6个质控样本(高、中、低浓度各2个)。质控样本测定结果偏差应小于15％，最多允许1/3的质控样本结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度质控样本中。如质控样本测定结果不符合上述要求，则该分析批样本测试结果作废，重新检测。

4、结果计算：

标准曲线绘制：以5个标准曲线样本的标示浓度(1.0、3.0、10.0、30.0、50.0ng·mL^-1)为横坐标(x)，以5个标准曲线样本的实测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

标准曲线方程的拟合：以5个标准曲线样本的实测峰面积与各自内标峰面积的比值(y)对标示浓度(x)加权最小二乘法进行线性回归。拟合线性回归方程：y＝ax+b，其中a为斜率，b为截距，并计算相关系数(r)，r应不低于0.9900。

回收率的计算：将质控样本测定的FK506峰面积和内标峰面积的比值代入上述标准曲线方程，计算质控样本的FK506测定浓度。质控样本回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在100±15％范围内。

样本结果计算：将样本的FK506峰面积和内标峰面积的比值代入标准曲线方程，计算样本的FK506浓度。

Claims

1.一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒，其特征在于由特定浓度的标准曲线样本、质控样本、样本处理液、内标液、流动相调节液组成。

2.根据权利1所述的全血他克莫司定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制；(2)样本处理液硫酸锌溶液的配制；(3)内标液子囊霉素的配制；(4)流动相调节液乙酸铵的配制。

3.一种全血中他克莫司定量检测方法，包括：

(1)全血样本预处理：

取一定量的全血，加入一定量的样本处理液，加入内标溶液及蛋白沉淀剂，涡流，高速离心取上清液。

(2)液相分离：

a.采用C₁₈、C₈或氰基键和硅胶作固定相；

b.流动相：乙腈；1mM乙酸铵溶液；等度或梯度洗脱；控制流速。

(3)质谱测定：电喷雾离子源，正离子方式。

4.根据权利3所述的全血中他克莫司定量检测方法，其特征在于用用硫酸锌处理全血细胞，用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀。

5.根据权利3所述的全血中他克莫司定量检测方法，其特征在于其所使用的流动相为：乙腈∶1mM乙酸铵溶液；反相色谱等度或梯度分离。