CN102141552A - 一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备 - Google Patents
一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102141552A CN102141552A CN2010101024715A CN201010102471A CN102141552A CN 102141552 A CN102141552 A CN 102141552A CN 2010101024715 A CN2010101024715 A CN 2010101024715A CN 201010102471 A CN201010102471 A CN 201010102471A CN 102141552 A CN102141552 A CN 102141552A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tacrolimus
- whole blood
- preparation
- sample
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供了一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备方法。以子囊霉素为内标,先用硫酸锌溶液处理全血样本,然后用乙腈沉淀,采用C18键合相硅胶为固定相,以乙腈-1mM乙酸铵为流动相进行反相色谱梯度分离,运用质谱仪进行定量检测,离子选择通道分别为m/z 821.3→m/z 768.3(他克莫司)和m/z 809.4→m/z 756.4(内标子囊霉素)。本发明的试剂盒,测试灵敏度可达到1.0ng/ml,各项方法学指标均可满足他克莫司临床血药浓度监测和大规模临床研究的需要。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种基于液相色谱质谱技术开发的全血中他克莫司定量检测试剂盒,更具体地说是采用液相色谱质谱技术对全血中他克莫司进行高灵敏度定量检测的方法。
本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。
背景技术
他克莫司(tacrolimus,简称FK506)是从链霉菌属培养物中分离得到的大环内酯类新型免疫抑制剂,能有效抑制T淋巴细胞激活。FK506与内源性细胞受体结合,形成一个亲免素复合物,从而发挥药理作用。目前FK506已在肝、肾、心、胰等器官移植中广泛用于抗排斥及自身免疫系统相关疾病的治疗。FK506的血药浓度与免疫抑制强度和毒副反应相关,不仅治疗窗窄而且药动学个体差异大,临床使用FK506需要进行血药浓度监测。
目前临床常规监测FK506全血浓度的方法主要有微粒子捕捉酶免疫发光技术(microparticle enzyme immunoassay,MEIA)和酶联吸附免疫分析技术(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。ELISA法和MEIA法对体内FK506及其代谢产物产生交叉免疫反应,使实际测得结果为FK506及其代谢物之和。
液相色谱质谱技术(LC-MS/MS)是近年来迅速发展的定量分析技术,具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点,日渐成为体内药物分析、新生儿遗传疾病筛查和药物代谢研究等领域的实用方法。研究开发一种结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的FK506血药浓度的LC-MS/MS检测试剂盒,使其能广泛应用于我国FK506临床研究和常规血药浓度监测中,将有助于提高FK506检测质量、促进检测方法标准化和规范化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒,以满足他克莫司临床血药浓度监测和大规模临床研究的需要。
本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。
技术方案
本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定人全血样本中FK506浓度的新型试剂盒。试剂盒以子囊霉素为内标,先用硫酸锌溶液处理全血样本,然后用乙腈沉淀,取上清液进行LC-MS/MS检测,记录FK506和内标的峰面积。采用内标法,根据待测样本中的FK506/内标峰面积比值即可计算出FK506浓度。测定结果为全血样本中FK506浓度。
本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤:
1.他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制:精密称取5mg他克莫司对照品,置10mL容量瓶中,加乙腈溶解,并稀释至刻度,配制成0.5mg/mL的他克莫司储备液。精密量取他克莫司储备液0.5mL,置50mL容量瓶中,加全血稀释至刻度,配制成5μg/mL的他克莫司母液。分别精密量取他克莫司母液0、0.01、0.03、0.1、0.3、0.5mL,分别置50mL容量瓶中,加全血稀释至刻度,所配制他克莫司标准曲线样本浓度分别为0、1、3、10、30、50ng/mL,分装,贴签标记,完成操作。分别精密量取他克莫司母液0.025、0.1、0.4mL,置50mL容量瓶中,加全血稀释至刻度,所配制他克莫司质控样本浓度分别为2.5、10、40ng/mL,分装,贴签标记,完成操作。
2.样本处理液的配制:精密称取14.38g ZnSO4·7H2O,置500mL容量瓶中,加蒸馏水溶解,并稀释至刻度,即为100mmol/L硫酸锌溶液,分装,贴签标记,完成操作。
3.内标液的配制:精密称取1mg子囊霉素对照品,置50mL容量瓶中,加乙腈溶解,并稀释至刻度,配制成20μg/mL的储备液, 精密量取上述子囊霉素储备液1mL,置1000mL容量瓶中,加乙腈溶解,并稀释至刻度,即为20ng/mL子囊霉素溶液,分装,贴签标记,完成操作。
4.流动相调节液的配制:精密称取38.5g乙酸铵,置500mL容量瓶中,加蒸馏水溶解,并稀释至刻度,即为1mol/L乙酸铵溶液,分装,贴签标记,完成操作。
本发明的试剂盒使用方法如下:
精密取全血样本100μL置1.5mL EP管中,加入样本处理液100μL,再加入内标液300μL,涡流混匀2min,静置30min,离心5min(12000rpm),取上清液进样20μL进行LC-MS/MS定量分析。
有益效果
本发明试剂盒采用LC-MS/MS定量检测全血中FK506浓度,检测结果为FK506原型药物浓度,能更准确的说明药物浓度-效疗-不良反应三者之前的关系。同时,本发明试剂盒首次实现FK506定量检测技术国产化,可替代目前临床常规MEIA和ELISA法,用于服用FK506患者的血药浓度测定。它的推广应用将有助于提高FK506检测质量、促进检测方法标准化和规范化,使临床FK506血药浓度的监测更为快捷、准确、可靠。
附图说明
图1他克莫司样本处理和检测过程
图2他克莫司(A)和内标子囊霉素(B)[M+H]+的二级全扫描质谱图
图3LC-MS/MS测定人全血中他克莫司和内标子囊霉素的典型色谱图
A空白全血
B空白全血加入1.0ng·mL-1他克莫司和20ng·mL-1内标子囊霉的色谱图
C口服给予他克莫司胶囊2mg后1h的全血样本
I.他克莫司(FK506)II.子囊霉素(internal standard)
图4他克莫司典型标准曲线图
具体实施方式
1、适用仪器
液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS),配备电喷雾离子源(ESI)。
2、样本要求
采集静脉全血样本,置于抗凝管中,血样采集后应立即放置于2~8℃冰箱存放备测。
3、检验方法
全血样本前处理:
精密取全血样本100μL置1.5mL EP管中,加入样本处理液100μL,再加入内标液300μL,涡流混匀2min,静置30min,离心5min(12000rpm),取上清液进样20μL进行LC-MS/MS定量分析。
质谱条件:
离子源:电喷雾离子源(ESI),正离子方式检测;离子喷射电压:5500V;温度:550℃;源内气体1(GS1,N2)压力:45psi.;气体2(GS2,N2)压力:55psi.;气帘气体(N2)压力:20psi.;扫描方式为多重反应监测(MRM);碰撞气(N2)压力:Medium;用于定量分析的离子反应为m/z 821.3→m/z 768.3(他克莫司,DP电压:42V;CE电压:29eV),用于定性考察的离子反应为m/z 821.3→m/z 576.3(他克莫司,DP电压:42V;CE电压:33eV),内标定量离子对m/z809.4→m/z 756.4(子囊霉素,DP电压:55V;CE电压:31eV)。
色谱条件:
色谱柱:C18柱(10×4.6mm,5μm粒径);
流动相:乙腈-流动相调节液蒸馏水稀释1000倍,梯度洗脱;
流速:1.20mL·min-1(分流);柱温:60℃;进样量:20μL。
表1梯度洗脱条件
测定法:
取处理好的标准曲线样本、质控样本和待测样本溶液各20μL注入液质联用仪,记录色谱图。
质控要求:
每1分析批样本随行1条标准曲线和6个质控样本(高、中、低浓度各2个)。质控样本测定结果偏差应小于15%,最多允许1/3的质控样本结果超过上述限度,但不能出现在同一浓度质控样本中。如质控样本测定结果不符合上述要求,则该分析批样本测试结果作废,重新检测。
4、结果计算:
标准曲线绘制:以5个标准曲线样本的标示浓度(1.0、3.0、10.0、30.0、50.0ng·mL-1)为横坐标(x),以5个标准曲线样本的实测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y),绘制标准曲线。
标准曲线方程的拟合:以5个标准曲线样本的实测峰面积与各自内标峰面积的比值(y)对标示浓度(x)加权最小二乘法进行线性回归。拟合线性回归方程:y=ax+b,其中a为斜率,b为截距,并计算相关系数(r),r应不低于0.9900。
回收率的计算:将质控样本测定的FK506峰面积和内标峰面积的比值代入上述标准曲线方程,计算质控样本的FK506测定浓度。质控样本回收率的计算公式为:回收率(%)=测定浓度/标示浓度×100,回收率(%)应在100±15%范围内。
样本结果计算:将样本的FK506峰面积和内标峰面积的比值代入标准曲线方程,计算样本的FK506浓度。
Claims (5)
1.一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒,其特征在于由特定浓度的标准曲线样本、质控样本、样本处理液、内标液、流动相调节液组成。
2.根据权利1所述的全血他克莫司定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于包括如下步骤:(1)他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制;(2)样本处理液硫酸锌溶液的配制;(3)内标液子囊霉素的配制;(4)流动相调节液乙酸铵的配制。
3.一种全血中他克莫司定量检测方法,包括:
(1)全血样本预处理:
取一定量的全血,加入一定量的样本处理液,加入内标溶液及蛋白沉淀剂,涡流,高速离心取上清液。
(2)液相分离:
a.采用C18、C8或氰基键和硅胶作固定相;
b.流动相:乙腈;1mM乙酸铵溶液;等度或梯度洗脱;控制流速。
(3)质谱测定:电喷雾离子源,正离子方式。
4.根据权利3所述的全血中他克莫司定量检测方法,其特征在于用用硫酸锌处理全血细胞,用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀。
5.根据权利3所述的全血中他克莫司定量检测方法,其特征在于其所使用的流动相为:乙腈∶1mM乙酸铵溶液;反相色谱等度或梯度分离。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010101024715A CN102141552A (zh) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | 一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2010101024715A CN102141552A (zh) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | 一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102141552A true CN102141552A (zh) | 2011-08-03 |
Family
ID=44409220
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010101024715A Pending CN102141552A (zh) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | 一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102141552A (zh) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103163225A (zh) * | 2011-12-14 | 2013-06-19 | 刘丽宏 | 一种高灵敏全血环孢素a定量检测试剂盒及其制备 |
CN106770747A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-05-31 | 广州迈达康医药科技有限公司 | 一种他克莫司制剂评价方法 |
CN109387573A (zh) * | 2017-08-03 | 2019-02-26 | 刘丽宏 | 一种液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒及其制备 |
CN109884234A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-06-14 | 杭州同创医学检验实验室有限公司 | 一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法 |
CN110470753A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-11-19 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 一种干血斑中四种免疫抑制剂检测方法及检测试剂盒 |
CN112697918A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-23 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 他克莫司的检测方法 |
CN114509526A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-17 | 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) | 一种基于lc-ms/ms的纯溶剂型全血免疫抑制剂药物浓度联检试剂盒及检测方法 |
CN115267015A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-11-01 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 用于质谱检测的样本前处理组合物及应用、前处理方法 |
CN115308328A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-11-08 | 江苏格诺生物科技有限公司 | 一种检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒及其使用方法 |
CN115825296A (zh) * | 2022-10-13 | 2023-03-21 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 用于血液样本中他克莫司检测的样本前处理试剂盒及处理方法 |
-
2010
- 2010-01-29 CN CN2010101024715A patent/CN102141552A/zh active Pending
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
刘丽宏等: "CYP3A5基因型和LC-MS/MS技术联合指导他克莫司临床个体化给药", 《北京师范大学学报(自然科学版)》 * |
李鹏飞等: "LC-MS/MS法测定人全血中他克莫司的浓度及其在生物等效性试验中的应用", 《药物分析杂志》 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103163225A (zh) * | 2011-12-14 | 2013-06-19 | 刘丽宏 | 一种高灵敏全血环孢素a定量检测试剂盒及其制备 |
CN106770747A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-05-31 | 广州迈达康医药科技有限公司 | 一种他克莫司制剂评价方法 |
CN109387573A (zh) * | 2017-08-03 | 2019-02-26 | 刘丽宏 | 一种液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒及其制备 |
CN109884234A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-06-14 | 杭州同创医学检验实验室有限公司 | 一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法 |
CN110470753A (zh) * | 2019-07-24 | 2019-11-19 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 一种干血斑中四种免疫抑制剂检测方法及检测试剂盒 |
CN112697918A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-23 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 他克莫司的检测方法 |
CN114509526A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-17 | 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) | 一种基于lc-ms/ms的纯溶剂型全血免疫抑制剂药物浓度联检试剂盒及检测方法 |
CN115267015A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-11-01 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 用于质谱检测的样本前处理组合物及应用、前处理方法 |
CN115308328A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-11-08 | 江苏格诺生物科技有限公司 | 一种检测人全血中多种免疫抑制剂药物的预处理试剂盒及其使用方法 |
CN115825296A (zh) * | 2022-10-13 | 2023-03-21 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 用于血液样本中他克莫司检测的样本前处理试剂盒及处理方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102141552A (zh) | 一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备 | |
CN111289736A (zh) | 基于代谢组学的慢阻肺早期诊断标志物及其应用 | |
Korecka et al. | Review of the newest HPLC methods with mass spectrometry detection for determination of immunosuppressive drugs in clinical practice | |
CN109387573A (zh) | 一种液相色谱串联质谱法定量干血滤纸片中他克莫司试剂盒及其制备 | |
CN111781290A (zh) | 用于准确测定人血清中多种抗癫痫药物血药浓度的试剂盒及检测方法 | |
CN110174470A (zh) | 一种水产品中海洋生物毒素的高通量检测方法 | |
CN103163225A (zh) | 一种高灵敏全血环孢素a定量检测试剂盒及其制备 | |
CN106248809A (zh) | 一种同时分离测定三种氨基糖苷类抗生素的含量的方法 | |
CN108072712B (zh) | 一种sd大鼠血浆中新化合物wsj-557的血药浓度定量分析方法 | |
CN110361484A (zh) | 一种血液中胺碘酮药物浓度监测试剂盒及其检测方法 | |
CN107271599A (zh) | 一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线spe lc-ms/ms分析方法 | |
Vuckovic et al. | Automated study of ligand–receptor binding using solid-phase microextraction | |
CN103439444A (zh) | 检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法 | |
CN113049731A (zh) | 一种检测血清中平喘药物的方法和试剂盒 | |
CN101865887A (zh) | 高效液相色谱串联质谱测蜂王浆中硝基咪唑类残留的方法 | |
CN107831259A (zh) | 一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法 | |
CN102539592A (zh) | 检测体液中极长链脂肪酸含量的方法 | |
CN110361485A (zh) | 一种血液中奥卡西平药物浓度监测试剂盒及其检测方法 | |
CN105891368A (zh) | 人外周血单个核细胞内乙酰胆碱含量的检测方法 | |
CN101581704B (zh) | 用于检测低浓度乙酰化金刚烷胺的测定方法 | |
CN102621267B (zh) | 一种测定血浆或尿液中d-山梨醇浓度的方法 | |
CN110361488A (zh) | 一种血液中拉莫三嗪药物浓度监测试剂盒及其检测方法 | |
CN102368072B (zh) | 检测环孢霉素a药物浓度的化学发光酶联免疫检测试剂盒 | |
CN114397379A (zh) | 一种液质联用测定血浆中奥硝唑浓度的方法 | |
CN114689737A (zh) | 一种s-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Li Pengfei Document name: Notification to Make Rectification |
|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110803 |