CN112697921B

CN112697921B - 马普替林的检测方法

Info

Publication number: CN112697921B
Application number: CN202011549454.6A
Authority: CN
Inventors: 赵金宝; 贾永娟; 倪君君
Original assignee: Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Current assignee: Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112697921A

Abstract

本发明提供了马普替林的检测方法，包括：制备至少三种浓度具有马普替林和内标物的标准溶液；利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每种标准溶液，获得每一种标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中马普替林的浓度和内标物的浓度，拟合马普替林的标准曲线方程；对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；向第一上清液内加入内标物和蛋白沉淀试剂，涡旋混匀后进行蛋白沉淀，得到待测样品；利用液相色谱仪在检测条件下检测待测样品，获得第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中马普替林的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

马普替林的检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及马普替林的检测方法。

背景技术

马普替林，化学名称为N-甲基-9,10-桥亚乙基蒽-9(10H)-丙胺，白色或类白色结晶性粉末，易溶于甲醇和氯仿，微溶于水，几乎不溶于异辛烷。

目前，检测样品中马普替林含量通常采用的方法为高效液相色谱法。而现有的高效液相色谱法检测马普替林通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，包括通过吹干以及加复溶液等复杂操作，耗费时间较多，同时需要长时间的色谱分离以及清洗再平衡过程从而导致样品检测时间较长。

发明内容

本发明提供了马普替林的检测方法，能够缩短样品检测时间。

为了解决上述问题，本发明实施例提供了马普替林的检测方法，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有马普替林和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的马普替林的浓度和内标物的浓度，拟合马普替林的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品；

利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中马普替林的浓度。

具体地，为了降低马普替林的标准曲线方程的计算难度，同时，为了降低标准溶液的制备难度，各种浓度的标准溶液中的内标物的量相同。

优选地，为了更准确地检测出待测样品中马普替林的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为维拉帕米。

需要说明的是，第一上清液包括血清或血浆，蛋白沉淀后选择为上层有机相。

具体地，可以通过下述步骤制备标准溶液：

(1)标准储备液的配制

精确称取马普替林标准品置于容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于容量瓶的标线，得到标准储备液，并于-80℃条件下保存。

(2)标准工作液的配制

取适量步骤(1)中的标准储备液，用含有50％-90％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有300-3600ng/mL马普替林的标准工作液，并在-80℃条件下保存。

(3)内标储备液的配制

精确称内标物维拉帕米标准品置于容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到内标储备液，并于-80℃条件下保存。

(4)内标工作液的配制

移取适量步骤(3)中的内标储备液，用稀释液进行稀释，得到含有维拉帕米的内标工作液，并于-80℃条件下保存。

(5)标准溶液的标定

移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液和步骤(4)中的内标工作液置于离心管中，分别向各个离心管中顺次加入纯水和蛋白沉淀试剂，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速1000-2500rpm下涡旋混匀1-2min后，即可得到至少三种不同浓度的标准溶液。

为了保证马普替林和维拉帕米充分溶解，选择甲醇进行溶解；同时为了降低马普替林标准工作液和维拉帕米内标工作液反复使用过程中的挥发性，确保标准工作液和内标工作液的稳定性，所以稀释液为含有50％-90％甲醇的水溶液。

优选地，所述检测条件中的液相条件包括：洗脱流动相中的水相包括：含有30-50mM乙酸铵、0.1％-0.3％三乙胺和0.05％-0.1％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；

柱温包括30-50℃；流速包括0.6-1.1mL/min。

具体地，色谱柱为Acclaim TM120 C18色谱柱，长度为150mm、内径为3.0mm以及填料粒径为3μm。

针对水相中的乙酸铵来说，30-50mM是指30mM至50mM范围内的任一值，比如，水相中含有30mM、35mM、40mM、45mM以及50mM的乙酸铵。

针对水相中的三乙胺来说，0.1％-0.3％是指0.1％至0.3％范围内的任一值，比如，水相中含有0.1％、0.15％、0.2％、0.25％以及0.3％的三乙胺。

针对水相中的甲酸来说，0.05％-0.1％是指0.05％至0.1％范围内的任一值，比如，水相中含有0.05％、0.06％、0.07％、0.075％、0.08％、0.09％以及0.1％的甲酸。

比如，洗脱流动相中的水相包括：含有40mM乙酸铵、0.2％三乙胺和0.075％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液。

具体地，水相中的乙酸铵浓度过大且在对目标物进行检测时，可能存在乙酸铵在色谱柱中析出的情况，已析出的乙酸铵会堵塞色谱柱，影响样品测试。因此，洗脱流动相中的水相包括：含有30-50mM乙酸铵。

针对柱温来说，30-50℃是指30℃至50℃范围内的任意值，比如，30℃、35℃、40℃、45℃以及50℃。

针对流速来说，0.6-1.1mL/min是指0.6mL/min至1.1mL/min范围内的任意值，比如，0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min以及1.1mL/min。

优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：

采用双泵双柱检测模式，其中，

所述双泵双柱检测模式包括：主泵、副泵和两个色谱柱；

所述主泵和所述两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比为：40％:60％-48％:52％；

所述副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗。

针对主泵采用等度洗脱时洗脱流动相中的有机相与水相的体积比来说，40％:60％-48％:52％是指40％:60％至48％:52％范围内的任一比例，比如，40％:60％、41％:59％、42％:58％、43％:57％、44％:56％、45％:55％、46％:54％、47％:53％以及48％:52％。

比如，有机相的体积占洗脱流动相体积的42％，水相的体积占洗脱流动相体积的58％；有机相的体积占洗脱流动相体积的45％，水相的体积占洗脱流动相体积的55％。

具体地，在主泵采用等度洗脱进行检测时，当有机相在洗脱流动相中体积占比小于40％时，马普替林和内标物的保留时间增大，会增大待测样品的检测时间；当有机相在洗脱流动相中体积占比大于48％时，马普替林的色谱峰受杂质干扰在峰前出现前沿峰，影响待测样品的检测准确性。因此，主泵洗脱流动相中的有机相与水相的体积比为40％:60％-48％:52％。

优选地，

所述副泵采用梯度洗脱，洗脱流动相中的所述有机相与所述水相的体积比为：

0.00min：90％:10％-100％:0％；

1.00min：90％:10％-100％:0％；

1.01min：40％:60％-48％:52％；

3.00min：40％:60％-48％:52％。

针对副泵采用梯度洗脱时洗脱流动相中的有机相与水相在0.00min和1.00min的体积比，90％:10％-100％:0％是指90％:10％至100％:0％范围内的任一比例，比如，90％:10％、92％:8％、94％:6％、96％:4％、98％:2％以及100％:0％。

针对副泵采用梯度洗脱时洗脱流动相中的有机相与水相在1.01min和3.00min的体积比，40％:60％-48％:52％是指40％:60％至48％:52％范围内的任一比例，比如，40％:60％、41％:59％、42％:58％、43％:57％、44％:56％、45％:55％、46％:54％、47％:53％以及48％:52％。

具体地，在副泵采用梯度洗脱进行清洗时，为了保证去除残留的目标物杂质，在0.00min和1.00min时选择洗脱流动相中有机相与水相的体积比为：90％:10％-100％:0％；为了平衡色谱柱，在1.01min和3.00min时选择洗脱流动相中有机相与水相的体积比为：40％:60％-48％:52％。

例如，在副泵采用梯度洗脱进行清洗时，当1.00min有机相与水相的比例为100％:0％，1.01min有机相与水相的比例为45％:55％时，那么在1.00min至1.01min时间段内，有机相由占比100％逐渐降低至45％，水相则由占比0％逐渐增加至55％。

由于有机相与水相在洗脱流动相中占比的总和为1，因此，当有机相在洗脱流动相中的占比降低时，水相在洗脱流动相中的占比则相应增加。

优选地，所述检测条件中的荧光检测条件，包括：

激发波长：215-235nm；发射波长：280-300nm。

针对荧光检测条件中的激发波长来说，215-235nm是指215nm至235nm范围内的任意值，比如，激发波长可以为215nm、220nm、225nm、230nm以及235nm。

针对荧光检测条件中的发射波长来说，280-300nm是指280nm至300nm范围内的任意值，比如，发射波长可以为280nm、285nm、290nm、295nm以及300nm。

具体地，当荧光检测条件中的激发波长低于215nm、发射波长低于280nm时，马普替林的响应值下降，会影响对待检测样品的检测灵敏度；同样在荧光检测条件中的激发波长大于235nm、发射波长大于300nm时，马普替林的响应值也会下降，影响对待测样品的检测灵敏度。因此，激发波长：215-235nm；发射波长：280-300nm。

优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：马普替林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及马普替林的浓度与内标物的浓度的比值。

可以理解的是，当第一检测结果中的马普替林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y(即因变量)时，标准溶液中的马普替林的浓度与所述标准溶液中的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x(即自变量)。

若第一检测结果中的马普替林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的横坐标x(即自变量)时，标准溶液中马普替林的浓度与标准溶液中的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的纵坐标y(即因变量)。

优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，所述蛋白沉淀试剂包括：乙腈、甲醇和乙醇中的至少一种。

优选地，为了更好地去除杂质，所述第一上清液与所述蛋白沉淀试剂的体积比为1:3-1:20。

针对第一上清液与蛋白沉淀试剂的体积比来说，1:3-1:20是指1:3至1:20范围内的任一比例，比如，1:3、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18以及1:20。

比如，第一上清液的体积为100μL时，蛋白沉淀试剂可以是300μL至2000μL范围内的任一体积。

优选地，所述向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入蛋白沉淀试剂，在1000-2500rpm的转速下涡旋混合3-8min，并在10000-14000rpm的转速下离心5-15min，移取离心后的第二上清液作为待测样品。

具体地，在向第一上清液内加入内标物和蛋白沉淀试剂，并涡旋混匀，进行蛋白沉淀，以通过蛋白沉淀试剂对混合后的第一上清液进行提纯，然后进行离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。需要说明的是，蛋白沉淀后选择为上层有机相。

针对涡旋转速来说，1000-2500rpm是指1000rpm至2500rpm范围内的任意值，比如，1000rpm、1200rpm、1400rpm、1600rpm、1800rpm、2000rpm、2200rpm、2400rpm以及2500rpm。

针对涡旋的时间来说，3-8min是指3min至8min范围内的任一时间，比如，3min、4min、5min、6min、7min以及8min。

针对离心转速来说，10000-14000rpm是指10000rpm至14000rpm范围内的任意值，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm以及14000rpm。

针对离心的时间来说，5-15min是指5min至15min范围内的任一时间，比如，5min、6min、8min、10min、12min、14min以及15min。

本发明提供了马普替林的检测方法，通过液相色谱仪对含有不同浓度的马普替林的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的马普替林的浓度、内标物的浓度和多个第一检测结果拟合分别得到对应马普替林的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得到离心后的血清或血浆，顺次加入内标物和蛋白沉淀试剂进行蛋白沉淀，可以降低杂质对待测样品的干扰，得到能够进行检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下对待测样品进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中马普替林的含量。由于通过蛋白沉淀即可完成对目标物的提纯，而无需通过吹干以及加复溶液的方式便可完成检测，因此能够缩短待测样品的检测时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的马普替林的检测方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的待测样品中的马普替林和内标物的色谱图；

图3是本发明一实施例提供的标准溶液中的马普替林和内标物的色谱图；

图4是本发明一实施例提供的马普替林的线性关系图；

图5是本发明一实施例提供的流速0.6mL/min、柱温40℃下待测样品的色谱图；

图6是本发明一实施例提供的流速0.8mL/min、柱温40℃下待测样品的色谱图；

图7是本发明一实施例提供的流速1.2mL/min、柱温40℃下待测样品的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的流速1.0mL/min、柱温30℃下待测样品的色谱图；

图9是本发明一实施例提供的流速1.0mL/min、柱温50℃下待测样品的色谱图；

图10是本发明一实施例提供的蛋白沉淀试剂为甲醇时的色谱图；

图11是本发明一实施例提供的蛋白沉淀试剂为乙醇时的色谱图；

图12是本发明一实施例提供的洗脱流动相中有机相与水相的体积比为40％:60％时的色谱图；

图13是本发明一实施例提供的洗脱流动相中有机相与水相的体积比为50％:50％时的色谱图；

图14是本发明一实施例提供的色谱柱为Kinetex F5的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，检测待测样品中马普替林通常采用高效液相色谱法，待测样品采用奥沙西泮作为内标物，但是奥沙西泮与马普替林联合使用会导致定量不准，影响待测样品检测的准确性。

并且，待测样品采用单一色谱柱进行检测，需要长时间的色谱分离以及清洗再平衡过程，从而使得整体分析时间较长。

并且，采用标准溶液测定标准曲线方程的过程中还需要加入空白血浆，待测样品的前处理还需要进行吹干和加入复溶液，这样就增加了操作的复杂性，增加了前处理过程所需的时间，从而导致待测样品中马普替林的整体检测时间较长。

基于上述问题，本发明实施例提供了马普替林的检测方法，如图1所示，包括：

步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有马普替林和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

步骤102：利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的马普替林和内标物的浓度，拟合马普替林的标准曲线方程；

步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

步骤105：向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品；

步骤106：利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中马普替林的浓度。

在本发明实施例中，通过液相色谱仪对含有不同浓度的马普替林的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的马普替林的浓度、内标物的浓度和多个第一检测结果拟合分别得到对应马普替林的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得到离心后的血清或血浆，顺次加入内标物和蛋白沉淀试剂进行蛋白沉淀进行蛋白沉淀，降低杂质对待测样品的干扰，得到能够进行检测的待测样品。利用液相色谱仪在与标准溶液相同的检测条件下对待测样品进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中马普替林的含量。由于通过蛋白沉淀即可完成对目标物的提纯，而无需通过吹干以及加复溶液的方式便可完成检测，因此能够缩短待测样品的检测时间。

下面通过几个实施例对马普替林的检测方法进行详细说明。

实施例1：制备系列浓度的标准溶液

(a)标准储备液的配制

精确称取马普替林标准品0.5mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于容量瓶的标线，得到含有100μg/mL马普替林的标准储备液，并在-80℃条件下保存。

(b)标准工作液的配制

取适量步骤(a)中的标准储备液，用含有70％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有300-3600ng/mL马普替林的标准工作液，并在-80℃条件下保存；

其中，不同浓度的标准工作液为含有马普替林：300ng/mL、600ng/mL、900ng/mL、1200ng/mL、1800ng/mL、2400ng/mL、3600ng/mL的系列溶液。

(c)内标储备液的配制

精确称内标物维拉帕米标准品0.5mg置于5mL容量瓶中，用甲醇进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到含有100μg/mL维拉帕米的内标储备液，并于-80℃条件下保存。

(d)内标工作液的配制：

移取适量步骤(c)中的内标储备液，用稀释液进行稀释，得到含有3μg/mL维拉帕米的内标工作液，并于-80℃条件下保存。

(e)标准溶液的标定

分别移取上述步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液10μL分别置于1.5mL离心管中，向离心管中分别加入步骤(d)中的内标工作液10μL和90μL纯水，混合制成七种不同浓度的混合溶液，向上述混合溶液中分别加入300μL蛋白沉淀试剂(乙腈)，并在转速2500rpm下涡旋混匀1min后，得到七种不同浓度的标准溶液。

需要说明的是，可按照处理待测样品时的前处理操作，对不同浓度的标准溶液进行前处理，即，标准溶液中的涡旋转速、蛋白沉淀试剂均与待测样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。

需要说明的是，本实施例中无需加入未含有马普替林的空白样本，在简化前处理方式，节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了相同甚至更好的结果。

实施例2：拟合标准曲线方程

利用液相色谱仪对实施例1中七种浓度的标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的马普替林的标准溶液的色谱图。

从上述马普替林的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中马普替林和内标物分别对应的色谱峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的马普替林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述标准溶液中的马普替林的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性归回，拟合得到标准曲线方程y1＝a*x1+b，其中，a和b为权重系数，a为标准曲线方程的斜率，b为标准曲线方程的截距。

上述检测条件包括：

色谱柱：Acclaim TM120 C18，(色谱柱内径3.0mm×柱长150mm、填料粒径3μm)。

洗脱流动相中的水相包括含有40mM乙酸铵、0.2％三乙胺和0.075％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；

采用双泵双柱检测模式，主泵和两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比为45％:55％；副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗时采用梯度洗脱，洗脱流动相中有机相与水相的体积比为：0.00min：100％:0％；1.00min：100％:0％；1.01min：45％:55％；3.00min：42％:55％。

柱温为40℃，流速为1.0mL/min，待测样品的进样量为10μL，分析时间为3min。

检测条件中的荧光检测条件：

激发波长：225nm；发射波长：290nm。

本实施例中采用的液相色谱仪包括主泵、副泵、自动进样器、柱温箱、检测器和两个相同型号的色谱柱。柱温箱中包括两个六通切换阀：左阀和右阀，主泵用于对待测样品进行检测，副泵用于在待测样品检测后清洗色谱柱。主泵与自动进样器相连接，左阀连接自动进样器与副泵，右阀连接检测器和废液管，两个色谱柱接在左阀和右阀之间，通过左阀和右阀的协同工作可以实现交替地选择一个色谱柱与自动进样器和检测器相连接，另一个色谱柱与副泵和废液管相连接。如此当采用双泵双柱检测模式时，可以交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测，即主泵对一个色谱柱进行分析检测时，副泵对另一个色谱柱进行清洗，既保证了对色谱柱进行充分的清洗，去除色谱柱内残留的弱极性杂质，又能有效缩短待测样品整体的分析检测时间。

具体地，针对两个相同型号的色谱柱：色谱柱1和色谱柱2，当色谱柱1与自动进样器和检测器连接，色谱柱2与副泵和废液管相连接时，由主泵对色谱柱1中的待测样品进行检测，由副泵对已完成待测样品检测的色谱柱2进行清洗；在色谱柱1完成待测样品的检测，色谱柱2完成清洗后，由色谱柱2与自动进样器和检测器连接，色谱柱1与副泵和废液管相连接，再由主泵对色谱柱2中的待测样品进行检测，由副泵对已完成待测样品检测的色谱柱1进行清洗，从而交替实现利用两个色谱柱进行待测样品的检测。

实施例3：待测样品的前处理

3.1取待处理样品500μL，在离心速度为3500rpm的转速下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，将上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。

3.2用移液枪移取10μL实施例1步骤(d)的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤3.1中的第一上清液，顺次加入300μL乙腈蛋白沉淀试剂，在2500rpm的转速下涡旋混合5min，并在14000rpm的转速下高速离心10min，移取离心后的第二上清液(上层有机相)作为待测样品。

实施例4：待测样品的检测

利用液相色谱仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。

从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中马普替林的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，将待测样品中的马普替林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y1'，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中的马普替林的浓度与内标物的浓度的比值，由于待测样品中的内标物的浓度已知，由此可以计算得到待测样品中的马普替林的浓度。

实施例5：针对样品前处理的说明

本申请例1：

(1)10μL内标工作液+100μL血清或血浆，得到混合液；

(2)加入300μL乙腈混合10min进行蛋白沉淀，混匀并离心，得到第二上清液为待测样品。

对比例1：(高效液相色谱法测定人血清中盐酸马普替林的浓度[J].中国医院药学杂志.)

(1)采用外标法，加入1000μL血清+2000μL含有1.5％异戊醇的正己烷溶液+500μLNaOH溶液(4M)，混匀并离心得到上层溶液；

(2)在50℃水浴下对上层溶液进行吹干后，加入200μL复溶液(甲醇)溶解，混匀后即得到待测样品。

从本申请例1和对比例1可以看出，本发明的样品使用量仅为对比例样本使用量的10％，更加符合科学伦理道德标准，使得待测人员依从性更高；采用血液样本先经离心处理，加入内标物和蛋白沉淀剂混匀并离心的前处理方式，相较于对比例1中加NaOH溶液、混合蛋白沉淀试剂和复溶液的前处理方式，本申请节省了蛋白沉淀试剂的配置时间，减少了试剂配制过程的误差，同时本申请使用溶剂的用量更少，且避免使用氢氧化钠溶液，对环境更友好；同时本申请的前处理操作更简单，耗费时间更短，因此缩短了对待测样品的检测时间。

本发明在简化前处理方式，节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了相同甚至更好的结果。

实施例6：针对检测条件的说明

本申请例2：

(1)色谱柱：Acclaim TM120 C18，(色谱柱内径3.0mm×柱长150mm、填料粒径3μm)；

(2)采用双泵双柱检测模式，对待测样品进行检测时采用等度洗脱，其中洗脱流动相中的水相包括：含有40mM乙酸铵、0.2％三乙胺和0.075％甲酸的水溶液；洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；在待测样品检测后清洗色谱柱时采用梯度洗脱；

(3)流速：1.0mL/min，分析时间3min；

(4)采用荧光检测。

对比例2：(超高效液相色谱-串联质谱同时测定人血浆中9种抗抑郁药物的浓度[J].中国临床药理学杂志,2016.)

(1)色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS C18，(色谱柱内径2.1mm×柱长150mm、填料粒径1.8μm)；

(2)采用梯度洗脱，洗脱流动相为含有0.01％甲酸的水溶液-含有0.01％甲酸的甲醇溶液；

(3)流速：0.3mL/min，分析时间5.5min；

(4)采用质谱检测。

从图2、本申请例2和对比例2可以看出，本申请的样本分析时间为3min，马普替林的保留时间约为2.0min，相较于对比例2的分析时间短，保留时间(对比例2中马普替林的保留时间约为4.6min)也短。而且本申请采用双泵双柱检测模式，在对多个待测样品进行检测时，两个色谱柱交替对待测样品进行检测，节约了色谱柱在一次检测完成后的清洗等待时间，从整体上极大地缩短了待测样品的检测时间。综上可见本申请例2极大地减少了分析时间成本，更有利于大批量待测样品的检测。

本发明在节省分析时间的前提下，得到的测定结果达到了相同甚至更好的结果。

实施例7：马普替林的检测方法的检出限和定量限

制备不同浓度的含有马普替林的低浓度样本，分别加入10μL步骤(d)中的内标工作液和90μL空白样本(比如，未含有马普替林的血清或血浆)，从而制备得到不同浓度的样本，按本实施例3中的前处理及实施例2中的检测条件进行检测，其中，本实施例中按照浓度由低至高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的混合液对浓度低的混合液产生影响。马普替林的线性范围和定量限分别如下：

(1)检出限(LOD)：5ng/mL，信噪比(S/N)为3；

(2)定量限(LOQ)：15ng/mL，信噪比(S/N)为10。

由本实施例可知，马普替林的检出限和定量限分别为5ng/mL和15ng/mL，灵敏度较高，对马普替林含量低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例8：马普替林的检测方法的线性方程的获得和线性关系

将实施例1中七种不同浓度的标准溶液利用液相色谱仪按照实施例2中的检测条件进行测定，得到各浓度马普替林及内标物的色谱图，其中，标准溶液中的马普替林和内标维拉帕米的色谱图如图3所示；马普替林的保留时间约为2.0min，内标维拉帕米的保留时间约为2.6min。

确定各色谱峰峰面积，以马普替林的色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，标准溶液中马普替林的浓度与内标物色谱峰浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a*x2+b，并且得系数c；线性方程的测定结果见表1，线性方程图见图4。

表1

检测指标	线性范围	线性方程	相关系数	加权
					马普替林-某实施例1	30-360ng/mL	y2＝36.1667*x2-0.0212	0.9992	1/X<sup>2</sup>

表1为一次实施例中的线性关系数据，由表1可知，马普替林在30-360ng/mL的线性范围内，相关系数R²＞0.9900，线性关系良好。

实施例9：马普替林的检测方法的回收率和精密度

移取步骤(b)中的标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度如下述表2所示。马普替林在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.2％～104.9％，精密度为1.7％～2.9％。

表2

综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，利用本发明提供的方法检测待测样品中的马普替林的浓度，重现性良好，且加样回收率高，提高了检测结果的准确度。

图3为实施例2中的标准溶液中的马普替林的色谱图，图2为实施例3中的待测样品中的马普替林的色谱图，其中，图2和图3中的马普替林的保留时间均约为2.0min，内标物的保留时间均约为2.6min。图2中的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.1×10；图3中的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.05×10。

由图2和图3可知，本实施例方法中的马普替林的保留时间约为2.0min，内标物的保留时间约为2.6min，分析时间短、目标物识别准确、干扰小，特异性强。

实施例10：针对柱温和流速的说明

图5至图9分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为流速和柱温不同。

图5为流速0.6mL/min、柱温40℃时的色谱图，图5的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.1×10；图5中保留时间约为4.4min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为3.4min的色谱峰为马普替林的色谱峰；

图6为流速0.8mL/min、柱温40℃时的色谱图，图6的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.1×10；图6中保留时间约为3.4min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.7min的色谱峰为马普替林的色谱峰；

图7为流速1.2mL/min、柱温40℃时的色谱图，图7的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.1×10；图7中保留时间约为1.9min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为1.65min的色谱峰为马普替林的色谱峰；

图8为流速1.0mL/min、柱温30℃时的色谱图，图8的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.1×10；图8中保留时间约为2.45min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.05min的色谱峰为马普替林的色谱峰；

图9为流速1.0mL/min、柱温50℃时的色谱图，图9的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.1×10；图9中保留时间约为2.8min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为1.85min的色谱峰为马普替林的色谱峰。

通过图2、图5至图9可见，当流速低于0.6mL/min时，马普替林和内标物的保留时间均大于3min，这样会使得待测样品的整体检测时间过长，影响待测样品检测的时效性；而流速高于1.1mL/min时，马普替林和内标物的分离度差，会影响待测样品的检测准确性，同时流速过大会使柱压升高，超过色谱柱所能承受的压力，对色谱柱造成不可逆的损伤，同时耗费的溶剂较多，成本较高。

流速为1.0mL/min，柱温在30℃至50℃范围内时，柱温对马普替林的保留时间影响较小，但是柱温较低会导致马普替林与内标物的分离度较差，从而影响待测样品的检测准确性，而柱温大于50℃时，马普替林与内标物的分离度则过大，且内标物的保留时间增大，使得待测样品的整体分析时间增加；同时柱温过高还会对色谱柱中的填料造成不可逆的损伤，影响色谱柱的寿命。

综上，本发明对待测样品检测的流速在0.6-1.1mL/min区间，柱温在30-50℃区间，可以使得马普替林和内标物的保留时间均在3.0min之内，缩短待测样品的整体检测时间，提高样品检测的时效性。

实施例11：针对蛋白沉淀试剂的说明

图10和图11对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为蛋白沉淀试剂的不同。

图10是蛋白沉淀试剂为甲醇时的色谱图，其中，图10的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.2×10；图10中保留时间约为2.65min的色谱峰均为内标物的色谱峰，保留时间约为2.05min的色谱峰均为马普替林的色谱峰；

图11是蛋白沉淀试剂为乙醇时的色谱图，其中，图11的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.1×10；图11中保留时间约为2.65min的色谱峰均为内标物的色谱峰，保留时间约为2.05min的色谱峰均为马普替林的色谱峰。

通过图2、图10和图11可知，由乙腈、甲醇和乙醇中的至少一种作为蛋白沉淀试剂，得到的待测样品的色谱峰均不是前沿峰、拖尾峰，并且色谱峰的峰宽没有出现过宽的情况，因此乙腈、甲醇和乙醇均可以用于本实施例中的蛋白沉淀试剂。

实施例12：针对洗脱流动相的说明

图12和图13分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为主泵洗脱流动相中有机相与水相的体积比不同。

图12为洗脱流动相中有机相与水相的体积比为40％:60％时的色谱图，图12的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.1×10，图12中保留时间约为2.9min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为2.3min的色谱峰为马普替林的色谱峰；

图13为洗脱流动相中有机相与水相的体积比为50％:50％时的色谱图，图13的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.1×10，图13中保留时间约为2.3min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为1.55min的色谱峰为马普替林的色谱峰。

通过图2、图12和图13可见，有机相在洗脱流动相中体积占比小于40％时，马普替林和内标物的保留时间增大，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的检测时效性；而有机相在洗脱流动相中体积占比大于48％时，马普替林的色谱峰受杂质干扰在峰前出现前沿峰，影响待测样品的检测准确性。

实施例13：针对色谱柱的说明

图14是对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为所使用的色谱柱不同。

图14是色谱柱为Kinetex F5的色谱图，其中，色谱柱内径为4.6mm、色谱柱柱长为100mm、填料粒径为2.7μm，图14的横坐标的单位长度为0.05，纵坐标的单位长度为0.1×10，图14中保留时间约为1.5min的色谱峰为内标物的色谱峰，保留时间约为1.2min的色谱峰为马普替林的色谱峰.

通过图14可见，利用Kinetex F5色谱柱对待测样品进行检测得到的目标物的色谱峰未得到良好的分离，影响色谱峰面积测量的准确度，从而直接影响待测样品定量分析的准确度。

需要说明的是，图2、图3、图5至图14的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为信号强度(mV)，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.马普替林的检测方法，其特征在于，包括：

利用液相色谱仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果，所述检测条件中的液相条件，包括：

洗脱流动相中的水相包括：含有30-50 mM乙酸铵、0.1%-0.3%三乙胺和0.05%-0.1%甲酸的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：乙腈溶液；

柱温为30-50℃；

流速为0.6-1.1 mL/min；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品，第一上清液包括血清或血浆，所述蛋白沉淀试剂包括：乙腈、甲醇和乙醇中的至少一种；所述内标物包括维拉帕米；

利用液相色谱仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果，采用双泵双柱检测模式，其中，

所述双泵双柱检测模式包括：主泵、副泵和两个色谱柱；色谱柱为Acclaim TM120 C18色谱柱，长度为150 mm、内径为3.0 mm以及填料粒径为3 μm；

所述主泵和所述两个色谱柱中的一个色谱柱在对待测样品进行检测时，采用等度洗脱，洗脱流动相中的有机相与水相的体积比为：40%:60%-48%:52%；

所述副泵用于对待测样品检测后的色谱柱进行清洗；

0.00 min：90%:10%-100%:0%；

1.00 min：90%:10%-100%:0%；

1.01 min：40%:60%-48%:52%；

3.00 min：40%:60%-48%:52%；

2.根据权利要求1所述的马普替林的检测方法，其特征在于，

所述检测条件中的荧光检测条件，包括：

激发波长：215-235 nm；发射波长：280-300 nm。

3.根据权利要求1所述的马普替林的检测方法，其特征在于，

所述标准曲线方程的两个变量分别为：马普替林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及马普替林的浓度与内标物的浓度的比值。

4.根据权利要求1所述的马普替林的检测方法，其特征在于，

所述第一上清液与所述蛋白沉淀试剂的体积比为1:3-1:20。

5.根据权利要求1所述的马普替林的检测方法，其特征在于，

所述向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入蛋白沉淀试剂，涡旋混匀，对所述第一上清液进行蛋白沉淀，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，顺次加入蛋白沉淀试剂，在1000-2500 rpm的转速下涡旋混合3-8 min，并在10000-14000 rpm的转速下离心5-15 min，移取第二上清液作为待测样品。