CN112305135B - 硫利达嗪的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了硫利达嗪的检测方法，包括：制备具有硫利达嗪、内标物以及未含有硫利达嗪的空白样本的至少三种浓度的标准溶液，标准溶液中的内标物的量相同；利用高效液相色谱仪在检测条件下检测每一种标准溶液，获得标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中硫利达嗪的浓度和内标物的浓度，拟合硫利达嗪的标准曲线方程；取待处理样品离心后的第一上清液；向第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对第一上清液进行萃取，得到待测样品；利用高效液相色谱仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中硫利达嗪的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

硫利达嗪的检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及硫利达嗪的检测方法。

背景技术

硫利达嗪为吩噻嗪类含哌啶侧链的化合物，其作用与氯丙嗪相似，选择性作用于中脑边缘多巴胺系统。

目前，检测样品中硫利达嗪含量通常采用的方法为高效液相色谱法，然而现有的检测方法使用的有机溶剂多、前处理过程复杂，从而导致样品检测时间较长。

发明内容

本发明提供了硫利达嗪的检测方法，能够缩短样品检测时间。

为了解决上述问题，本发明实施例提供了硫利达嗪的检测方法，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有硫利达嗪、内标物以及未含有硫利达嗪的空白样本的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用高效液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中硫利达嗪的浓度和内标物的浓度，拟合硫利达嗪的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；

利用高效液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中硫利达嗪的浓度。

优选地，为了更准确地检测出待测样品中硫利达嗪的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为赛庚定。

具体地，系列浓度的标准溶液制备方式如下：

(1)标准储备液的配制

精确称取硫利达嗪标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。

(2)标准工作液的配制

取适量步骤(1)中标准储备液，用稀释液进行稀释混合，得到含有500-16000ng/mL硫利达嗪的系列标曲中间液作为标准工作液，并在-80℃条件下保存。

(3)内标储备液的配制

取内标物赛庚定标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶的标线，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。

(4)内标工作液的配制

取步骤(3)中内标储备液，用稀释液进行稀释，得到含赛庚定的内标工作液，并在-80℃保存。

(5)标准溶液的标定

分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液、步骤(4)中的内标工作液和未含有硫利达嗪的空白样本置于离心管中，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为2300-2700rpm下涡旋混匀1-2min后，顺次加入萃取剂，在2300-2700rpm的转速下涡旋混合8-12min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心3-7min，移取离心后的第二上清液，利用氮气将移取的第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在2300-2700rpm的转速下涡旋混合2-4min，取第三上清液作为标准溶液。

可以理解的是，空白样本包括未含有硫利达嗪的血清或血浆。

为了降低硫利达嗪和赛庚定的工作溶液的挥发性，所以稀释液为含有40-60％甲醇的水溶液。

优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：C18反相色谱柱；

洗脱流动相中的水相包括：含有三乙胺和乙酸铵的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；柱温为45-55℃；流速为0.2-0.4mL/min。

具体地，色谱柱包括Phenomenex公司的kinetex EVO C18色谱柱：长度为150mm、内径为2.1mm以及填料粒径为5μm。

具体地，水相中的缓冲盐浓度过大且在对目标物进行检测过程时，可能存在缓冲盐在色谱柱中析出的情况，已析出的缓冲盐会堵塞色谱柱，影响样品测试。其次，乙酸铵能够调整硫利达嗪的保留时间，三乙胺可以解决硫利达嗪色谱峰拖尾的问题，从而可以避免硫利达嗪色谱峰拖尾、保证硫利达嗪的保留时间，洗脱流动相中的水相包括：含有体积比为0.09-0.11％三乙胺和8-12mM乙酸铵的水溶液；

针对水相中的三乙胺来说，0.09-0.11％是指0.09％至0.11％中的任一值，比如，0.09％、0.1％以及0.11％。

针对水相中的乙酸铵来说，8-12mM是指8mM至12mM中的任一值，比如，8mM、9mM、10mM、11mM以及12mM。

比如，洗脱流动相中的水相为含有体积比为0.09％三乙胺和8mM乙酸铵的水溶液，有机相为乙腈溶液；

洗脱流动相中的水相为含有体积比为0.1％三乙胺和10mM乙酸铵的水溶液，有机相为乙腈溶液；

洗脱流动相中的水相为含有体积比为0.11％三乙胺和12mM乙酸铵的水溶液，有机相为乙腈溶液。

针对柱温来说，45-55℃是指45℃至55℃范围内的任一温度值，比如，45℃、47℃、50℃、52℃以及55℃。

针对流速来说，0.2-0.4mL/min是指0.2mL/min至0.4mL/min范围内的任一流速，比如，0.2mL/min、0.25mL/min、0.3mL/min、0.35mL/min以及0.4mL/min。

优选地，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为35:65-45:55。

针对洗脱流动相中的水相与有机相的体积比来说，35:65-45:55是指35:65至45:55范围内的任一比例，比如，35:65、39:61、40:60、41:59以及45:55。

比如，水相的体积占洗脱流动相体积的40％，有机相的体积占洗脱流动相体积的60％；水相的体积占洗脱流动相体积的45％，有机相的体积占洗脱流动相体积的55％。

具体地，当水相在洗脱流动相中体积占比小于35％时，硫利达嗪和内标物的分离度较差，内标物的色谱峰受杂质干扰；当水相在洗脱流动相中体积占比大于45％时，硫利达嗪和内标物的保留时间增大，会增大硫利达嗪的检测时间，因此，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为35:65-45:55。

优选地，所述检测条件中的紫外检测条件，包括：

紫外检测器的检测波长为295-305nm。

具体地，采用赛默飞公司的DAD-3000紫外检测器，选择吸光度检测模式；检测频率为5Hz；带宽为4nm。

针对检测波长来说，295-305nm是指295nm至305nm范围内的任一波长，比如，295nm、298nm、300nm、302nm以及305nm。

具体地，当检测波长低于295nm时，内标物的色谱峰会受杂质干扰；而当检测波长高于305nm时，内标物和硫利达嗪的响应值过低，影响待测样品的检测，因此，检测波长为295-305nm。

优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中硫利达嗪的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中硫利达嗪的浓度与内标物的浓度的比值。

具体地，若硫利达嗪的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的x值(即自变量)时，硫利达嗪的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)。

优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对加入内标物后的第一上清液进行萃取的萃取剂为正己烷。

优选地，所述向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，在2300-2700rpm的转速下涡旋混合1-2min；

顺次加入萃取剂，在2300-2700rpm的转速下涡旋混合8-12min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心3-7min，移取离心后的第二上清液；

利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在2300-2700rpm的转速下涡旋混合2-4min，取第三上清液作为待测样品。

具体地，在向第一上清液内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀，可在高转速下涡旋混合，再向混合后的第一上清液内加入萃取剂，并涡旋混匀，进行萃取，以通过萃取剂对混合后的第一上清液进行提纯，然后进行高速离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于利用萃取剂萃取后目标物的含量较低，因此为了便于检测，可利用氮气进行吹干，以对第二上清液进行浓缩，浓缩后再加入复溶液，并进行涡旋以使复溶液中的目标物分布均匀。

可以理解的是，第一上清液为血清或血浆，萃取选择的为上层有机相。

针对涡旋转速来说，2300-2700rpm是指2300rpm至2700rpm范围内的任一转速，比如，2300rpm、2400rpm、2500rpm、2600rpm以及2700rpm。

针对加入内标物之后的涡旋时间来说，1-2min是指，1min至2min范围内的任一时间，比如，1min、1.2min、1.5min、1.7min以及2min。

针对加入萃取剂之后的涡旋时间来说，8-12min是指，8min至12min范围内的任一时间，比如，8min、9min、10min、11min以及12min。

针对离心转速来说，10000-15000rpm是指10000rpm至15000rpm范围内的任一转速，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm以及15000rpm。

针对加入萃取剂之后的离心时间来说，3-7min是指3min、4min、5min、6min以及7min。

针对加入复溶液之后的涡旋时间来说，2-4min是指2min至4min范围内的任一时间，比如，2min、2.5min、3min、3.5min以及4min。

针对加入复溶液之后的离心时间来说，4-6min是指4min至6min范围内的任一时间，比如，4min、4.5min、5min、5.5min以及6min。

优选地，为了硫利达嗪和赛庚定更好的溶解且不易挥发，第二上清液吹干后加入的复溶液为含有40-60％甲醇的水溶液。

优选地，为了更好的溶解第二上清液，

所述第一上清液与所述复溶液的体积比为：1:0.8-1:1.2。

针对第一上清液和复溶液的体积比来说，1:0.8-1:1.2是指1:0.8至1:1.2范围内的任一比例，比如，1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1以及1:1.2。

具体地，当第一上清液的体积为100μL，那么复溶液的体积可以是80μL至120μL范围内的任一值。

本发明提供了硫利达嗪的检测方法，通过高效液相色谱仪对含有不同浓度的硫利达嗪的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的硫利达嗪的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到硫利达嗪的标准曲线方程。因此通过对待处理样品进行离心处理可以进行初步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。再向离心后的第一上清液中加入内标物，进行涡旋混匀，使得内标物均匀分布在第一上清液中，然后加入萃取剂进行萃取，进一步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。利用高效液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中硫利达嗪的含量。同时标准溶液中包括未含有硫利达嗪的空白样本，进一步保证检测结果的准确性。由于通过萃取即可完成对目标物的提纯，而无需复杂的前处理过程和过多的有机溶剂，因此可以缩短待测样品的检测时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的硫利达嗪的检测方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的待测样品中的硫利达嗪和内标物的色谱图；

图3是本发明一实施例提供的标准工作液中的硫利达嗪和内标物的色谱图；

图4是本发明一实施例提供的硫利达嗪线性关系图；

图5是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图6是本发明一实施例提供的柱温60℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图7是本发明一实施例提供的柱温50℃，流速0.18mL/min时的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的柱温50℃，流速0.44mL/min时的色谱图；

图9是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为30:70时的色谱图；

图10是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为50:50时的色谱图；

图11是本发明一实施例提供的紫外检测波长为263nm时的色谱图；

图12是本发明一实施例提供的紫外检测波长为350nm时的色谱图；

图13是本发明一实施例提供的萃取剂为环己烷时的色谱图；

图14是本发明一实施例提供的萃取剂为甲基叔丁醚时的色谱图；

图15是本发明一实施例提供的萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图；

图16是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters xbridge C18时的色谱图；

图17是本发明一实施例提供的色谱柱为Thermo acclaim 120 C18时的色谱图；

图18是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters atlantis dC18时的色谱图；

图19是本发明一实施例提供的内标物为维拉帕米时的色谱图；

图20是本发明一实施例提供的内标物为亚氨基芪时的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，通常在263nm检测波长下对待测样品的进行检测，但是，在该波长下检测时会出现响应杂质，从而影响目标物和内标物检测的准确性。

并且，待测样品的前处理通常使用1M NaOH及4mL 1.5％异戊醇-正庚烷的混合溶液进行萃取，而萃取剂是由多组分配制而成的，这样就增加了萃取剂的配置难度，增加目标物的检测难度。而且萃取剂的用量较多，这会增加目标物的检测成本，同时导致前处理过程所需时间较长，并且现有对比分析方法分析时间大于17.33min，这就增加了待测样品中硫利达嗪整体的检测时长。

基于上述问题，本发明实施例提供了硫利达嗪的检测方法，如图1所示，包括：

步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有硫利达嗪、内标物以及未含有硫利达嗪的空白样本的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

步骤102：利用高效液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中硫利达嗪的浓度和内标物的浓度，拟合硫利达嗪的标准曲线方程；

步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

步骤105：向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；

步骤106：利用高效液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中硫利达嗪的浓度。

在本发明实施例中，通过高效液相色谱仪对含有不同浓度的硫利达嗪的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的硫利达嗪的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到硫利达嗪的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理可以进行初步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。再向离心后的第一上清液中加入内标物，进行涡旋混匀，使得内标物均匀分布在第一上清液中，然后加入萃取剂进行萃取，进一步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。利用高效液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中硫利达嗪的含量。同时标准溶液中包括未含有硫利达嗪的空白样本，进一步保证检测结果的准确性。由于通过萃取即可完成对目标物的提纯，而无需复杂的前处理过程和过多的有机溶剂，因此可以缩短待测样品的检测时间。

在本发明实施例中，步骤101中的标准溶液通过实施例1中(e)标准溶液的标定方法制备获得。

下面以几个实施例对硫利达嗪的检测方法进行详细说明。

实施例1：制备系列浓度的标准溶液

(a)标准储备液的配制：

精确称取硫利达嗪标准品10mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存。

(b)标准工作液的配制

取适量步骤(a)中标准储备液，用甲醇:水＝1:1的稀释液进行稀释混合，得到含有500-16000ng/mL硫利达嗪的系列标曲混合中间液，并在-80℃条件下保存；

其中，其中不同浓度的标准工作液为含有硫利达嗪：500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL、8000ng/mL、16000ng/mL的系列溶液。

(c)内标储备液的配制

取赛庚定标准品5mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5mL，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。

(d)内标工作液的配制

取适量步骤(c)中内标储备液，用甲醇:水＝1:1的稀释液进行稀释，得到赛庚定10μg/mL的内标工作液，并在-80℃保存。

(e)标准溶液的标定

分别移取步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液5μL置于1.5mL离心管中，向每个离心管中加入5μL的步骤(d)内标工作液和95μL空白样本，混合制成七种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为2500rpm下涡旋混匀1min后，顺次加入1000μL正己烷萃取剂，在2500rpm的转速下涡旋混合10min，并在14000rpm的转速下高速离心5min，移取900μL离心后的第二上清液，利用氮气将移取的第二上清液吹干，顺次加入100μL含有50％的甲醇水溶液，在2500rpm的转速下涡旋混合3min，再在14000rpm的转速下高速离心5min，取第三上清液作为标准溶液。

具体地，取待处理未含有硫利达嗪的血液至少2mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取血清或血浆作为空白样本，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。

实施例2：拟合标准曲线方程

利用高效液相色谱仪对实施例1中七种标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的硫利达嗪的标准溶液的色谱图。

从上述硫利达嗪的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中硫利达嗪和内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的硫利达嗪的峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述硫利达嗪标准工作液中的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。

上述检测条件包括：

色谱柱：Phenomenex Kinetex EVO C18，填料粒径为5μm，内径为2.1mm，长度为150mm；

洗脱流动相中的水相包括：含有体积比为0.1％三乙胺和10mM乙酸铵的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；

洗脱时间为8min；柱温为50℃；流速为0.3mL/min；进样量为15μL。

紫外检测条件：

采用赛默飞DAD-3000紫外检测器，选择吸光度检测模式；检测波长为300nm；检测频率为5Hz；带宽为4nm。

具体地，在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。

需要说明的是，在制备不同浓度的标准溶液后，按照处理待处理样品时的前处理操作，对不同浓度的标准溶液进行前处理，即，标准溶液中的涡旋转速时间、加入萃取剂、加入复溶液后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间均与待处理样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。

实施例3：待测样品的处理

3.1取待处理血液至少2mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。

3.2用移液枪移取5μL实施例1中的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤3.1中的血清或血浆，在2500rpm的转速下涡旋混合1min后，加入1000μL正己烷，在2500rpm的转速下涡旋混合10min后，再在14000rpm的转速下高速离心5min，移取900μL离心后的上清液至新的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将该上清液吹干，移取100μL的含有50％甲醇的水溶液至上清吹干的1.5mL离心管中，在2500rpm的转速下涡旋混合3min后，在14000rpm的转速下高速离心5min，获得的上清液即为待测样品。

实施例4：待测样品的检测

利用高效液相色谱仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。

从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中硫利达嗪的色谱峰面积和待测样品中内标物的色谱峰面积，将待测样品中的硫利达嗪的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中硫利达嗪的浓度。

实施例5：针对本发明在标准溶液中加未含有硫利达嗪的空白样本的说明

在本发明实施例的前处理过程中，硫利达嗪和内标物赛庚啶在有无空白样本时的萃取率不同。由表1可知，未含有空白样本的实施例-1中内标物的色谱峰面积为0.6789，而含有空白样本的实施例-2中内标物的峰面积为0.4692，前处理过程对内标物的萃取有显著影响，萃取率为69.1％；同样，前处理过程对硫利达嗪的萃取有显著影响，萃取率为63.3％，硫利达嗪和内标物赛庚啶的萃取率不同，因此，为校正因硫利达嗪与内标物的萃取率不一致导致的定值误差，获取标准曲线可采用在前处理过程中加入空白样本的方式，以保证检测结果更准确。

表1

实施例6：针对样品前处理的说明

本方案例1：

(1)5μL内标工作液+100μL血清或血浆，混合1.0min，得到混合液；

(2)加入1000μL正己烷混合10min进行萃取，离心，得到上清液；

(3)取上清液900μL，氮气吹干；

(4)加100μL含有50％甲醇的水溶液复溶，混匀，得上清液为待测样品。

对比例1：(反相HPLC法测定血清中硫利达嗪浓度[J].上海精神医学,1995,03:47-49)

(1)在500μL血液中，顺次加入0.49nmol内标物、400μLNaOH水溶液(1.0M)、4000μL萃取剂(含1.5％异戊醇的正庚烷)混合2min进行萃取，离心，得到上清液；

(3)取上清液3500μL，在60℃水浴用氮气液挥干；

(4)加100μL(含有0.3％四甲基乙二胺和70％甲醇的水溶液)复溶，混匀，得上清液为待测样本。

从本方案例1和对比例1可以看出，本发明的样品使用量仅为对比例样本使用量的20％，更加符合科学伦理道德标准，使得待测人员依从性更高；采用血液样本加含有异戊醇的正庚烷进行萃取，再加复溶的前处理方式，相较于对比例1中自行配置的萃取剂和自行配置的复溶液，本发明节省了各种萃取剂和复溶液的配置时间，减少了试剂配制过程的误差，使用有机溶剂量少，成本更低，对环境更友好，并且避免使用刺激性毒性大的有机试剂。

实施例7：用于说明检测条件的说明

本申请例2：

(1)色谱柱：Phenomenex Kinetex EVO C18色谱柱；

(2)洗脱流动相的有机相为乙腈溶液，水相为含有0.1％三乙胺和10mM乙酸铵的水溶液；

(3)流速：0.3mL/min，分析时间8min。

对比例2：(反相HPLC法测定血清中硫利达嗪浓度[J].上海精神医学,1995,03:47-49)

(1)色谱柱：上海科学仪器厂的YWG-eC18；

(2)流动相组成为甲醇：水的体积比为70:30，并加入体积比为0.3％四甲基乙二胺；

(3)流速：1.0mL/min，分析时间大于17.33min。

详见图2，图2为本申请待测样品中硫利达嗪和内标物的色谱图，其中，图2的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.25。从本申请例2可以看出，硫利达嗪的保留时间约为6.3min，内标物的保留时间约为3.8min，其中，本发明的样本分析时间为8min，为对比例2的46％，减少了分析时间及流动相等试剂的消耗，降低成本，同时降低了不同人员配制流动相对实验结果带来差异的发生率。

本发明在简化前处理方式，节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了相同甚至更好的结果。

实施例8：硫利达嗪的检测方法的线性关系和定量限

选择低浓度的标准工作液，采用未含硫利达嗪的血清或血浆的空白样本将上述低浓度的标准工作液进行不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的样本，加入5μL内标工作液，按本实施例1中(e)标准溶液的标定方法中的前处理及实施例2中的检测条件进行测定，硫利达嗪的检测限和定量限如下述所示，加标浓度及信噪比见下述表2所示。

表2

加标浓度(ng/mL)	8.0	10.0	13.0	15.0	16.0
						信噪比	5.4	8.1	11.8	14.3	17.7

其中，以信噪比＝10作为定量限，此处以最低信噪比作为检测限。

硫利达嗪

(1)检测限(LOD)：8ng/mL。

(2)定量限(LOQ)：13ng/mL。

由本实施例可知，硫利达嗪的检测限及定量限分别为8ng/mL和13ng/mL，相较于对比例2中的最小检测限0.04nmol/mL(即14.8ng/mL)，灵敏度更高，对硫利达嗪含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例9：线性方程的获得

将实施例1中七种不同浓度的标准工作液进行高效液相色谱仪按照实施例2中的检测条件进行测定，得到各浓度硫利达嗪及内标物的色谱图，其中，标准工作液中的硫利达嗪和硫利达嗪内标的色谱图如图3所示，硫利达嗪的保留时间约为6.3min，内标赛庚定的保留时间约为3.8min，其中，图3的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.25。

确定各色谱峰峰面积，以标准品色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，标准工作液浓度与混合内标工作液中的内标物浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标，但因内标物浓度为10μg/mL，故将标准工作液浓度作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a*x2+b，并且得系数c；线性方程的测定结果见表3，线性方程图见图4。

表3

检测指标	线性范围	线性方程	相关系数	加权
					硫利达嗪-某实施例1	25-800ng/mL	Y＝0.2755X-0.9632	0.9982	1/X<sup>2</sup>

表3为一次实施例中的线性关系数据，由表3可知，硫利达嗪在25-800ng/mL的线性范围内，相关系数R²＞0.9900，线性关系良好。

实施例10：硫利达嗪的检测方法的回收率和精密度

取实施例1中硫利达嗪标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，硫利达嗪的回收率和精密度如表4。硫利达嗪在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为101.3％～102.0％，精密度为0.33％～3.65％。

表4 硫利达嗪加样回收率

综合上述验证试验，本实施例的回收率、检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测血液中的硫利达嗪，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

由图2和图3可见，待测样品中的硫利达嗪的保留时间与其标准工作溶液一致，该方法以赛庚定为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

实施例11：针对流速和柱温的说明

图5至图8分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流速和柱温不同。图5至图8中的横坐标的单位长度均为0.25，纵坐标的单位长度均为0.25，图5中保留时间约为6.9min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为4.0min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰；图6中保留时间约为5.7min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为3.6min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰；图7中保留时间约为10.3min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为6.3min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰；图8中保留时间约为1.9min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为3.2min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰。

图5为柱温40℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图6为柱温60℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图7为柱温50℃，流速0.18mL/min时的色谱图；

图8为柱温50℃，流速0.44mL/min时的色谱图。

通过图5至图8可见，流速在0.3mL/min，柱温低于45℃时，则会导致硫利达嗪和内标物的出峰时间延后，保留时间均增大；当柱温高于55℃时，虽然硫利达嗪和内标物的出峰时间稍有提前，峰形也无明显变化，但该温度接近色谱柱使用温度极限，会影响色谱柱寿命，不宜长期在此条件下应用。

因此，对于硫利达嗪和内标物检测时的柱温范围设置在45℃至55℃，以使在较温和的色谱分析条件的前提下，使得目标物的保留时间相对最短。

通过图5至图8可见，由于流速小于0.2mL/min会使得硫利达嗪和内标物的保留时间增大，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的时效性。而流速大于0.4mL/min虽然会使硫利达嗪和内标物的保留时间减少，但是会导致内标物与杂质的分离率变差，影响待测样品测试结果的准确性。

实施例12：针对流动相的说明

图9和图10分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流动相中的水相与有机相的体积比不同，图9和图10中的横坐标的单位长度均为0.25，纵坐标的单位长度均为0.25，图9中保留时间约为3.5min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为2.5min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰；图10中保留时间约为13.4min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为7.0min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰。

图9是洗脱流动相中水相与有机相体积比为30:70时的色谱图；

图10是洗脱流动相中水相与有机相体积比为50:50时的色谱图。

通过图9和图10可见，水相在洗脱流动相体积占比小于35％时，会导致硫利达嗪和内标物的分离度变差、内标物的色谱峰受到杂质干扰，影响待测样品的测试准确性，而水相在流动相中体积占比大于45％，会使硫利达嗪和内标物的保留时间增大，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的时效性。

实施例13：针对波长的说明

图11和图12分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为紫外检测条件中的检测波长不同，图11中的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为1.0，图12中的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.25，图11和图12中保留时间约为6.3min处的色谱峰均为硫利达嗪标准品的色谱峰，图11中保留时间约为3.8min处的色谱峰为内标物标准品的色谱峰。

图11是紫外检测波长为263nm时的色谱图；

图12是紫外检测波长为350nm时的色谱图。

通过图11和图12可见，在紫外检测的检测波长为263nm时，会因检测波长较小出现杂质干扰现象，影响待测样品的检测准确性；而在紫外检测的检测波长为350nm时，会因检测波长过高导致内标物和硫利达嗪的响应值下降，影响待测样品的检测精度。

实施例14：针对萃取剂的说明

图13至图15分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为萃取剂的不同，图13至图15中的横坐标的单位长度均为0.25，纵坐标的单位长度均为0.25，图13至图15中保留时间约为6.3min的色谱峰均为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为3.8min的色谱峰均为内标物标准品的色谱峰。

图13是萃取剂为环己烷时的色谱图；

图14是萃取剂为甲基叔丁醚时的色谱图；

图15是萃取剂为乙酸乙酯时的色谱图。

通过图13至图15可见，萃取剂为环己烷时，内标物的色谱峰受到杂质干扰，影响待测样品的测试准确性；萃取剂为甲基叔丁基醚和乙酸乙酯时，硫利达嗪的萃取率较低，会影响待测样品的检测准确性。

实施例15：针对色谱柱的说明

图16至图18分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为C18反相色谱柱的不同，图16中的横坐标的单位长度为0.25，纵坐标的单位长度为0.25，图17中的横坐标的单位长度为1.0，纵坐标的单位长度为0.25，图18中的横坐标的单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.25。图16中保留时间约为7.6min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为4.5min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰；图17中保留时间约为28.9min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为16.2min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰；图18中保留时间约为16.7min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为11.6min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰。

图16是色谱柱为Waters xbridge C18(长度为150mm、内径为2.1mm以及填料粒径为3.5μm)时的色谱图；

图17是色谱柱为Thermo acclaim 120 C18(长度为150mm、内径为3mm以及填料粒径为3μm)时的色谱图；

图18是色谱柱为Waters atlantis dC18(长度为150mm、内径为2.1mm以及填料粒径为3μm)时的色谱图。

通过图16至图18可见，色谱柱为Waters xbridge C18、Thermo acclaim 120 C18和Waters atlantis dC18对于目标物色谱峰的峰形较差，且硫利达嗪和内标物的保留时间较长，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的时效性。

实施例16：针对内标物的说明

图19和图20分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为内标物的不同。图19和图20中的横坐标的单位长度均为0.25，纵坐标的单位长度均为0.25。图19保留时间约为6.3min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为3.1min之间的色谱峰为内标物标准品的色谱峰；图20中保留时间约为6.3min的色谱峰为硫利达嗪标准品的色谱峰，保留时间约为2.4min的色谱峰为内标物标准品的色谱峰。

图19是内标物为维拉帕米时的色谱图；

图20是内标物为亚氨基芪时的色谱图。

通过图19和图20可见，内标物为维拉帕米和亚氨基芪时，内标物的色谱峰均受到杂质干扰，影响待测样品的测试准确性。

需要说明的是，图2和图20的横坐标均为采集时间，纵坐标均为信号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.硫利达嗪的检测方法，其特征在于，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有硫利达嗪、内标物以及未含有硫利达嗪的空白样本的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用高效液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中硫利达嗪的浓度和内标物的浓度，拟合硫利达嗪的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；

利用高效液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中硫利达嗪的浓度；

第一上清液为血清或血浆；

所述检测条件中的液相条件，包括：

C18反相色谱柱；

洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为35:65 -45:55；

洗脱流动相中的水相包括：含有三乙胺和乙酸铵的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；

柱温为45-55℃；

流速为0.2-0.4 mL/min；

所述向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，在2300-2700 rpm的转速下涡旋混合1-2 min；

顺次加入萃取剂，在2300-2700 rpm的转速下涡旋混合8-12 min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心3-7 min，移取离心后的第二上清液；

利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在2300-2700 rpm的转速下涡旋混合2-4 min，并在10000-15000 rpm的转速下离心4-6 min，取第三上清液作为待测样品；

所述萃取剂为正己烷；

所述内标物为赛庚定。

2.根据权利要求1所述的硫利达嗪的检测方法，其特征在于，

所述检测条件中的紫外检测条件，包括：

紫外检测器的检测波长为295-305 nm。

3.根据权利要求1所述的硫利达嗪的检测方法，其特征在于，

所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中硫利达嗪的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中硫利达嗪的浓度与内标物的浓度的比值。

4.根据权利要求1所述的硫利达嗪的检测方法，其特征在于，

所述复溶液包括：含有40-60%甲醇的水溶液。

5.根据权利要求1所述的硫利达嗪的检测方法，其特征在于，

所述第一上清液与所述复溶液的体积比为：1:0.8-1:1.2。

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