CN114609266B - 标志物在制备甲状腺相关疾病的诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及八种甲状腺激素类标志物在制备甲状腺相关疾病的诊断试剂中的应用，利用大样本量的临床样本对这八种甲状腺激素类标志物是否可以作为区分甲状腺癌、良性甲状腺结节和正常人的血清标志物进行验证，提高了所验证指标的准确性。同时这八种标志物也可以任意几种有机结合，通过建立数学模型，提高其在区分恶性甲状腺癌时的准确度和灵敏度，为临床确诊和下一步治疗提供帮助，减少不必要的侵入性诊断，提高甲状腺癌患者的生存质量。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及标志物在制备甲状腺相关疾病的诊断试剂中的应用。
背景技术
甲状腺癌(Thyroid cancer，TC)是一种常见的恶性肿瘤，同时也是发病率最高的内分泌肿瘤(95.98％)。自上世纪90年代以来，其全球发病率增长迅速。虽然相较于其他恶性肿瘤，TC的死亡率较低(10年生存率88％)，但疾病复发率和持续率很高，导致患者发病率和死亡率增加。此外，据美国癌症协会报告，TC的发病率比其他癌症增加得更快。在TC中，甲状腺乳头状癌(PTC)的发病率最高，占总量的90％以上。目前TC缺乏有效的血清学诊断标准，因此，开发甲状腺癌血清学诊断标志物意义重大。
现有诊断甲状腺结节是否为甲状腺癌的方法主要有影像学和穿刺病理活检两种方法。穿刺病理活检是目前甲状腺癌确诊的金指标，但该方法是一种有创的侵入性诊断方法，穿刺后会带来甲状腺癌应激性增殖和随行转移等明显副作用。影像学诊断主要包括CT和超声诊断。然而，影像学诊断的准确率不足70％，单独利用影像学方法很难对甲状腺癌患者进行确诊，尚缺乏有效的血清学生物标志物结合影像学技术来提高甲状腺癌的诊断准确率。
前期研究发现，通过对比15例健康志愿者和45例甲状腺癌患者，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)三种甲状腺激素类化合物可以作为区分甲状腺癌和正常志愿者的血清标志物。但是，这三种化合物在该样本区间无论作单一指标还是结合指标均不能区分良性甲状腺结节和恶性甲状腺癌。
目前，作为血清生物标志物的分子对于甲状腺结节的恶性风险判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远不能适应对甲状腺结节患者进行恶性风险判定的需求。因此，寻找血清学特异性生物标志物方便甲状腺结节患者是否为甲状腺癌的诊断，成为甲状腺外科领域亟需解决的重要课题。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，寻找和探索一类标志物在制备甲状腺相关疾病的诊断试剂中的应用、含有该标志物的试剂盒以及相关的检测方法，提高了甲状腺结节和/或甲状腺癌判断的灵敏度和准确性，为临床确诊和下一步治疗提供帮助，减少不必要的侵入性诊断，提高甲状腺癌患者的生存质量。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一类标志物在制备甲状腺相关疾病的诊断试剂中的应用，其中，所述标志物为以下8个化合物中的一个或多个，该8个化合物的结构式如下所示：
其中，本发明提及的甲状腺相关疾病为甲状腺癌和/或甲状腺结节。优选地，将诊断试剂制成试剂盒进行检测。
例如，标志物是L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中的任意一个。
标志物是L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中的任意两个。
标志物是L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中的任意三个。
标志物是L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中的任意四个。
标志物是L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中的任意五个。
标志物是L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中的任意六个。
标志物是L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中的任意七个。
标志物是L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的组合。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述标志物和检测中可接受的试剂，其中，标志物为8个化合物中的一个或多个。
本发明提供的试剂盒包含上述标志物、检测中可接受的试剂和富集材料，可用于检测甲状腺相关疾病，此处所提及的甲状腺相关疾病为甲状腺癌和/或甲状腺结节。
在本发明中，检测中可接受的试剂可以但不局限于洗脱液、内标溶液和蛋白质沉淀剂，其中，洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，洗脱液A为0.01％～0.5％甲酸水溶液，是指以水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.01％～0.5％甲酸。对于本发明而言，在洗脱液A中，水溶液中甲酸的含量可以但不局限于0.01％、0.05％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％或0.2％，为了获得更好的效果，洗脱液A为0.05％～0.15％甲酸水溶液，进一步地，洗脱液A为0.1％甲酸水溶液。洗脱液B为甲醇。
内标溶液为包含内标的溶液，在本发明中，选择的内标为3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)，例如，内标溶液为包含有10ng/mL3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)的甲醇水溶液。
本发明提及的蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液，优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:1～5；更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:2。
进一步地，本发明提及的富集材料为SPE富集柱，优选为HLB型号的SPE富集柱。
在一种优选方案中，本发明提及的试剂盒，它包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.01％～0.5％甲酸水溶液；洗脱液B：甲醇；
(2)校准品溶液：
将分别包含有500ng/mL L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的混合标准品溶液以空白血清基质溶液配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：
500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL；
(3)内标溶液：
包含有10ng/mL3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)的甲醇水溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与乙腈混合溶液；
(5)富集材料：
SPE富集柱；
(6)质控品：
含所述标志物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为上述混合标准溶液以空白血清基质稀释至500倍；
QC(M)为上述混合标准溶液以空白血清基质稀释至50倍；
QC(H)为上述混合标准溶液以空白血清基质稀释至5倍。
本发明提及的混合标准品溶液按照如下方法制备：将1000ng/mL的L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)标准品母液以甲醇水溶液(例如，80％甲醇水溶液)配制成包含有500ng/mL的L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)混合标准品溶液。
本发明提及的内标溶液按照如下方法制备：将100ng/mL的3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6内标母液以甲醇水溶液(例如，80％甲醇水溶液)配制成包含有10ng/mL的3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6同位素内标溶液。
在制备标准品溶液和内标溶液时，采用的甲醇水溶液的体积浓度为50％～95％甲醇水溶液；优选体积浓度为70％～90％甲醇水溶液；更优选体积浓度为80％甲醇水溶液。
在一种更优选方案中，上述试剂盒，它包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％甲酸水溶液；洗脱液B：甲醇；
(2)校准品溶液：
将分别包含有500ng/mL L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的混合标准溶液以空白血清基质溶液配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：
500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL；
(3)内标溶液：
包含有10ng/mL3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)的甲醇水溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与乙腈的体积比为1:2；
(5)富集材料：
HLB型号的SPE富集柱；
(6)质控品：
含所述标志物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中甲状腺激素类化合物质控品对应浓度见表1。
表1甲状腺激素类化合物质控品对应浓度(单位:ng/mL)
| 编号 | 组分 | QC(L) | QC(M) | QC(H) |
| 1 | T0 | 1 | 10 | 100 |
| 2 | 3-T1 | 1 | 10 | 100 |
| 3 | 3’-T1 | 1 | 10 | 100 |
| 4 | 3-T1AM | 1 | 10 | 100 |
| 5 | 3,5-T2 | 1 | 10 | 100 |
| 6 | 3’,5’-T2 | 1 | 10 | 100 |
| 7 | 3,3’-T2 | 1 | 10 | 100 |
| 8 | 3,5-T2AM | 1 | 10 | 100 |
QC(L)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为1ng/mL；
QC(M)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为10ng/mL；
QC(H)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为100ng/mL。
本发明提及的空白血清基质为甲醇水溶液，优选为80％甲醇水溶液。
在一种更优选方案中，内标溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的100ng/mL的3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6内标母液，加入950μL 80％甲醇水溶液，混匀得到1mL内标溶液，浓度参下表2。
表2内标溶液的配制
| 组分 | 母液浓度(ng/mL) | 移取体积(μL) | 总体积(μL) | 内标溶液浓度(ng/mL) |
| 3,3’,5-T3-13C6 | 100 | 100 | 1000 | 10 |
在一种优选方案中，将内标溶液与蛋白质沉淀剂以体积比为1:9进行混合制备含内标的蛋白质沉淀剂，用于液相色谱串联质谱检测。其中，蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液，优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:1～5；更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:2。例如，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法配制：取200μL内标溶液加入至1.8mL蛋白沉淀剂(蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:2)中，混合均匀得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种更优选方案中，校准品溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的标准品母液，加入900μL 80％甲醇水溶液，充分混匀得到1mL混合标准品溶液，浓度参下表3。
表3混合标准品溶液的配制
采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出混合标准溶液后，涡旋10s，2min内使用混合标准品溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存，配制过程如下：
以混合标准溶液作为第一个高值浓度点(S9)；取第一高值浓度点(S9)用1.5倍体积80％甲醇水稀释得第二高值浓度点(S8)；取第一高值浓度点(S9)用4倍体积80％甲醇水稀释得第三高值浓度点(S7)；取第二高值浓度(S8)点用1.5倍80％甲醇水稀释得第四高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S9)用9倍体积80％甲醇水稀释得第五高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S8)用9倍体积80％甲醇水稀释得第六高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S7)用9倍体积80％甲醇水稀释得第七高值浓度点(S3)，取第七高值浓度点(S3)用9倍体积80％甲醇水稀释得第八高值浓度点(S2)，取第八高值浓度点(S2)用等体积80％甲醇水稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如下表4(单位：ng/mL)。
表4标曲配制
上述试剂盒在利用液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的应用也在本发明的保护范围之内。
一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法，
所述甲状腺激素类标志物分别为：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)；
上述甲状腺激素类标志物对应的内标为：3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)；
采用液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述甲状腺激素类标志物，先利用液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中甲状腺激素类标志物的含量，具体色谱条件为：
(1)液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.5％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Waters BEH C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为60:40；在0.5-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至55:45；在4.0-9.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至5:95；在9.0-11.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为5:95；在11.0-11.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至60:40；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为250℃，脱溶剂气流速为3000L/h，锥孔气流速为300L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用液质联用的方法检测血清中甲状腺激素类标志物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，12min之内完成甲状腺激素类标志物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.5％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。在本发明中，所选择的色谱柱为Waters BEH C18，优选地，色谱柱的长度为100mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.7μm。本发明采用0.01％～0.5％甲酸水溶液和甲醇作为流动相，色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，12min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。而采用其他类似的C18色谱柱，例如，Unity C18柱，无法检测出所有甲状腺激素类标志物，灵敏度低，准确度差，无法满足要求。
另外，在本发明的色谱分析过程中，梯度洗脱过程的选择也特别重要。在其他条件相同的条件下，调整梯度洗脱过程，即使可以检测出所有甲状腺激素类标志物，却无法实现基线分离，干扰各标志物的定量分析。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定甲状腺激素类标志物时的重现性、准确度均较好。
在一种方案中，流速为0.1～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃。
更进一步地，进样体积为1～20μL，优选为5μL。
在一种优选方案中，采用液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物时，具体色谱条件为：
(1)液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
色谱柱型号：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为60:40；在0.5-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至55:45；在4.0-9.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至5:95；在9.0-11.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为5:95；在11.0-11.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至60:40；梯度洗脱的方式，见表5；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。
表5流动相梯度洗脱参数
| 时间(min) | 流速(mL/min) | ％A | ％B |
| 0.0 | 0.3 | 60 | 40 |
| 0.5 | 0.3 | 60 | 40 |
| 4.0 | 0.3 | 55 | 45 |
| 9.0 | 0.3 | 5 | 95 |
| 11.0 | 0.3 | 95 | 5 |
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为250℃，脱溶剂气流速为3000L/h，锥孔气流速为300L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表6。
表6甲状腺激素类标志物的质谱参数
| 化合物 | 母离子 | 子离子 | 去簇电压(V) | 碰撞电压(V) | ESI(+) |
| T0 | 274.06 | 215.09 | 50 | 25 | ESI+ |
| 3-T1 | 400.03 | 256.14 | 50 | 25 | ESI+ |
| 3’-T1 | 400.03 | 256.14 | 50 | 25 | ESI+ |
| 3-T1AM | 355.90 | 212.02 | 50 | 25 | ESI+ |
| 3,5-T2 | 525.80 | 353.00 | 50 | 45 | ESI+ |
| 3’,5’-T2 | 525.80 | 466.80 | 50 | 35 | ESI+ |
| 3,3’-T2 | 525.73 | 381.93 | 50 | 30 | ESI+ |
| 3,5-T2AM | 481.80 | 377.80 | 50 | 30 | ESI+ |
| 3,3’,5-T3-13C6 | 677.70 | 611.34 | 50 | 30 | ESI+ |
本发明提及的血清为人或动物血清。
在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，振荡离心后取上清液，加入SPE色谱柱中进行富集，再以甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与甲醇水溶液复溶，即得待测样品。
其中，蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液。优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:2。
在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取100μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，取上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，即得待测样品。其中，含内标的蛋白沉淀剂是由内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂比例为1:9。
在一种特别优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取100μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)，在14000r/min，4℃离心5min后，取上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，即得待测样品。其中，含内标的蛋白沉淀剂是由内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂比例为1:9。
在一种方案中，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
将100ng/mL同位素内标的3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)内标母液以80％甲醇水溶液配制成包含有10ng/mL的3,3’,5-3三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)内标溶液；
取200μL上述内标溶液加入至1.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，甲状腺激素类标志物的富集材料选择SPE富集小柱，优选HLB型SPE富集小柱。沉淀蛋白后离心的上清液加入SPE富集柱进行富集，利用0.1％甲酸甲醇溶液进行洗脱，洗脱体积为1mL。
上述检测方法还包括标准品，所述标准品按照如下方法制备：将分别包含有500ng/mL L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的混合标准品溶液以空白血清基质溶液(甲醇水溶液，优选为80％甲醇水溶液)配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL。
本发明的检测方法还包括质控品，所述质控品按照如下方法制备：将含标志物的空白血清基质，以空白血清基质稀释，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为1ng/mL；
QC(M)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为10ng/mL；
QC(H)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为100ng/mL。
本发明提供了风险评分模型构建的构建过程，根据神经网络模型建立风险评分模型，利用神经网络模型输入标志物的含量以判断是否为甲状腺癌；所述风险评分模型为：风险评分＝model(L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中至少一个的表达水平)；当风险评分大于0.5时，受试者患有甲状腺癌的风险高；当风险评分小于0.5时，受试者还有甲状腺癌风险低。
在本发明风险评分模型构建的基础上，对风险模型进行验证，使用测试集数据对风险评分模型进行验证，检验所建模型的预测准确度
本发明还提供了甲状腺结节恶性风险评估系统，其包括包括诊断模块，所述诊断模块利用前面构建的风险评分模型对受试者是否为甲状腺癌风险做出判断。
进一步，所述系统还可以包括数据输入模块、数据预处理模块、模型训练模块、模型测试模块。
模型预处理模块的工作原理是：将标志物含量输入模块形成数据。
模型训练模块的工作原理是：将数据利用神经网络方法构建风险评分模型。
模型测试模块的工作原理是：待检测的数据代入模型训练模块训练好的风险评分模型中，向前传播，输出结果。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供八种甲状腺激素类标志物在制备甲状腺相关疾病的诊断试剂中的应用、含有该标志物的试剂盒以及相关的检测方法，利用大样本量的临床样本对这八种甲状腺激素类标志物是否可以作为区分甲状腺癌、良性甲状腺结节和正常人的血清标志物进行验证，提高了所验证指标的准确性。同时这八种标志物也可以任意几种有机结合，通过建立数学模型，提高其在区分恶性甲状腺癌时的准确度(AUC均接近或者大于0.9)。
附图说明
图1为八种甲状腺激素类标志物标准品的提取离子流色谱图，其中，时间的单位为min；
图2为八种甲状腺激素类标志物的提取离子流色谱图，其中，时间的单位为min；
图3为对比例1中色谱图，其中，时间的单位为min；
图4为对比例2中色谱图，其中，时间的单位为min；
图5是L-甲状腺原氨酸(T0)的ROC曲线图，其中，左边为训练集，右边为测试集；
图6是3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)的ROC曲线图，其中，左边为训练集，右边为测试集；
图7是3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)的ROC曲线图，其中，左边为训练集，右边为测试集；
图8是3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)的ROC曲线图，其中，左边为训练集，右边为测试集；
图9是3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)的ROC曲线图，其中，左边为训练集，右边为测试集；
图10为4碘-甲状腺原氨酸(T4)、3,3’,5-3碘-甲状腺原氨酸(T3)和3,3’,5’-3碘-甲状腺原氨酸(RT3)的ROC曲线图，从左至右分别对应T4、T3和rT3的训练集；
图11为3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的ROC曲线图，从左至右分别对应3,5-T2、3’,5’-T2和3,5-T2AM的训练集。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下实施例所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和不中也应视为本发明的保护范围。
实施例1八种甲状腺激素类血清标志物的检测
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自徐州市中心医院2020年2月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：5500三重四级杆质谱仪(AB Sciex)；UPLC超高效液相色谱系统(配自动进样器，AB Sciex)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱：Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表7。
(4)质控品：含有八种甲状腺激素化合物的甲醇水，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表1所示。
试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置洗脱液A和B，左下方分别放置13个安瓿瓶，分别为校准品溶液、内标溶液和质控品；右边分别放置25mL蛋白沉淀剂。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：甲醇。色谱柱型号：WatersBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表5。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为5μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为250℃，脱溶剂气流速为3000L/h，锥孔气流速为300L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表6。
三、实验过程
(1)标准品配制：
将分别包含有500ng/mL的L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的混合标准溶液以空白血清基质(80％甲醇水溶液)溶液配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL。
(2)含内标的蛋白沉淀剂配制
将100ng/mL的3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)同位素内标母液以80％甲醇水溶液配制成包含有10ng/mL的3,3’,5-3碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)内标溶液(可参照表2)。取200μL上述混合内标溶液加入至1.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
(3)质控品配制：
取上述混合标准溶液以空白血清基质(80％甲醇水溶液)配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)(可参照表1)。
QC(L)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为1ng/mL；
QC(M)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为10ng/mL；
QC(H)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为100ng/mL。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取100μL于1.5mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；所得上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，即得待测样品，进样量5μL。
2)血清样品前处理：取100μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入600μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；所得上清液加入HLB SPE色谱柱中，以1mL 0.1％甲酸甲醇溶液洗脱，所得洗脱液冻干后与100μL 40％甲醇水溶液复溶，即得待测样品，进样量5μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各100μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表8。
表8甲状腺激素类化合物分析试剂盒组分的制备(100人份)
备注：含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法配制：取200μL内标溶液加入至1.8mL蛋白沉淀剂中，混合均匀得含内标的蛋白沉淀剂。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：甲状腺激素类标志物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为甲状腺激素类标志物标准品的提取离子流色谱图；图2为血清样本中甲状腺激素类标志物的提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用excel软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。甲状腺激素类化合物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表9。
表9甲状腺激素类标志物线性回归方程及线性相关系数
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，甲状腺激素类化合物的加标回收率在之间，5次重复试验的RSD在范围，统计结果见表10。
表10甲状腺激素类标志物加标回收率结果
五、讨论
本发明建立了液相色谱串联质谱技术一同测定人体血清中抗甲状腺激素类标志物的方法。血浆用量少(仅需100μL)且前处理简单，且一针分析多种物质只需12min，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，甲状腺激素类标志物的加标回收率为92.33％-113.90％之间，5次重复试验的RSD在1.41％-5.91％，准确度良好。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，12min之内完成标志物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清甲状腺激素类标志物的定量分析，为其检测提供一种可靠的检测方法。
对比例1
血清样本处理处理方法和相关液相色谱条件参照实施例1，将梯度洗脱过程进行修改，具体如下：在0-5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至60:40；在5-12分钟内，流动相A和流动相B的体积比由60:40匀速渐变至80:20。
由图3可知，调整梯度以后，虽然8种甲状腺激素类标志物可以被检测出，却无法实现基线分离，干扰各标志物的定量分析。
对比例2
血清样本处理处理方法和相关液相色谱条件参照实施例1，将色谱柱Waters BEHC18(2.1×100mm，1.7μm)修改为Unity C18(150mm×2.1mm,3μm)。
由图4可知，替换色谱柱以后，仅能检测出3-T1AM，3,5-T2AM，3,5-T2和3’,5’-T24种标志物，其他4种标志物无法被检测出。
实施例2风险评分模型构建
卷积神经网络由输入层、卷积层、残差卷积模块、池化层、全连接层以及输出层组成。
维卷积神经网络模型的输入变量维度为(length，1)，其中length代表选取甲状腺激素的数量。模型主体依次包括初始卷积层(init_conv)、残差卷积模块(res block)、一个全局池化层(Global Average Pooling)，一个全连接层(Dense)以及一个激活输出层(Sigmoid)。其中，conv为一维卷积操作，k代表卷积核的大小，filters代表卷积核的个数。BatchNorm为通过一定的规范化手段，把每层神经网络任意神经元这个输入值的分布强行拉回到均值为0方差为1的标准正太分布，使得梯度变大，避免梯度消失问题产生，加快训练速度。Sofplus函数为神经网络中常用的激活函数。其更接近脑神经元的激活模型。初始卷积层由conv(k＝4，filters＝64)、BatchNorm、Sofplus组成。卷积模块由BatchNorm、Sofplus、conv(k，filters)组成。残差卷积模块由conv_block(k＝1，filters1)，conv_block(k＝2，filters2)，conv_block(k＝1，filters3)三者组成，其中filters1、filters2、filters3，代表选取三种数量的卷积核。实验表明，利用上述设计的CNN分类模型，可以通过输入的甲状腺激素的含量的表达量精确判断病人是否为甲状腺癌。
根据神经网络代入前面所述的八种标志物构建的评分模型为：风险评分＝model(L-甲状腺原氨酸(T0)，3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)，3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)，3-碘-甲状腺原胺(3-3-T1AM)，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2),3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)，3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)中至少一个的表达水平)；当风险评分大于0.5时，受试者患有甲状腺癌的风险高；当风险评分小于0.5时，受试者还有甲状腺癌风险低。
实施例3风险评分模型的诊断效能检测
从三家三甲医院(多中心)总共获得600例甲状腺癌患者，300例甲状腺良性结节患者和300例正常人的血清。抽取300例甲状腺癌患者，150例甲状腺良性结节患者和150例正常人的血清作为训练集、余下血清做为测试集。
在训练集中，使用实施1中的检测方法和实施例2中的风险评分模型诊断受试者甲状腺结节恶性风险。结果显示，单个或多个标志物联合后可作为诊断甲状腺结节恶性风险的独立预后因子，形成的曲线下面积(AUC)均接近或大于0.9，如表11所示。在测试集中，使用实施1中的检测方法和实施例2中的风险评分模型诊断受试者甲状腺结节恶性风险。结果显示，单个或多个标志物联合后可作为诊断甲状腺结节恶性风险的独立预后因子，所形成的曲线下面积(AUC)均接近或高于0.9，如表11所示。其中，T0、3-T1、3-T1AM、3’-T1和3,3’-T2的ROC曲线图见图5-9所示。
表11不同标志物的效果数据
对比例3
通过对150例甲状腺癌患者，60例甲状腺良性结节患者和90例正常人的血清中的4碘-甲状腺原氨酸(T4)，3,3’,5-3碘-甲状腺原氨酸(T3)和3,3’,5’-3碘-甲状腺原氨酸(RT3)三种化合物作为单一的标志物进行检测发现，这三种指标在甲状腺癌组，良性甲状腺结节组和正常人三组之间均无显著差异(P>0.05)，如图10所示，这三种指标的作为诊断甲状腺结节恶性风险的单个标志物形成的曲线下面积(AUC)均只有0.5左右，说明其不能作为甲状腺癌诊断的血清标志物。由于，在图10中，T4、T3和RT3中训练集的ROC曲线图没有特异性，不作测试集测试。
对比例4
通过对150例甲状腺癌患者，60例甲状腺良性结节患者和90例正常人的血清中的3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)，3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)作为单个标志物进行检测发现，如图11所示，这三个标志物单独作为诊断甲状腺结节恶性风险的预后因子能力较弱，形成的曲线下面积(AUC)仅有0.7左右，作为诊断风险标志物的能力较弱。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.标志物在制备甲状腺癌的诊断试剂中的应用，其中，所述标志物为以下8个化合物中的一个或多个，该8个化合物的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂制成试剂盒。
3.一种甲状腺癌诊断试剂盒，其特征在于，包括所述标志物、检测中可接受的试剂和富集材料，所述标志物为权利要求1中8个化合物中的一个或多个。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括洗脱液、内标溶液和蛋白质沉淀剂，所述富集材料为SPE富集柱。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.01％～0.5％甲酸水溶液；洗脱液B：甲醇；
(2)校准品溶液：
将分别包含有500ng/mL L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的混合标准品溶液以空白血清基质溶液配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：
500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL；
(3)内标溶液：
包含有10ng/mL3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)的甲醇水溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与乙腈混合溶液；
(5)富集材料：
SPE富集柱；
(6)质控品：
含所述标志物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为上述混合标准品溶液以空白血清基质稀释至500倍；
QC(M)为上述混合标准品溶液以空白血清基质稀释至50倍；
QC(H)为上述混合标准品溶液以空白血清基质稀释至5倍。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％甲酸水溶液；洗脱液B：甲醇；
(2)校准品溶液：
将分别包含有500ng/mL L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的混合标准品溶液以空白血清基质溶液配制成九个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的九个浓度点为：
500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL和0.5ng/mL；
(3)内标溶液：
包含有10ng/mL3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸-13C6(3,3’,5-T3-13C6)的甲醇水溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与乙腈的体积比为1:2；
(5)富集材料：
HLB型号的SPE富集柱；
(6)质控品：
含所述标志物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为1ng/mL；
QC(M)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为10ng/mL；
QC(H)中包含：L-甲状腺原氨酸(T0)、3-碘-L-甲状腺原氨酸(3-T1)、3’-碘-L-甲状腺原氨酸(3’-T1)、3-碘-甲状腺原胺(3-T1AM)、3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,5-T2)、3’,5’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3’,5’-T2)、3,3’-二碘-L-甲状腺原氨酸(3,3’-T2)和3,5-二碘-L-甲状腺原胺(3,5-T2AM)的浓度分别为100ng/mL。
7.根据权利要求3-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，将内标溶液与蛋白质沉淀剂以体积比为1:9进行混合制备含内标的蛋白质沉淀剂，用于液相色谱串联质谱检测。
8.权利要求3所述的试剂盒在检测甲状腺癌中的应用。
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