CN114609265A - 一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法 - Google Patents

一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，12min之内完成八种甲状腺激素类标志物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上八种甲状腺激素类标志物的定量分析，为临床上八种甲状腺激素类标志物浓度的检测提供一种可靠的检测方法。

Description

一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标 志物的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法。
背景技术
甲状腺癌(Thyroid cancer，TC)是一种常见的恶性肿瘤，同时也是发病率最高的内分泌肿瘤(95.98％)。自上世纪90年代以来，其全球发病率增长迅速。虽然相较于其他恶性肿瘤，TC的死亡率较低(10年生存率88％)，但疾病复发率和持续率很高，导致患者发病率和死亡率增加。此外，据美国癌症协会报告，TC的发病率比其他癌症增加得更快。在TC中，甲状腺乳头状癌(PTC)的发病率最高，占总量的90％以上。目前TC缺乏有效的血清学诊断标准，因此，开发甲状腺癌血清学诊断标志物意义重大。
现有诊断甲状腺结节是否为甲状腺癌的方法主要有影像学和穿刺病理活检两种方法。穿刺病理活检是目前甲状腺癌确诊的金指标，但该方法是一种有创的侵入性诊断方法，穿刺后会带来甲状腺癌应激性增殖和随行转移等明显副作用。影像学诊断主要包括CT和超声诊断。然而，影像学诊断的准确率不足70％，单独利用影像学方法很难对甲状腺癌患者进行确诊，尚缺乏有效的血清学生物标志物结合影像学技术来提高甲状腺癌的诊断准确率。
目前，作为血清标志物的检测方法不能同时检测包含甲状腺激素在内的所有甲状腺激素类标志物，特别是对于一些低含量的甲状腺激素类标志物来说，现有的检测方法的检测灵敏度达不到能够检测这些标志物的要求。因此，探索一种同时定量检测更多的甲状腺激素类标志物的方法尤为重要。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法。
本发明的技术方案如下：
一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法，
所述甲状腺激素类标志物分别为：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)；
上述甲状腺激素类标志物对应的内标为：3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)；
采用液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述甲状腺激素类标志物，先利用液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中甲状腺激素类标志物的含量，具体色谱条件为：
(1)液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.5％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Waters BEH C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为60:40；在0.5-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至55:45；在4.0-9.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至5:95；在9.0-11.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为 5:95；在11.0-11.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至60:40；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为250℃，脱溶剂气流速为3000L/h，锥孔气流速为300L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用液质联用的方法检测血清中甲状腺激素类标志物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，12min之内完成甲状腺激素类标志物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.5％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。在本发明中，所选择的色谱柱为Waters BEH C18，优选地，色谱柱的长度为 100mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.7μm。本发明采用0.01％～0.5％甲酸水溶液和甲醇作为流动相，色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，12 min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。而采用其他类似的C18色谱柱，例如，Unity C18柱，无法检测出所有甲状腺激素类标志物，灵敏度低，准确度差，无法满足要求。
另外，在本发明的色谱分析过程中，梯度洗脱过程的选择也特别重要。在其他条件相同的条件下，调整梯度洗脱过程，即使可以检测出所有甲状腺激素类标志物，却无法实现基线分离，干扰各标志物的定量分析。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定甲状腺激素类标志物时的重现性、准确度均较好。
在一种方案中，流速为0.1～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃。
更进一步地，进样体积为1～20μL，例如，1μL、10μL、15μL或20μL，优选为5μL。
在一种优选方案中，采用液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物时，具体色谱条件为：
(1)液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为60:40；在0.5-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至55:45；在4.0-9.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至5:95；在9.0-11.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为5:95；在11.0-11.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至60:40；梯度洗脱的方式，见表1；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。
表1流动相梯度洗脱参数
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B
0.0 0.3 60 40
0.5 0.3 60 40
4.0 0.3 55 45
9.0 0.3 5 95
11.0 0.3 95 5
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为250℃，脱溶剂气流速为3000L/h，锥孔气流速为300L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
表2甲状腺激素类标志物的质谱参数
化合物 母离子 子离子 去簇电压(V) 碰撞电压(V) ESI(+)
T0 274.06 215.09 50 25 ESI+
3-T1 400.03 256.14 50 25 ESI+
3’-T1 400.03 256.14 50 25 ESI+
3-T1AM 355.90 212.02 50 25 ESI+
3,5-T2 525.80 353.00 50 45 ESI+
3’,5’-T2 525.80 466.80 50 35 ESI+
3,3’-T2 525.73 381.93 50 30 ESI+
3,5-T2AM 481.80 377.80 50 30 ESI+
3,3’,5-T3-13C6 677.70 611.34 50 30 ESI+
本发明提及的血清为人或动物血清。
在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，振荡离心后取上清液，加入SPE色谱柱中进行富集，再以甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与甲醇水溶液复溶，即得待测样品。
其中，蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液。优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:2。
在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取100μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)，在 12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，取上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，即得待测样品。其中，含内标的蛋白沉淀剂是由内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂比例为1:9。
在一种特别优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取100μL血清于1.5 mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)，在14000r/min，4℃离心5min后，取上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，即得待测样品。其中，含内标的蛋白沉淀剂是由内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂比例为1:9。
在一种方案中，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：(1)配置10ng/mL3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)的甲醇水溶液作为内标溶液；(2)取200μL上述内标溶液加入至1.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在本发明中，内标溶液的配制包括如下更加详细的步骤：将100ng/mL同位素内标的3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)内标母液以80％甲醇水溶液配制成包含有10ng/mL的3,3’,5-3三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)内标溶液。
在一种更优选方案中，内标溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的100ng/mL的3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6内标母液，加入950μL 80％甲醇水溶液，混匀得到1mL内标溶液，浓度参下表3。
表3内标溶液的配制
组分 母液浓度(ng/mL) 移取体积(μL) 总体积(μL) 内标溶液浓度(ng/mL)
3,3’,5-T3-13C6 100 100 1000 10
取200μL上述内标溶液加入至1.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，甲状腺激素类标志物的富集材料选择SPE富集小柱，优选HLB型SPE富集小柱。沉淀蛋白后离心的上清液加入SPE富集柱进行富集，利用0.1％甲酸甲醇溶液进行洗脱，洗脱体积为1mL。
本发明提及的空白血清基质为甲醇水溶液，优选为80％甲醇水溶液。
上述检测方法还包括标准品，所述标准品按照为：将分别包含有500ng/mL L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸 (3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM) 的混合标准品溶液以空白血清基质(甲醇水溶液，优选为80％甲醇水溶液)溶液配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：500ng/mL、200ng/mL、 100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL。
在一种更优选方案中，校准品溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的标准品母液，加入900μL 80％甲醇水溶液，充分混匀得到1 mL混合标准品溶液，浓度参下表4。
表4混合标准品溶液的配制
Figure BDA0003486761430000061
采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出混合标准溶液后，涡旋10s，2min内使用混合标准品溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存，配制过程如下：
以混合标准溶液作为第一个高值浓度点(S9)；取第一高值浓度点(S9)用1.5倍体积80％甲醇水稀释得第二高值浓度点(S8)；取第一高值浓度点(S9)用4倍体积80％甲醇水稀释得第三高值浓度点(S7)；取第二高值浓度(S8)点用1.5倍80％甲醇水稀释得第四高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S9)用9倍体积80％甲醇水稀释得第五高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S8)用9倍体积80％甲醇水稀释得第六高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S7)用9倍体积80％甲醇水稀释得第七高值浓度点(S3)，取第七高值浓度点(S3)用9倍体积80％甲醇水稀释得第八高值浓度点(S2)，取第八高值浓度点 (S2)用等体积80％甲醇水稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如下表5(单位：ng/mL)。
表5标曲配制
标曲 移取溶液(μL) 80％甲醇水(μL)
S9 100 0
S8 S9 100 150
S7 S9 40 160
S6 S8 100 150
S5 S9 20 180
S4 S8 20 180
S3 S7 20 180
S2 S3 20 180
S1 S2 100 100
本发明的检测方法还包括质控品，所述质控品按照如下方法制备：将含标志物的空白血清基质，以空白血清基质稀释，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、 QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中甲状腺激素类化合物质控品对应浓度见表6。
表6甲状腺激素类化合物质控品对应浓度(单位:ng/mL)
编号 组分 QC(L) QC(M) QC(H)
1 T0 1 10 100
2 3-T1 1 10 100
3 3’-T1 1 10 100
4 3-T1AM 1 10 100
5 3,5-T2 1 10 100
6 3’,5’-T2 1 10 100
7 3,3’-T2 1 10 100
8 3,5-T2AM 1 10 100
QC(L)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’- 二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L- 甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为1ng/mL；
QC(M)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’- 二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L- 甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为10ng/mL；
QC(H)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’- 二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L- 甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为100ng/mL。
采用本发明的方法检测血清中八种甲状腺激素类标志物时，样本量仅需要100uL，可同时针对8种物质进行检测，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上甲状腺激素类标志物的定量分析，为临床上血清中甲状腺激素类标志物的治疗浓度监测提供简单快速的检测方法。
采用本发明的技术方案，优势如下:
采用本发明的方法检测血清中八种甲状腺激素类标志物时，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，12min之内完成八种甲状腺激素类标志物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上八种甲状腺激素类标志物的定量分析，为临床上八种甲状腺激素类标志物浓度的检测提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为八种甲状腺激素类标志物标准品的提取离子流色谱图，其中，时间的单位为min；
图2为八种甲状腺激素类标志物的提取离子流色谱图，其中，时间的单位为min；
图3为对比例1中色谱图，其中，时间的单位为min；
图4为对比例2中色谱图，其中，时间的单位为min。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下实施例所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和不中也应视为本发明的保护范围。
实施例1八种甲状腺激素类血清标志物的检测
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自徐州市中心医院2020年2月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：5500三重四级杆质谱仪(AB Sciex)；UPLC超高效液相色谱系统(配自动进样器，AB Sciex)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL， 10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表7。
序号 中文名称 厂家
1 T0 TRC
2 3-T1 TRC
3 3’-T1 TRC
4 3-T1AM Sigma
5 3,5-T2 TRC
6 3’,5’-T2 TRC
7 3,3’-T2 J92 Matrix
8 3,5-T2AM J&K
9 3,3’,5-T3-13C6 TRC
(4)质控品：含有八种甲状腺激素化合物的甲醇水，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表6所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：甲醇。色谱柱型号：WatersBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为250℃，脱溶剂气流速为3000L/h，锥孔气流速为300L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
三、实验过程
(1)标准品配制：
将分别包含有500ng/mL的L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’- 碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2) 和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的混合标准溶液以空白血清基质(80％甲醇水溶液)溶液配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和 0.5ng/mL。(可参照表4和5)
(2)含内标的蛋白沉淀剂配制
将100ng/mL的3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)同位素内标母液以80％甲醇水溶液配制成包含有10ng/mL的3,3’,5-3碘-L-甲状腺原氨酸-13C6 (3,3’,5-T3-13C6)内标溶液(可参照表3)。取200μL上述混合内标溶液加入至1.8mL 蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
(3)质控品配制：
取上述混合标准溶液以空白血清基质(80％甲醇水溶液)配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)(可参照表6)。
QC(L)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’- 二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L- 甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为1ng/mL；
QC(M)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’- 二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L- 甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为10ng/mL；
QC(H)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’- 二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L- 甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为100ng/mL。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取100μL于1.5mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000 r/min，4℃离心5min；所得上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱1mL，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，即得待测样品，进样量5μL。
2)血清样品前处理：取100μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min， 4℃离心5min；所得上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱1mL，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，即得待测样品，进样量5μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各100μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：甲状腺激素类标志物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为甲状腺激素类标志物标准品的提取离子流色谱图；图2为血清样本中甲状腺激素类标志物的提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用excel软件以标准物与内标物的浓度比为 X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。甲状腺激素类化合物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表8。
表8甲状腺激素类标志物线性回归方程及线性相关系数
序号 化合物 保留时间(min) 线性范围(ng/mL) 线性方程 相关系数(r)
1 T0 1.32 0.5-500 Y＝2687.9X-26761 0.993
2 3-T1 2.78 0.5-500 Y＝1360.9X-2682.8 0.999
3 3’-T1 3.21 0.5-500 Y＝3463.4X+4183.4 0.999
4 3-T1AM 2.61 0.5-500 Y＝3643X+58.161 0.999
5 3,5-T2 3.81 0.5-500 Y＝751.43X+784.89 0.999
6 3’,5’-T2 6.21 0.5-500 Y＝2069X+1114.1 0.999
7 3,3’-T2 6.56 0.5-500 Y＝1566.2X+3606.8 0.999
8 3,5-T2AM 3.48 0.5-500 Y＝2883.3X-1053 0.999
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，甲状腺激素类化合物的加标回收率在之间，5次重复试验的RSD在范围，统计结果见表9。
表9甲状腺激素类标志物加标回收率结果
Figure BDA0003486761430000111
Figure BDA0003486761430000121
五、讨论
本发明建立了液相色谱串联质谱技术一同测定人体血清中抗甲状腺激素类标志物的方法。血浆用量少(仅需100μL)且前处理简单，且一针分析多种物质只需12min，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，甲状腺激素类标志物的加标回收率为92.33％-113.90％之间，5次重复试验的RSD在1.41％-5.91％，准确度良好。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，12min之内完成标志物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清甲状腺激素类标志物的定量分析，为其检测提供一种可靠的检测方法。
对比例1
血清样本处理处理方法和相关液相色谱条件参照实施例1，将梯度洗脱过程进行修改，具体如下：在0-5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至60:40；在5-12分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至80:20。
由图3可知，调整梯度以后，虽然8种甲状腺激素类标志物可以被检测出，却无法实现基线分离，干扰各标志物的定量分析。
对比例2
血清样本处理处理方法和相关液相色谱条件参照实施例1，将色谱柱Waters BEHC18 (2.1×100mm，1.7μm)修改为Unity C18(150mm×2.1mm,3μm)。
由图4可知，替换色谱柱以后，仅能检测出3-T1AM，3,5-T2AM，3,5-T2和3’,5’-T2 4种标志物，其他4种标志物无法被检测出。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法，
所述甲状腺激素类标志物分别为：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)；
上述甲状腺激素类标志物对应的内标为：3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)；
采用液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述甲状腺激素类标志物，先利用液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中甲状腺激素类标志物的含量，具体色谱条件为：
(1)液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.5％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Waters BEH C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为60:40；在0.5-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至55:45；在4.0-9.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至5:95；在9.0-11.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为5:95；在11.0-11.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至60:40；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为250℃，脱溶剂气流速为3000L/h，锥孔气流速为300L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液，优选地，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的长度为100mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.7μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，振荡离心后取上清液，加入SPE色谱柱中进行富集，再以甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与甲醇水溶液复溶，即得待测样品；所述蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:1～5；更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:2；所述甲酸甲醇溶液中甲酸的体积分数为0.05％～0.15％，优选为0.1％；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为30％～50％，优选为40％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取100μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂，振荡3～5min，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，取上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，，即得待测样品；所述蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:2。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：(1)配置10ng/mL3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)的甲醇水溶液作为内标溶液；(2)取200μL上述内标溶液加入至1.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标准品按照为：将分别包含有500ng/mL L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的混合标准品溶液以空白血清基质溶液配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱包括：柱温为35～45℃，优选为40℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱包括：流速为0.1～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱包括：进样量为1～20μL，优选为5μL。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117554536A (zh) * 2024-01-12 2024-02-13 北京林业大学 一种环境水样中15种甲状腺激素的同时分析方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080128606A1 (en) * 2006-05-26 2008-06-05 Russell Philip Grant Methods and systems for the quantitative analysis of biomarkers
US20140361156A1 (en) * 2010-11-08 2014-12-11 Georgetown University Methods for Simultaneous Quantification of Thyroid Hormones and Metabolites Thereof by Mass Spectrometry
CN111595956A (zh) * 2020-04-23 2020-08-28 浙江大学 一种血清中激素和神经递质的检测方法
US20200326352A1 (en) * 2019-04-09 2020-10-15 Peking University Method and a kit for simultaneous analyses of thyroid hormones and related metabolites in serum
WO2020254587A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Thyroid hormone or metabolite for use in the treatment of a peripheral vestibulopathy

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080128606A1 (en) * 2006-05-26 2008-06-05 Russell Philip Grant Methods and systems for the quantitative analysis of biomarkers
US20140361156A1 (en) * 2010-11-08 2014-12-11 Georgetown University Methods for Simultaneous Quantification of Thyroid Hormones and Metabolites Thereof by Mass Spectrometry
US20200326352A1 (en) * 2019-04-09 2020-10-15 Peking University Method and a kit for simultaneous analyses of thyroid hormones and related metabolites in serum
WO2020254587A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Thyroid hormone or metabolite for use in the treatment of a peripheral vestibulopathy
CN111595956A (zh) * 2020-04-23 2020-08-28 浙江大学 一种血清中激素和神经递质的检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL RATHMANN等: "Quantitative Analysis of Thyroid Hormone Metabolites in Cell Culture Samples Using LC-MS/MS", 《 EUR THYROID J》 *
王宗义等: "高效液相色谱-串联质谱检测牛奶中的甲状腺素", 《色谱》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117554536A (zh) * 2024-01-12 2024-02-13 北京林业大学 一种环境水样中15种甲状腺激素的同时分析方法
CN117554536B (zh) * 2024-01-12 2024-03-19 北京林业大学 一种环境水样中15种甲状腺激素的同时分析方法

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