CN112697918A - 他克莫司的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了他克莫司的检测方法，包括：制备具有他克莫司和内标物的至少三种浓度的标准溶液，标准溶液中的内标物的量相同；利用液质联用仪在检测条件下检测每一种标准溶液，获得标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中他克莫司的浓度和内标物的浓度，拟合他克莫司的标准曲线方程；向待处理样品内顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第一上清液作为待测样品；利用液质联用仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中他克莫司的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

他克莫司的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及他克莫司的检测方法。
背景技术
他克莫司是从链霉菌中分离出的一种大环内酯物，具有很强的免疫抑制作用。他克莫司溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或乙醚，难溶于己烷或石油醚，不溶于水。
目前，检测样品中他克莫司含量通常采用的方法为高效液相色谱质谱法。而现有高效液相色谱质谱法通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长。
发明内容
本发明提供了他克莫司的检测方法，能够缩短样品检测时间。
为了解决上述问题，本发明实施例提供了他克莫司的检测方法，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有他克莫司和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中他克莫司的浓度和内标物的浓度，拟合他克莫司的标准曲线方程；
向待处理样品内顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第一上清液作为待测样品；
利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中他克莫司的浓度。
优选地，为了更准确地检测出待测样品中他克莫司的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为[13C,2H4]-他克莫司，采用目标物的同位素作为内标物，可以避免因子囊霉素与目标物联合使用而导致定量不准，从而提高目标物的检测准确性。
具体地，系列浓度的标准溶液制备方式如下：
(1)标准储备液的配制
移取1000μg/mL的他克莫司标准品溶液，并用含有0％-50％水的甲醇溶液作为稀释液进行稀释，并定容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为12个月。
(2)标准工作液的配制
取适量步骤(1)中的标准储备液，用稀释液进行稀释混合，得到含有5-1000ng/mL他克莫司的标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。
(3)内标储备液的配制
精准称内标物[13C,2H4]-他克莫司标准品置于容量瓶中，用稀释液进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到内标储备液，并在-20℃条件下保存，有效期为6个月。
(4)内标工作液的配制
取步骤(3)中内标储备液，用稀释液进行稀释，得到含[13C,2H4]-他克莫司的内标工作液，并在4℃保存，有效期为6个月。
(5)标准溶液的标定
分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液和步骤(4)中的内标工作液置于离心管中，分别向各个离心管中加入含有0％-50％水的甲醇溶液，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀0.5-1.0min后即可作为标准溶液。
为了保证他克莫司和[13C,2H4]-他克莫司的充分溶解，同时降低他克莫司和[13C,2H4]-他克莫司的工作溶液的挥发性，所以稀释液为含有0％-50％水的甲醇溶液。
优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：
洗脱流动相中的水相包括：含有0.1％-0.5％甲酸、0-10mM的缓冲盐的水溶液；
洗脱流动相中的有机相包括：含有0-0.5％甲酸和0-1mM的缓冲盐的甲醇溶液；
柱温为18-60℃；流速为0.4-0.6mL/min。
优选地，待测样品的进样量为5-20μL。当进样量为5μL时信噪比为12.0，可满足定量要求。
具体地，液相条件的色谱柱包括但不限于Waters XBridge TM C18色谱柱(内径2.1mm×柱长100mm、填料的粒径5μm)、Agilent Extend-C18(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)、Agilent poroshell EC C18(内径3.0mm×柱长50mm、填料的粒径2.7μm)、SHIMADZU-SP-C18(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径2.6μm)以及phenomenex KinetexXB-C18(内径3.0mm×柱长50mm、填料的粒径2.6μm)。
具体地，洗脱流动相的有机相中可以加入甲酸也可以不添加甲酸。当洗脱流动相的有机相中加入甲酸时，由于质谱检测器为ESI(+)检测模式，因此，通过该洗脱流动相对待测样品进行检测，可以增加待测样品的离子化程度，提高目标物质谱峰的强度。
具体地，当洗脱流动相中的水相中的甲酸含量大于0.5％，且有机相中的甲酸含量大于0.5％时，洗脱流动相中的甲酸含量过多，导致洗脱流动相的pH值过低，从而对色谱柱造成不可逆的损伤。因此，洗脱流动相中的水相包括：含有0.1％-0.5％甲酸；有机相包括：含有0％-0.5％甲酸。
具体地，洗脱流动相的有机相中可以加入缓冲盐也可以不添加缓冲盐，当添加缓冲盐时，缓冲盐的添加量应小于1mM，以防止缓冲盐析出、沉积甚至损害色谱柱。
针对水相中的甲酸来说，含有0.1％-0.5％甲酸是指含有0.1％至0.5％范围内任一值的甲酸，比如，水相中含有0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％以及0.5％的甲酸。
针对水相中的缓冲盐来说，含有0-10mM的缓冲盐是指水相中含有0mM至10mM范围内任一值的缓冲盐，比如，含有0mM、2mM、4mM、6mM、8mM以及10mM的缓冲盐。
针对有机相中的甲酸来说，含有0％-0.5％甲酸是指含有0％至0.5％范围内任一值的甲酸，比如，有机相中含有0％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％以及0.5％的甲酸。
针对有机相中的缓冲盐来说，含有0-1mM的缓冲盐是指有机相中含有0mM至1mM范围内任一值的缓冲盐，比如，含有0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM以及1mM的缓冲盐。
优选地，洗脱流动相中的缓冲盐包括甲酸铵或乙酸铵。
针对柱温来说，18℃-60℃是指18℃到60℃范围内的任一值，比如，18℃、20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、43℃、45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃以及60℃。
针对流速来说，0.4-0.6mL/min是指0.4mL/min到0.6mL/min范围内的任一值，比如，0.4mL/min、0.45mL/min、0.5mL/min、0.55mL/min以及0.6mL/min。
优选地，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比：
0.00min：50％:50％-90％:10％；0.01min：90％:10％-100％:0％；
1.50min：90％:10％-100％:0％；1.51min：50％:50％-90％:10％；
2.00min：50％:50％-90％:10％。
针对洗脱流动相中的有机相与水相在0.00min、1.51min以及2.00min的体积比，50％:50％-90％:10％是指50％:50％至90％:10％范围内的任一比例，比如，50％:50％、60％:40％、70％:30％、80％:20％以及90％:10％。
针对洗脱流动相中的有机相与水相在0.01min以及1.50min的体积比，90％:10％-100％:0％是指90％:10％至100％:0％范围内的任一比例，比如，90％:10％、92％:8％、94％:6％、96％:4％、98％:2％以及100％:0％。
具体地，当0.00min时洗脱流动相中初始有机相的占比大于50％且小于90％时，为了保证良好的峰形，0.01min时有机相的占比范围为95％-100％；当0.00min时洗脱流动相中初始有机相的占比为90％时，0.01min时有机相的占比范围为90％-100％。
由于有机相与水相在洗脱流动相中占比的总和为1，因此，当有机相在洗脱流动相中的占比增加，水相在洗脱流动相中的占比则相应降低。
例如，当0min有机相与水相的体积比为70％:30％，0.01min有机相与水相的比例为100％:0％时，那么在0min至0.01min时间段内，有机相由占比70％逐渐增加至100％，水相则由占比30％逐渐降低至0％。
具体地，若0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比小于50％时，随着待测样品数量的增加，会导致目标物的响应信号逐渐降低，影响待测样本的检测灵敏度；若0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比大于90％时，他克莫司的保留时间小，出峰过早，容易产生基质效应。
优选地，所述检测条件中的质谱条件，包括：
所述液质联用仪中的质谱检测器为ESI(+)检测模式；
所述液质联用仪中的离子源参数为：加热气流速(L/min):8-12，雾化气流速(L/min):20-30，加热气温度(℃):300-350，毛细管电压(V):3000-4000。
针对加热气流速来说，8-12L/min是指8L/min至12L/min范围内的任意值，比如，8L/min、9L/min、10L/min、11L/min以及12L/min。
针对雾化气流速来说，20-30L/min是指20L/min至30L/min范围内的任意值，比如，20L/min、22L/min、24L/min、26L/min、28L/min以及30L/min。
针对加热气温度来说，300-350℃是指300℃至350℃范围内的任意值，比如，300℃、310℃、320℃、330℃、340℃以及350℃。
针对毛细管电压来说，3000-4000V是指3000V至4000V范围内的任意值，比如，3000V、3100V、3200V、3300V、3400V、3500V、3600V、3700V、3800V、3900V以及4000V。
优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中他克莫司的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中他克莫司的浓度与内标物的浓度的比值。
具体地，若他克莫司的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的x值(即自变量)时，他克莫司的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)。
若他克莫司的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)时，他克莫司的浓度与内标物的浓度的比值则为标准曲线方程的x值(即自变量)。
优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对加入内标物后的第一上清液进行蛋白沉淀的沉淀蛋白试剂包括：含有0％-91％乙腈的甲醇溶液。
针对沉淀蛋白试剂来说，含有0％-91％乙腈的甲醇溶液是指含有0％至91％范围内任一值的乙腈，比如，含有0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％以及91％的乙腈。
优选地，为了更好的去除杂质，所述待处理样品与所述沉淀蛋白试剂的体积比包括1:3-1:20。
针对待处理样品和沉淀蛋白试剂的体积比来说，1:3-1:20是指1:3至1:20范围内的任一比例，比如，1:3、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:14、1:15、1:16、1:18以及1:20。
具体地，当待处理样品的体积为100μL，那么沉淀蛋白试剂的体积可以是300μL至2000μL范围内的任一值。当待处理样品和沉淀蛋白试剂的体积比为1:20时，信噪比为14.4，可满足定量检测要求。
优选地，所述向待处理样品内顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第一上清液作为待测样品，包括：
向所述待处理样品内顺次加入内标物，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合0.5-2min；
顺次加入沉淀蛋白试剂，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合2-5min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，移取离心后的第二上清液；
将所述第二上清液在10000-15000rpm的转速下高速离心3-8min，取离心后的第一上清液作为待测样品。
具体地，在向待处理样品内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀，可先涡旋混合，再向混合后的待处理样品内加入沉淀蛋白试剂，并涡旋混匀，进行蛋白沉淀，以通过沉淀蛋白试剂对混合后的待处理样品进行提取。其次进行高速离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。然后对第二上清液进行高速离心，取离心后的上层溶液(即第一上清液)作为待测样品，如此进一步将残留的杂质与目标物分离。由于无需加入硫酸锌水溶液，如此使得对待检测样品的前处理过程操作更加简单，同时减少前处理所需时间。
针对涡旋转速来说，1000-2500rpm是指1000rpm至2500rpm范围内的任一转速，比如，1000rpm、1200rpm、1400rpm、1600rpm、1800rpm、2000rpm、2200rpm、2400rpm以及2500rpm。
针对加入内标物之后的涡旋时间来说，0.5-2min是指，0.5min至2min范围内的任一时间，比如，0.5min、0.6min、0.8min、1.0min、1.2min、1.4min、1.6min、1.8min以及2min。
针对加入沉淀蛋白试剂之后的涡旋时间来说，2-5min是指2min至5min范围内的任一时间，比如，2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min以及5min。
针对离心转速来说，10000-15000rpm是指10000rpm至15000rpm范围内的任一转速，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm以及15000rpm。
针对加入沉淀蛋白试剂之后的离心时间来说，8-12min是指8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min以及12min。
针对第二上清液的离心时间来说，3-8min是指3min至8min范围内的任一时间，比如，3min、4min、5min、6min、7min以及8min。
本发明提供了他克莫司的检测方法，通过液质联用仪对含有不同浓度的他克莫司的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物[13C,2H4]-他克莫司，因此，基于各种浓度标准溶液中的他克莫司的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到他克莫司的标准曲线方程。通过向待处理样品内顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂，进行涡旋混匀并离心，即可得到能够检测的待测样品。利用液质联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中他克莫司的含量。由于通过蛋白沉淀即可完成对目标物的提纯，而无需加入硫酸锌水溶液，如此使得对待检测样品的前处理过程操作更加简单，同时减少前处理所需时间，因此能够缩短待测样品的检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的他克莫司的检测方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的标准溶液中的他克莫司和内标物的色谱图；
图3是本发明一实施例提供的待测样品中的他克莫司和内标物的色谱图；
图4是本发明一实施例提供的待测样品的进样量为5μL的色谱图；
图5是本发明一实施例提供的柱温18℃，流速0.2mL/min时的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的柱温18℃，流速0.3mL/min时的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的柱温18℃，流速0.4mL/min时的色谱图；
图8是本发明一实施例提供的柱温18℃，流速0.5mL/min时的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的柱温18℃，流速0.6mL/min时的色谱图；
图10是本发明一实施例提供的柱温25℃，流速0.5mL/min时的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的柱温35℃，流速0.5mL/min时的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的柱温45℃，流速0.5mL/min时的色谱图；
图13是本发明一实施例提供的柱温55℃，流速0.5mL/min时的色谱图；
图14是本发明一实施例提供的柱温60℃，流速0.5mL/min时的色谱图；
图15是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图16是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图17是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图18是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图19是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图20是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图21是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图22是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图23是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图24是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图25是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；
图26是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；
图27是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；
图28是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent Extend-C18的色谱图；
图29是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent poroshell EC C18的色谱图；
图30是本发明一实施例提供的色谱柱为SHIMADZU-SP-C18的色谱图；
图31是本发明一实施例提供的色谱柱为phenomenex Kinetex XB-C18的色谱图；
图32是本发明一实施例提供的待处理样品与沉淀蛋白试剂的体积比为1:20时的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，通常采用高效液相色谱质谱法对待测样品进行检测，待测样品采用子囊霉素作为内标物，但是子囊霉素也是一种大环内酯物，也具有免疫抑制作用，存在因联合使用导致定量不准的风险，影响待测样品检测的准确性，进而影响他克莫司的检测方法的实际应用和推广普及。
并且，对待测样品检测时Ultimate XB-C18色谱柱的柱温为65℃(HPLC-MS/MS法同时测定白血病患者全血环孢素A、他克莫司和西罗莫司水平[J].检验医学与临床,2010)，已超过该色谱柱所能承受的最高温度60℃，因此长期使用将损害该色谱柱，从而影响待测样品的检测准确性。
并且，待测样品的前处理过程中加入了破解液硫酸锌水溶液，从而增加了整体检测过程中所用的试剂种类，导致前处理过程较为复杂，前处理过程所需时间较长，从而导致待测样品中他克莫司整体的检测时间较长。
基于上述问题，本发明实施例提供了他克莫司的检测方法，如图1所示，包括：
步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有他克莫司和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
步骤102：利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中他克莫司的浓度和内标物的浓度，拟合他克莫司的标准曲线方程；
步骤104：对待处理样品内顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第一上清液作为待测样品；
步骤105：利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
步骤106：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中他克莫司的浓度。
在本发明实施例中，通过液质联用仪对含有不同浓度的他克莫司的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的他克莫司的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到他克莫司的标准曲线方程。通过向待处理样品内顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂，进行涡旋混匀并离心，即可得到能够检测的待测样品。利用液质联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中他克莫司的含量。由于通过蛋白沉淀即可完成对目标物的提纯，而无需加入硫酸锌水溶液，如此使得对待检测样品的前处理过程操作更加简单，同时减少前处理所需时间，因此能够缩短待测样品的检测时间。
下面以几个实施例对他克莫司的检测方法进行详细说明。
实施例1：制备系列浓度的标准溶液
(a)标准储备液的配制：
移取1000μg/mL的他克莫司标准品溶液，并用含有50％水的甲醇溶液作为稀释液进行稀释，并定容至容量瓶标线，得到10μg/mL标准储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为12个月。
(b)标准工作液的配制
取适量步骤(a)中的标准储备液，用含有50％水的甲醇溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有5-1000ng/mL他克莫司的标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月；
其中，不同浓度的标准工作液为含有他克莫司：5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的系列溶液。
(c)内标储备液的配制
精准称取1.0mg内标物[13C,2H4]-他克莫司标准品置于10mL容量瓶中，用含有50％水的甲醇溶液作为稀释液进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到100μg/mL内标储备液，并在-20℃条件下保存，有效期为6个月。
(d)内标工作液的配制
取30μL步骤(c)中内标储备液，用9970μL含有50％水的甲醇溶液作为稀释液进行稀释，得到300ng/mL含[13C,2H4]-他克莫司的内标工作液，并在-80℃保存，有效期为12个月。
(e)标准溶液的标定
分别移取步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液10μL置于1.5mL离心管中，向每个离心管中加入10μL的步骤(d)内标工作液，再分别向各个离心管中加入590μL含有50％水的甲醇溶液，混合制成七种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为2000rpm下涡旋混匀0.5min后即可作为标准溶液。
实施例2：拟合标准曲线方程
利用液质联用仪对实施例1中七种标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的他克莫司的标准溶液的色谱图。
从上述他克莫司的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中他克莫司和内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的他克莫司的峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述他克莫司标准工作液中的浓度与内标物的浓度作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。
上述检测条件包括：
色谱柱：Waters XBridge TM C18，填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为100mm；
采用梯度洗脱，洗脱流动相中的水相包括：含有0.1％甲酸和1mM乙酸铵的水溶液，有机相包括：甲醇溶液；
洗脱流动相中的有机相与水相的体积比包括：
0.00min：70％:30％；0.01min：100％:0％；1.50min：100％:0％；1.51min：70％:30％；2.00min：70％:30％；
柱温为40℃；流速为0.5mL/min；进样量：20μL；洗脱时间为2min。
质谱条件：液质联用仪中的质谱检测器为ESI(+)检测模式；
液质联用仪中的离子源参数为：加热气流速(L/min):8，雾化气流速(L/min):40，加热气温度(℃):350，毛细管电压(V):4000。
其中，液质联用仪中的质谱检测器离子对参数如下述表1所示：
表1
Figure BDA0002848261750000111
其中，Dewll为扫描时间，Fragmentor为碎裂电压，CE为碰撞电压，CAV：为线性加速电压。
需要说明的是，可按照处理待测样品时的前处理操作制备不同浓度的标准溶液，即，标准溶液中的涡旋转速和时间均与实施例3中待测样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。
实施例3：待测样品的前处理
3.1取待处理血液至少300μL，并置于EDTA抗凝管中冷藏保存至分析前备用，即为待处理样品。
3.2用移液枪移取10μL实施例1中的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤3.1中的待处理样品，在1000rpm的转速下涡旋混合0.5min后，加入沉淀蛋白试剂甲醇(即含有0％乙腈的甲醇溶液)500μL，在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在14000rpm的转速下高速离心5min后，移取300μL离心后的第二上清液并置于1.5mL离心管中，在14000rpm的转速下高速离心3-8min，取离心后的第一上清液即为待测样品。
实施例4：待测样品的检测
利用液质联用仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中他克莫司的色谱峰面积和待测样品中内标物的色谱峰面积，将待测样品中的他克莫司的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中他克莫司的浓度。
综上，采用待测样品的同位素作为内标物，不存在与子囊霉素联合使用而导致定量不准的风险，从而提高了待测样品的检测准确性。
实施例5：他克莫司的检测方法的线性关系和定量限
分别移取步骤(a)中七种不同浓度的他克莫司标准工作液10μL，分别向移取的每种浓度的他克莫司标准工作液中加入10μL步骤(b)中的内标工作液和590μL含有50％水的甲醇溶液，混匀后利用液质联用仪按照实施例2中的检测条件进行测定，其中，本实施例中按照浓度由低至高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的混合液对浓度低的混合液产生影响。然后以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明他克莫司的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：0.017ng/mL
(2)定量限(LOQ)：0.05ng/mL
(3)线性范围：他克莫司在0.08ng/mL到16.39ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9950。
由本实施例可知，他克莫司的检测限及定量限分别为0.017ng/mL和0.05ng/mL，灵敏度很高，对他克莫司含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。
实施例6：他克莫司的检测方法的回收率和精密度
取实施例1中他克莫司标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，他克莫司的回收率如表2。他克莫司在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为97.37％～101.06％，精密度为0.53％～2.01％。
表2
Figure BDA0002848261750000131
综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测血液中他克莫司的浓度，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
图2为实施例2中的标准溶液中的他克莫司的色谱图，图3为实施例3中的待测样品中的他克莫司的色谱图，其中，图2和图3中的他克莫司和内标物的保留时间一致。图2和图3中，位于上方为内标物[13C,2H4]-他克莫司的色谱图，位于下方的为他克莫司的色谱图。
其中，图2的横坐标的单位长度为0.2，图2中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图3的横坐标的单位长度为0.2，图3中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2×10。
由图2和图3可见，待测样品中的他克莫司的保留时间与其标准工作溶液一致，该方法以[13C,2H4]-他克莫司为内标物，他克莫司和内标物的保留时间均约为0.95min，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
实施例7：针对进样量的说明
图4对应的试验是与实施例3和4中的试验相对应的平行试验，区别为进样量不同。其中，图4为待测样品的色谱图，目标物的保留时间约为0.95min。
图4是待测样品的进样量为5μL时的色谱图，图4的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.2×10。
具体地，待测样品的进样量为5μL时的信噪比为12.0，可满足定量要求。
实施例8：针对流速和柱温的说明
图5至图14分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流速和柱温不同，图5至图14中，位于上方的均为内标物[13C,2H4]-他克莫司的色谱图，位于下方的均为他克莫司的色谱图。
图5为柱温18℃，流速0.2mL/min时的色谱图，图5的横坐标的单位长度为0.4，图5中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为2.0×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图6为柱温18℃，流速0.3mL/min时的色谱图，图6的横坐标的单位长度为0.2，图6中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图7为柱温18℃，流速0.4mL/min时的色谱图，图7的横坐标的单位长度为0.2，图7中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图8为柱温18℃，流速0.5mL/min时的色谱图，图8的横坐标的单位长度为0.2，图8中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2.0×102；
图9为柱温18℃，流速0.6mL/min时的色谱图，图9的横坐标的单位长度为0.2，图9中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图10为柱温25℃，流速0.5mL/min时的色谱图，图10的横坐标的单位长度为0.2，图10中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为2.0×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图11为柱温35℃，流速0.5mL/min时的色谱图，图11的横坐标的单位长度为0.2，图11中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图12为柱温45℃，流速0.5mL/min时的色谱图，图12的横坐标的单位长度为0.2，图12中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图13为柱温55℃，流速0.5mL/min时的色谱图，图13的横坐标的单位长度为0.2，图13中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图14为柱温60℃，流速0.5mL/min时的色谱图，图14的横坐标的单位长度为0.2，图14中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102。
通过图3、图5至图14可见，当流速低于0.4mL/min，柱温低于18℃时，他克莫司和内标物的保留时间均大于1.3min，这样会使得待测样品整体的检测时间过长，影响待测样品检测的时效性。
而当流速大于0.6mL/min，柱温大于60℃时，色谱柱的柱压会超过色谱柱所能承受的压力，当待测样品数量较多时，会对色谱柱造成不可逆的损伤，也会使得待测样品检测的准确性降低。并且，此时的柱温已超过色谱柱所能承受的温度，这样会对色谱柱中的填料造成不可逆的损伤，影响待测样品的检测效果。最重要的是，使得他克莫司的保留时间较小，使得他克莫司出峰过快，由于溶剂峰的保留时间通常在0.5min左右，他克莫司的色谱峰易受溶剂峰干扰，不利于识别待测样品。
综上，本发明对待测样品检测的流速在0.4-0.6mL/min区间，柱温在18-60℃区间，可以使得他克莫司的分析时间均在2.0min之内，缩短待测样品的整体检测时间，提高样品检测的时效性。
实施例9：针对洗脱流动相中的洗脱比例的说明
图15至图25的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为洗脱流动相中有机相与水相的体积比不同。其中，图15至图25的中位于上方的均为内标物[13C,2H4]-他克莫司的色谱图，位于下方的均为他克莫司的色谱图。
图15至图25示出了待测样品在不同梯度的洗脱流动相条件下的色谱图；
其中，图15中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：40％:60％；0.01min：100％:0％；1.50min：100％:0％；1.51min：40％:60％；2.00min：40％:60％；图15的横坐标的单位长度为0.2，图15中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102；
图16中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：50％:50％；0.01min：100％:0％；1.50min：100％:0％；1.51min：50％:50％；2.00min：50％:50％；图16的横坐标的单位长度为0.2，图16中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图17中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：60％:40％；0.01min：100％:0％；1.50min：100％:0％；1.51min：60％:40％；2.00min：60％:40％；图17的横坐标的单位长度为0.2，图17中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图18中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：80％:20％；0.01min：100％:0％；1.50min：100％:0％；1.51min：80％:20％；2.00min：80％:20％；图18的横坐标的单位长度为0.2，图18中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图19中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：90％:10％；0.01min：90％:10％；1.50min：90％:10％；1.51min：90％:10％；2.00min：90％:10％；图19的横坐标的单位长度为0.2，图19中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102；
图20中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：50％:50％；0.01min：85％:15％；1.50min：85％:15％；1.51min：50％:50％；2.00min：50％:50％；图20的横坐标的单位长度为0.2，图20中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图21中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：50％:50％；0.01min：90％:10％；1.50min：90％:10％；1.51min：50％:50％；2.00min：50％:50％；图21的横坐标的单位长度为0.2，图21中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图22中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：50％:50％；0.01min：95％:5％；1.50min：95％:5％；1.51min：50％:50％；2.00min：50％:50％；图22的横坐标的单位长度为0.2，图22中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图23中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：70％:30％；0.01min：80％:20％；1.50min：80％:20％；1.51min：70％:30％；2.00min：70％:30％；图23的横坐标的单位长度为0.2，图23中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102；
图24中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：70％:30％；0.01min：90％:10％；1.50min：90％:10％；1.51min：70％:30％；2.00min：70％:30％；图24的横坐标的单位长度为0.2，图24中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图25中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：70％:30％；0.01min：95％:5％；1.50min：95％:5％；1.51min：70％:30％；2.00min：70％:30％；图25的横坐标的单位长度为0.2，图25中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为2.0×102，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102。
通过图3、图15至图25可见，当0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比小于50％时，随着检测的待测样品数量的增加，会导致目标物的响应信号逐渐降低，影响待测样本的检测；当0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比大于90％时，他克莫司的保留时间小，出峰过早，容易产生基质效应。因此，选择0.00min时洗脱流动相中有机相与水相的体积比包括50％:50％-90％:10％。
当0.00min洗脱流动相中有机相的占比大于50％且小于90％，且0.01min时有机相的占比小于95％时，待测样品和内标物的色谱峰的峰型、峰宽均不符合测试需求，因此0.00min洗脱流动相中有机相的占比大于50％且小于90％时，需确保0.01min时有机相与水相的体积比为95％:5％-100％:0％。
当0.00min洗脱流动相中有机相的占比为90％，且0.01min时有机相与水相的体积比为90％:10％-100％:0％时，待测样品和内标物的色谱峰的峰型、峰宽均符合测试需求。
实施例10：针对洗脱流动相的说明
图26和图27分别对应的试验是实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为洗脱流动相中添加甲酸的不同。其中，图26和图27的中位于上方的均为内标物[13C,2H4]-他克莫司的色谱图，位于下方的均为他克莫司的色谱图。
图26是洗脱流动相中的水相为蒸馏水、有机相为甲醇溶液时的色谱图，其中，图26的横坐标的单位长度为0.2，图26中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为.02×10；
图27是洗脱流动相中的水相为含有0.2％甲酸和4mM乙酸铵的水溶液、有机相为含有0.1％甲酸的甲醇溶液时的色谱图，其中，图27的横坐标的单位长度为0.2，图27中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2×10。
通过图3、图26至图27可见，洗脱流动相中不添加甲酸、添加甲酸、添加缓冲盐、不添加缓冲盐时，待测样品和内标物的色谱峰的峰型、峰宽均符合测试需求。
实施例11：针对色谱柱的说明
图28至图31分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为色谱柱的不同。图28至图31中位于上方的均为内标物[13C,2H4]-他克莫司的色谱图，位于下方的均为他克莫司的色谱图。
图28是色谱柱为Agilent Extend-C18时的色谱图，其中，填料粒径3.5μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图28的横坐标的单位长度为0.2，图28中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图29是色谱柱为Agilent poroshell EC C18时的色谱图，其中，填料粒径2.7μm，内径为3.0mm，长度为50mm，图29的横坐标的单位长度为0.2，图29中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×102；
图30是色谱柱为SHIMADZU-SP-C18时的色谱图，其中，填料粒径2.7μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图30的横坐标的单位长度为0.2，图30中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2.0×102；
图31是色谱柱为phenomenex Kinetex XB-C18时的色谱图，其中，填料粒径2.6μm，内径为3.0mm，长度为50mm，图31的横坐标的单位长度为0.2，图31中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为2.0×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2.0×102。
通过图3、图28至图31可见，利用Waters XBridge TM C18、Agilent Extend-C18、Agilent poroshell EC C18、SHIMADZU-SP-C18以及phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱对待测样品进行检测得到的目标物的色谱峰未出现前沿和拖尾的情况，且峰宽也符合检测需求。
实施例12：针对沉淀蛋白试剂的体积的说明
图32对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为沉淀蛋白试剂的体积的不同。其中，图32为待测样品的色谱图，目标物的保留时间约为0.95min。
图32是待处理样品与沉淀蛋白试剂的体积比为1:20时的色谱图，其中，图32的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.5×10。
具体地，当待处理样品与沉淀蛋白试剂的体积比为1:20时，信噪比为14.4，可满足定量要求；当待处理样品与沉淀蛋白试剂的体积比小于1:20时，会出现溶剂效应，影响目标物色谱峰的峰型。
实施例13：针对前处理的说明
本申请例1：
(1)10μL内标工作液+100μL待处理样品，混合0.5min，得到混合液；
(2)加入500μL甲醇混合5min进行蛋白沉淀，并离心，得到第二上清液；
(3)移取300μL第二上清液进行离心即得到待测样品。
对比例1.1：(LC-MS/MS测定肝移植患者体内他克莫司和五酯胶囊主要成分的方法学建立及应用[J].中国现代应用药学,2016)
(1)10μL内标工作液+100μL待处理样品，混合得到混合液；
(2)加入200μL硫酸锌溶液(0.1M)混匀，再加入300μL甲醇混匀并静置10min，然后离心，得到上清液即为待测样品。
对比例1.2：(LC-MS/MS法测定Beagle犬全血中他克莫司的浓度[J].解放军药学学报,2015)
(1)加入内标工作液+100μL待处理样品，混合得到混合液；
(2)加入100μL硫酸锌溶液(0.05M)混匀后，在4℃的条件下离心，得到上清液即为待测样品。
具体地，分别根据对比例1.1、对比例1.2和本申请例1中的前处理方法对待测样本进行前处理，并按实施例2中的检测条件下对含有不同浓度目标物的样本进行检测，重复分析测定3次。其中，区别为前处理中加入硫酸锌溶液(对比例1.1、对比例1.2)或甲醇(本申请例1)后的静置时间的不同，以静置0min后混匀测得的目标物的浓度作为靶值，计算其他静置时间下所测得的目标物浓度的偏倚值，结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002848261750000191
通过表3可知，对比例1.1和对比例1.2的前处理中加入硫酸锌溶液后应立即(静置0min)对样本进行混匀，才可确保检测结果的准确性，否则随着静置时间的增加，对目标物的检测结果会逐渐降低，导致对目标物的检测准确性较差，因此对比例1.1和对比例1.2中的前处理条件均较为苛刻。但是本申请例1的前处理中加入甲醇后，静置0min、5min或10min后再混匀，均对检测结果的影响较小。因此，本申请实施例1的前处理方法更加简便易操作，且对目标物的检测准确性更高，使得本申请的他克莫司的检测方法更易于推广和普及。
本发明在简化前处理方式，节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了更好的结果。
对比例1.3：(LC-MS/MS法测定人全血中他克莫司的浓度及其在生物等效性试验中的应用[J])
(1)加入100μL内标工作液+400μL待处理样品，混合得到混合液；
(2)加入500μL乙腈(0.05M)混匀并离心，得到上清液即为待测样品。
具体地，样本1、2和3所对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为前处理过程的不同。对上述三个样本重复分析测定3次。其中，以采用本申请例1的前处理方式所测得的目标物的浓度作为靶值，计算采用对比例1.3的前处理方式所测得的目标物浓度的偏倚值，结果如表4所示。
表4
样本 对比例1.3 本申请例1 偏倚值
1 1.938ng/mL 2.593ng/mL -25.259％
2 2.714ng/mL 3.621ng/mL -25.041％
3 5.232ng/mL 6.898ng/mL -24.137％
通过表4可知，对比例1.3的前处理中加入乙腈进行蛋白沉淀所获得的检测结果较低，约为本申请例1的检测结果的75％，从而使得检测结果的准确性和灵敏度较低。
需要说明的是，图2至图32的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为离子信号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个〃····〃”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.他克莫司的检测方法，其特征在于，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有他克莫司和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中他克莫司的浓度和内标物的浓度，拟合他克莫司的标准曲线方程；
向待处理样品内顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第一上清液作为待测样品；
利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中他克莫司的浓度。
2.根据权利要求1所述的他克莫司的检测方法，其特征在于，
所述检测条件中的液相条件，包括：
洗脱流动相中的水相包括：含有0.1％-0.5％甲酸和0-10mM的缓冲盐的水溶液；
洗脱流动相中的有机相包括：含有0％-0.5％甲酸和0-1mM的缓冲盐的甲醇溶液；
柱温包括18-60℃；
流速包括0.4-0.6mL/min。
3.根据权利要求1所述的他克莫司的检测方法，其特征在于，
洗脱流动相中的有机相与水相的体积比包括：
0.00min：50％:50％-90％:10％；
0.01min：90％:10％-100％:0％；
1.50min：90％:10％-100％:0％；
1.51min：50％:50％-90％:10％；
2.00min：50％:50％-90％:10％。
4.根据权利要求1所述的他克莫司的检测方法，其特征在于，
所述检测条件中的质谱条件，包括：
所述液质联用仪中的质谱检测器为ESI(+)检测模式；
所述液质联用仪中的离子源参数为：加热气流速(L/min):8-12，雾化气流速(L/min):20-30，加热气温度(℃):300-350，毛细管电压(V):3000-4000。
5.根据权利要求1所述的他克莫司的检测方法，其特征在于，
所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中他克莫司的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中他克莫司的浓度与内标物的浓度的比值。
6.根据权利要求1所述的他克莫司的检测方法，其特征在于，
所述沉淀蛋白试剂包括：含有0％-91％乙腈的甲醇溶液。
7.根据权利要求1所述的他克莫司的检测方法，其特征在于，
所述待处理样品与所述沉淀蛋白试剂的体积比包括1:3-1:20。
8.根据权利要求1所述的他克莫司的检测方法，其特征在于，
所述向待处理样品内顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第一上清液作为待测样品，包括：
向所述待处理样品内顺次加入内标物，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合0.5-2min；
顺次加入沉淀蛋白试剂，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合2-5min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，移取离心后的第二上清液；
将所述第二上清液在10000-15000rpm的转速下高速离心3-8min，取离心后的第一上清液作为待测样品。
9.根据权利要求1至8中任一所述的他克莫司的检测方法，其特征在于，
所述内标物包括[13C,2H4]-他克莫司。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114878721A (zh) * 2022-06-07 2022-08-09 山东省食品药品检验研究院 一种同时检测化妆品中他克莫司和吡美莫司的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698448A (en) * 1988-12-02 1997-12-16 Soldin; Steven J. Immunosuppressive drug binding proteins and use
CN102141552A (zh) * 2010-01-29 2011-08-03 中国人民解放军第二炮兵总医院 一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备
US20140047906A1 (en) * 2010-10-29 2014-02-20 Cohesive Technologies Inc. Lc-ms configuration for purification and detection of analytes having a broad range of hydrophobicites
CN109884234A (zh) * 2019-04-08 2019-06-14 杭州同创医学检验实验室有限公司 一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698448A (en) * 1988-12-02 1997-12-16 Soldin; Steven J. Immunosuppressive drug binding proteins and use
CN102141552A (zh) * 2010-01-29 2011-08-03 中国人民解放军第二炮兵总医院 一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备
US20140047906A1 (en) * 2010-10-29 2014-02-20 Cohesive Technologies Inc. Lc-ms configuration for purification and detection of analytes having a broad range of hydrophobicites
CN109884234A (zh) * 2019-04-08 2019-06-14 杭州同创医学检验实验室有限公司 一种基于质谱技术的血液免疫抑制药物浓度定量检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KYUNGSOO PARK 等: "A Randomized, Open-Label, Two-Period, Crossover Bioavailability Study of Two Oral Formulations of Tacrolimus in Healthy Korean Adults", 《CLINICAL THERAPEUTICS》 *
UTTAM GARG 等: "Simultaneous Determination of Cyclosporine, Sirolimus, and Tacrolimus in Whole Blood Using Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry", 《 LC-MS IN DRUG ANALYSIS: METHODS AND PROTOCOLS》 *
位华: "五酯胶囊的药代动力学及与他克莫司相互作用研究", 《万方学位论文数据库》 *
孙春华等: "HPLC-MS/MS快速同时测定全血中3种免疫抑制剂的浓度", 《中国药学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114878721A (zh) * 2022-06-07 2022-08-09 山东省食品药品检验研究院 一种同时检测化妆品中他克莫司和吡美莫司的方法
CN114878721B (zh) * 2022-06-07 2024-02-27 山东省食品药品检验研究院 一种同时检测化妆品中他克莫司和吡美莫司的方法

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