CN114460188A - 检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒及测试方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒及测试方法，包含如下试剂：(1)校准品溶液：分为六种浓度的校准品，每种浓度的校准品中均含有三种儿茶酚胺的中间代谢物：甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3‑甲氧基酪胺，校准品浓度为10pg/mL～4000pg/mL；(2)质控品：包括质控品QCL、质控品QCM、质控品QCH；(3)内标液：包含3种儿茶酚胺的中间代谢物的甲醇溶液混合液；(4)缓冲液I，缓冲液II；(5)衍生液；(6)淋洗液；(7)洗脱液；(8)96孔净化板，96孔接收板；(9)96孔板盖膜。通过固相萃取后再衍生反应处理样品，提高了样品中儿茶酚胺中间代谢物的检测灵敏度。

Description

检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒及测试方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体地，涉及一种检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒及测试方法。

背景技术

儿茶酚胺(Catecholamine，CA)又称邻苯二酚胺，主要包括肾上腺素(Epinephrine，简称E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，简称NE)和多巴胺(Dopamine，简称DA)。儿茶酚胺是由肾上腺髓质、肾上腺神经元以及肾上腺外嗜铬体合成与分泌的单胺类神经递质，是具有较强的生理学活性的内源性物质，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用，不仅对人体的心血管系统、神经系统、内分泌系统、肾脏、平滑肌组织等的生理活动起着广泛的调节作用，还同时影响人体的代谢。NE、E和DA的中间代谢产物分别是甲氧基肾上腺素(Metanephrine，简称MN)、甲氧基去甲肾上腺素(Normetanephrine，简称NMN)和3-甲氧基酪胺(3-methoxytyramine，简称3-MT)。

血浆儿茶酚胺中间代谢物是正常生理过程中重要的信号介质，在血浆中的含量变化与许多病理过程息息相关。肾上腺嗜铬细胞瘤和肾上腺外交感副神经节瘤(PPGLs)是嗜铬细胞引起的肿瘤，80-85％的病人起源于肾上腺髓质(约有5％的肾上腺素偶发瘤为嗜铭细胞瘤)，10-20％则起源于腹部、骨盆和胸等肾上腺外交感神经组织，通常会分泌大量儿茶酚胺类物质，并随着分泌物质的数量、种类和形式不同而表现为不同的临床症状。该病与副交感神经性头颈副神经节瘤(PGL)的不同在于后者分泌儿茶酚胺类物质并不活跃。PPGLs的发病率为每年100万人中仅2-5例，而高血压患者中的比例为0.1-0.6％，但尸检报告中检出率却有0.05％，说明仍可能有许多人未检出。由于PPGLs的漏诊易导致严重的心血管事件，因此，该病的早期诊断尤为重要。肿瘤分泌释放NE和E可为阵发性并且可被多种酶水解为其代谢产物,MN及NMN仅在肾上腺髓质和PPGL瘤体内代谢生成并且以高浓度水平持续存在，被中华医学会内分泌分会推荐为诊断嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的特异标志物，所以检测MN和NMN能明显提高PPGL的诊断敏感性及降低假阴性率。对于MN和NMN结果高于上限3-4倍的患者几乎可确诊为PPGLs。少数PPGLs患者仅产生多巴胺，主要存在于肾上腺外组织，可检测血浆或血浆中的多巴胺代谢物3-甲氧酪胺(3-MT)水平。

此外体外定量检测人血浆中的儿茶酚胺中间代谢物，用作继发性和内分泌性高血压辅助诊断。血浆中儿茶酚胺类物质含量的增加会导致偶发性或持续性高血压，并经常导致心悸、心律失常、头痛、出汗、抑郁、焦虑、震颤和恶心的间歇性发作，同时会导致阻塞性睡眠呼吸暂停综合症。

儿茶酚胺及代谢产物的检测经历了多种方法,这些传统方法都有其固有的缺点：生物分析法、比色法，灵敏度较低；荧光法，易受其他内源性化合物干扰；放射酶法，操作繁琐；化学发光法，检测灵敏度不能满足临床检验需要；而液相色谱与电化学联用(LC-ECD)，虽然灵敏度和选择性高，但耗时较长，而且易受到多种物质干扰。随着现代质谱技术的快速发展，色谱串联质谱因其灵敏度高，特异度强，能进行大量样本的快速测试，目前已成为检测儿茶酚胺中间代谢产物的主要方法并被最新的指南和共识所推荐。根据样品前处理方法的不同，主要分为衍生和非衍生两类。衍生不仅可以提高儿茶酚胺代谢物的稳定性，而且可以提高检测灵敏度。目前现有技术中主要使用的衍生剂包括丹磺酰氯和异硫氰酸苯酯。本发明采用一种使用乙醛作为衍生剂的衍生方法，本发明提供的试剂盒及方法对人血浆中儿茶酚胺中间代谢物的测量样品前处理具有检测范围宽、特异性强和灵敏度高等优点。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒及测试方法。

本发明的目的是通过以下方案实现的：

本发明的第一方面提供一种检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒，包含如下试剂：

(1)校准品溶液：分为六种浓度的校准品，每种浓度的校准品中均含有三种儿茶酚胺的中间代谢物：甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧基酪胺，校准品的浓度范围为10pg/mL～4000pg/mL；

(2)质控品：包括质控品QCL，质控品QCM和质控品QCH；

(3)内标液：包含三种儿茶酚胺中间代谢物的甲醇溶液混合液，内标液中三种儿茶酚胺中间代谢物的浓度均为50ng/mL；

(4)缓冲液I；

(5)缓冲液II；

(6)衍生液；

(7)淋洗液；

(8)洗脱液；

(9)96孔净化板；

(10)96孔接收板；

(11)96孔板盖膜。

优选地，所述试剂盒还包括流动相A：0.1-0.5％甲酸水溶液；流动相B：80-90％甲醇水溶液或纯甲醇。

优选地，三种儿茶酚胺中间代谢物在六种校准品中的浓度分别为，校准品1中浓度均为10pg/mL；校准品2中浓度均为25pg/mL；校准品3中浓度均为75pg/mL；校准品4中浓度均为300pg/mL；校准品5中浓度均为1000pg/mL；校准品6中浓度均为4000pg/mL。

优选地，所述缓冲液I包括0.02M磷酸钠、0.2M氯化钠、3g/L氰基硼氢化钠，pH 7-9；所述缓冲液II为1M醋酸钠溶液，pH 5-7。

优选地，所述衍生液为20％的乙醛溶液。

优选地，所述淋洗液为90％-100％的异丙醇。

优选地，所述洗脱液为含0.1％-10％甲酸的异丙醇。

优选地，所述96孔净化板为弱阳离子交换固相萃取板。

优选地，所述96孔接收板为体积1mL的接收板。

优选地，所述96孔板盖膜为厚度0.002英寸的特氟龙盖膜。

所述试剂盒中还包括进样器洗涤液和反应瓶，所述进样器洗涤液为50-80％甲醇水溶液。

优选地，所述质控品QCL的浓度为30pg/mL，质控品QCM的浓度为400pg/mL，质控品QCH的浓度为3600pg/mL。

优选地，校准品溶液的制备方法如下：校准品溶液的制备方法如下：使用经过活性炭处理的含6.34mg/mL焦亚硫酸钠的人血浆，配制含4000pg/mL的3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液，得到校准品6，后面使用经过活性炭处理的含6.34mg/mL焦亚硫酸钠的人血浆依次稀释得到1000pg/mL的校准品5，300pg/mL的校准品4，75pg/mL的校准品3，25pg/mL校准品2以及10pg/mL的校准品1。

优选地，质控品的制备方法如下：用健康人血浆或经过活性炭处理的人血浆配制浓度为3600pg/mL3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液为质控品QCH；将QCH用健康人血浆或经过活性炭处理的人血浆稀释得到400pg/mL的质控品QCM；再将质控品QCM稀释得到30pg/mL的QCL。

优选地，内标液的配制方法如下：

使用5％的1M盐酸甲醇溶液稀释盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3、盐酸甲氧基肾上腺素-D3和盐酸3-甲氧基酪胺-D4内标母液，然后混合得到内标液，这三种儿茶酚胺中间代谢物的浓度均为50ng/mL。

本发明的第二方面提供一种采用上述所述的试剂盒进行人血浆儿茶酚胺中间代谢物的检测方法，包括如下步骤：

(1)处理试剂；

将试剂盒中六种浓度的校准品冻干粉、质控品QCL冻干粉、质控品QCM冻干粉和质控品QCH冻干粉中分别加入超纯水，室温静置待冻干材料溶解，轻轻涡旋振荡并倒置校准品瓶、质控品瓶，直到混匀；

(2)固相萃取：将内标溶液、PBS溶液，加入反应试管中涡旋混合；加样本或者校准品或者质控品到反应试管中，涡旋震荡混匀；用甲醇和超纯水依次平衡96孔净化板；转移稀释后的样本或校准品或质控品至96孔净化板，在重力作用下等待，然后用正压装置加压，保持3-5秒每滴的速度；用超纯水淋洗96孔净化板，重复该步骤一次；用淋洗液淋洗96孔净化板；用洗脱液洗脱96孔净化板至96孔进样板中，将洗脱液用氮气吹至近干。

(3)衍生反应；

在96孔进样板中加入缓冲液I、缓冲液II和衍生液，涡旋震荡混匀，置于37-60℃温浴5-40分钟；

(4)超高效液相色谱分离；

流动相A为0.1-0.5％V/V甲酸水溶液，流动相B为80-90％甲醇水溶液；

采用梯度淋洗的方式进行分离；

(5)质谱检测

在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数。

(6)建立校准曲线：以标准物的浓度为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，得到线性拟合方程；

(7)计算待测样本中儿茶酚胺中间中间代谢物的浓度：将待测样本与内标物峰面积的比值带入对应的线性拟合方程中，计算得到待测样本中儿茶酚胺中间中间代谢物的浓度。

优选地，步骤(3)中，分离流速及梯度如下：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为85:15；在1.5-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至15:85；在0-5.0分钟内，流速为0.4mL/min。在5-5.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持不变，流速由0.4mL/min上升为0.6mL/min。在5.1-6.0分钟内，流速保持为0.6mL/min，流动相A和流动相B的体积比保持为15:85；在6-6.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由15:85匀速渐变至85:15，流速由0.6mL/min下降为0.4mL/min；在6.1-8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为85:15，流速保持0.4mL/min。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、通过衍生反应处理样品，将儿茶酚胺中间代谢物衍生从而将分析物的氨基还原成乙基，有利于分析物离子化而提高了离子检测的灵敏度，使得甲氧基肾上腺素和3-甲氧基酪胺最低定量限达到2pg/mL，甲氧基去甲肾上腺素最低定量限在4pg/mL。解决了样品中儿茶酚胺中间代谢物浓度低难检测的问题，提高了样品中儿茶酚胺中间代谢物的检测灵敏度。

2、采用超高效液相色谱-串联质谱方法检测儿茶酚胺中间中间代谢物，该方法同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测。(1)特异性高，可以极大的避免交叉反应的干扰，从而提高准确度。(2)采用同位素内标法定量，可以极大的消除基质效应，能够达到准确定量。(3)超高效液相色谱-串联质谱可以直接检测儿茶酚胺中间中间代谢物，测试结果可比性强。(4)高通量，可同时检测儿茶酚胺中间代谢物共3种物质。

3、校准品和质控品采用冻干工艺制成干粉，有利保证保存有效期内校准品和质控品性能稳定，保证结果准确性。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为甲氧基肾上腺素校准品与内标的离子流色谱图；

图2为甲氧基去甲肾上腺素校准品与内标的离子流色谱图；

图3为3-甲氧基酪胺校准品与内标的离子流色谱图

图4为甲氧基肾上腺素的校准曲线；

图5为甲氧基去甲肾上腺素的校准曲线；

图6为3-甲氧基酪胺的校准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

一种超高效液相色谱串联质谱检测人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的试剂盒，包含如下试剂(以96份测试样为例)：

(1)流动相A：180mL 0.1％甲酸水溶液

(2)流动相B：160mL 85％甲醇水溶液；

(3)校准品溶液：6瓶，分别为6种浓度的100μL校准品溶液。使用经过活性炭处理的含6.34mg/mL焦亚硫酸钠的人血浆，配制含4000pg/mL的3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液，得到校准品6，后面使用经过活性炭处理的含6.34mg/mL焦亚硫酸钠的人血浆依次稀释得到1000pg/mL的校准品5，300pg/mL的校准品4，75pg/mL的校准品3，25pg/mL校准品2以及10pg/mL的校准品1。在储存过程中，可以将校准品溶液冻干成冻干粉，使用时加0.1mL超纯水配置。

(4)质控品：3瓶，分别为100μL的质控品QCL(30pg/mL)，质控品QCM(400pg/mL)和质控品QCH(3600pg/mL)冻干粉；均包含儿茶酚胺中间代谢物基质溶液冻干粉。

(5)内标液：1瓶，包含3种儿茶酚胺中间代谢物的甲醇溶液混合液，内标液中盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3、盐酸甲氧基肾上腺素-D3和盐酸3-甲氧基酪胺-D4内标的浓度均为50ng/mL。

(6)缓冲液I：1瓶，包括0.02M磷酸钠、0.2M氯化钠、3g/L氰基硼氢化钠，pH 7；

(7)缓冲液II：1瓶，包括1M醋酸钠溶液(pH 6)；

(8)衍生液：1瓶，20％的乙醛水溶液；

(9)淋洗液：1瓶，异丙醇；

(10)洗脱液：1瓶，含0.1％-10％甲酸的异丙醇；

(11)进样器洗涤液：1瓶，为50％甲醇水溶液；

(12)96孔净化板：为弱阳离子交换固相萃取板，1块；

(13)96孔接收板：为体积1mL的接收板；1块；

(14)96孔板盖膜：为厚度0.002英寸的特氟龙盖膜；1块。

校准品溶液的制备方法如下：使用经过活性炭处理的含6.34mg/mL焦亚硫酸钠的人血浆，配制含4000pg/mL的3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液，得到校准品6，后面使用经过活性炭处理的含6.34mg/mL焦亚硫酸钠的人血浆依次稀释得到1000pg/mL的校准品5，300pg/mL的校准品4，75pg/mL的校准品3，25pg/mL校准品2以及10pg/mL的校准品1。

质控品的制备方法如下：用健康人血浆或经过活性炭处理的人血浆配制浓度为3600pg/mL3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液为质控品QCH；将QCH用健康人血浆或经过活性炭处理的人血浆稀释得到400pg/mL的质控品QCM；再将质控品QCM稀释得到30pg/mL的QCL。

内标液的配制方法如下：使用5％的1M盐酸甲醇溶液稀释盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3、盐酸甲氧基肾上腺素-D3和盐酸3-甲氧基酪胺-D4内标母液，然后混合得到内标液，这三种儿茶酚胺中间代谢物的浓度均为50ng/mL。

采用上述试剂盒进行人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的检测方法，包括如下步骤：

(1)从冰箱中取出试剂盒中所有的试剂，开始处理试剂；

将试剂盒中六种浓度的校准品冻干粉、质控品QCL、质控品QCM和质控品QCH冻干粉中分别用容量吸管或精密吸管添加0.1mL超纯水，室温静置10min，待冻干材料溶解，轻轻涡旋振荡并倒置校准品瓶、质控品瓶，直到混匀。

(2)固相萃取：将10μL内标溶液、600μLPBS溶液，涡旋混合30秒于反应试管中；加400μL样本或者校准品或者质控品到反应试管中，涡旋震荡混匀30秒；用500μL甲醇和500μL超纯水依次平衡96孔净化板；转移900μL稀释后的样本或校准品或质控品至96孔净化板，在重力作用下等待10分钟，然后用正压装置加压，保持3-5秒每滴的速度；用500μL超纯水淋洗96孔净化板，重复该步骤一次；用500μL淋洗液淋洗96孔净化板；用400μL洗脱液洗脱96孔净化板至96孔进样板中，将洗脱液用氮气吹至近干。

(3)衍生反应；

加入20μL缓冲液I、20μL缓冲液II和20μL衍生液至96孔进样板中，涡旋震荡10秒混匀，置于37℃温浴30分钟，然后上样检测，液相色谱串联质谱仪为上海睿康生物科技有限公司的RZ-500系列；

(4)超高效液相色谱分离；

超高效液相色谱条件：

流动相A为0.1％V/V甲酸水溶液，流动相B为85％甲醇溶液；

色谱柱型号：Thermo Fisher PFPP 2.6μm 100x2.1mm

采用梯度淋洗的方式，流速及梯度见表1。

表1，高效液相色谱分离流速及梯度

时间(分钟)	流速(mL/min)	A％	B％
				0	0.4	85	15
1.5	0.4	85	15
				5	0.4	15	85
5.1	0.6	15	85
				6	0.6	15	85
6.1	0.4	85	15
				8	0.4	85	15

(5)质谱检测

质谱条件：在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测(MRM)的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数。参数条件是：喷雾电压为1500V，碰撞气为1.5mTorr，离子源温度为400℃，离子转移管的温度为325℃，鞘气60Arb，辅助气3Arb，反吹气0Arb。

表2、各个目标物的保留时间，MRM检测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数*

*除MRM监测离子对(m/z)是固定的以外，保留时间(min)、碰撞能(V)和射频聚焦电压(V)根据选用的色谱柱和不同的质谱仪需要优化调整。

(6)建立校准曲线：采用同位素内标定量法，以标准物的浓度为x轴，以标准物与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线。儿茶酚胺中间中间代谢物(图4至图6)在各自浓度范围内的线性拟合方程线性良好，相关系数在0.99以上。

(7)计算待测样本中儿茶酚胺中间代谢物的浓度：将待测样本与内标物峰面积的比值带入对应的线性拟合方程中，计算得到待测样本中儿茶酚胺中间代谢物的浓度。

试剂盒的测试性能结果：

1、离子流色谱图：

Thermo Vanquish HPLC串联上海睿康生物RZ-500质谱仪。超高效液相色谱条件：流动相A为0.1％V/V甲酸水溶液，流动相B为85％甲醇溶液；色谱柱型号：Thermo FisherPFP 2.6μm 150x2.1mm。质谱条件：在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测(MRM)的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数。参数条件是：喷雾电压为1500V，碰撞气为1.5mTorr，离子源温度为400℃，离子转移管的温度为325℃,鞘气60Arb，辅助气3Arb，反吹气0Arb。

儿茶酚胺及其中间代谢物的标准品和血浆的峰型比较对称，没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到很好的检测。图1至图3为儿茶酚胺中间代谢物的校准品和内标的离子流色谱图。

2、最低定量限

使用上海睿康生物科技有限公司超高效液相色谱串联质谱检测系统(RZ-500)时，试剂盒最低定量限为甲氧基肾上腺素和3-甲氧基酪胺最低定量限达到2pg/mL，甲氧基去甲肾上腺素最低定量限在4pg/mL，质谱检测器信噪比(S/N)大于10。最低定量限说明本试剂盒的检测灵敏度高。

3、精密度试验：

用高浓度质控品QCH和低浓度质控品QCL测试试剂盒，重复测试10次(n＝10)，分别计算测量值的平均值

和标准差(S)。按公式(1)(2)计算变异系数(CV)，所得结果应符合临床化学体外诊断试剂(盒)国家标准(GB/T 26124—2011)的要求。

其中CV：变异系数；S：标准差；

测量值的平均值；n:测量次数。得到本试剂盒的重复性和批间紧密度如下：

重复性：CV≤15％；批间精密度：相对极差(R)≤20％。

4、准确度

选择甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧基酪胺本底值为零的人工合成血浆为基础样本，在基础样中加入一定量体积的上海睿质科技有限公司公司儿茶酚胺中间代谢物一级校准品6(J6)(校准品体积与人工血浆体积比为1:9，以避免产生基质变化，加入校准品后样品总浓度必须在试剂检测范围内)，每个浓度样本重复检测3次，每次测试结果按公式(3)计算回收率。

R：回收率

V：加入标准溶液的体积

V₀：加入合成血浆的体积

C：合成血浆与标准溶液混合后测定浓度

C₁：标准溶液的浓度

C₀：合成血浆的浓度。

试验中使用不含儿茶酚胺中间代谢物的空白血清(脱碳)样本，向空白血清中分别添加低浓度和中浓度的儿茶酚胺中间代谢物标液，每个浓度配制6个平行样，按前述样本前处理步骤去试验处理后上质谱仪检测，得到数据见表3。

用回收率(％)表示测定结果的准确度，回收率在85％-115％范围内。

表3：空白血清添加回收率和精密度

由表3可知，样品检测的精密度和准确度均良好。(回收率在85％-115％范围内，CV＜15％)

临床样本的检测

选取10份正常人的血清样本，按前述样本前处理的步骤去实验处理后上质谱仪检测，得到数据见表4。

表4、10个人血浆样品儿茶酚胺中间中间代谢物测量值(ng/mL)

人血浆	3-MT	MN	NMN
				样品1	＜10	27.5	31.6
样品2	＜10	36.0	61.1
				样品3	14.04	11.3	26.5
样品4	＜10	27.5	45.0
				样品5	＜10	16.2	76.1
样品6	16.78	28.6	75.6
				样品7	＜10	20.9	29.8
样品8	11.8	40.4	136.2
				样品9	＜10	52.4	143.5
样品10	＜10	24.8	66.1
				参考范围	＜18.4	＜98.5	＜165

由表4可知，用此方法检测的正常人血清中儿茶酚胺中间代谢物的结果均在参考范围内。

本发明利用衍生的方法使用乙醛在衍生缓冲液乙酸钠和氰基硼氢化钠中将人血浆中的儿茶酚胺中间代谢物生成稳定的衍生物，然后通过超高效液相色谱进行衍生后样品分离，进入质谱检测。利用6个系列已知浓度的3种儿茶酚胺中间代谢物标准品和内标，建立校准曲线，从而计算人血浆中3种儿茶酚胺中间代谢物的浓度。该检测方法通过精准检测血浆中的儿茶酚胺中间代谢物的水平，对诊断来源于神经嵴的神经内分泌肿瘤如嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤和副神经节瘤等患者的诊断和鉴别诊断，以及疾病的发展过程、疗效和预后评估具有十分重要的意义，从而为患者提供个性化的诊断治疗信息。

采用本发明的试剂盒及检测方法，需要对分析样品进行固相萃取，然后进行衍生反应，反应试剂和反应条件简单，且衍生反应后样品可以直接进样分析，分析的灵敏度更高。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (10)

1.一种检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒，其特征在于，包含如下试剂：

(1)校准品溶液：分为六种浓度的校准品，每种浓度的校准品中均含有三种儿茶酚胺的中间代谢物：甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧基酪胺，校准品的浓度范围为10pg/mL～4000pg/mL；

(2)质控品：包括质控品QCL，质控品QCM和质控品QCH；

(3)内标液：包含三种儿茶酚胺中间代谢物的甲醇溶液混合液，内标液中3种儿茶酚胺中间代谢物的浓度均为50ng/mL；

(4)缓冲液I；

(5)缓冲液II；

(6)衍生液；

(7)淋洗液；

(8)洗脱液；

(9)96孔净化板；

(10)96孔接收板；

(11)96孔板盖膜。

2.根据权利要求1所述的检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒，其特征在于，三种儿茶酚胺中间代谢物在六种校准品中的浓度分别为，校准品1中浓度均为10pg/mL；校准品2中浓度均为25pg/mL；校准品3中浓度均为75pg/mL；校准品4中浓度均为300pg/mL；校准品5中浓度均为1000pg/mL；校准品6中浓度均为4000pg/mL。

3.根据权利要求1所述的检测人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括流动相A：0.1-0.5％甲酸水溶液；流动相B：80-90％甲醇水溶液或纯甲醇。

4.根据权利要求1所述的检测人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液I包括0.02M磷酸钠、0.2M氯化钠、3g/L氰基硼氢化钠，pH 7-9；所述缓冲液II为1M醋酸钠溶液，pH 5-7。

5.根据权利要求1所述的检测人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述衍生液为20％的乙醛溶液。

6.根据权利要求1所述的检测人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述质控品QCL的浓度为30pg/mL，质控品QCM的浓度为400pg/mL，质控品QCH的浓度为3600pg/mL。

7.根据权利要求1或2所述的检测人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的试剂盒，其特征在于，校准品溶液的制备方法如下：使用经过活性炭处理的含6.34mg/mL焦亚硫酸钠的人血浆，配制含4000pg/mL的3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液，得到校准品6，后面使用经过活性炭处理的含6.34mg/mL焦亚硫酸钠的人血浆依次稀释得到1000pg/mL的校准品5，300pg/mL的校准品4，75pg/mL的校准品3，25pg/mL校准品2以及10pg/mL的校准品1。

8.根据权利要求1所述的检测人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的试剂盒，其特征在于，质控品的制备方法如下：用健康人血浆或经过活性炭处理的人血浆配制浓度为3600pg/mL的3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液为质控品QCH；将QCH用健康人血浆或经过活性炭处理的人血浆稀释得到400pg/mL的质控品QCM；再将质控品QCM稀释得到30pg/mL的QCL。

9.根据权利要求1所述的检测人血浆儿茶酚胺中间中间代谢物的试剂盒，其特征在于，内标液的配制方法如下：

使用5％的1M盐酸甲醇溶液稀释盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3、盐酸甲氧基肾上腺素-D3和盐酸3-甲氧基酪胺-D4内标母液，然后混合得到内标液，这三种儿茶酚胺中间代谢物的浓度均为50ng/mL。

10.一种采用权利要求1至9任一项所述的试剂盒进行人血浆儿茶酚胺中间代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)处理试剂；

将试剂盒中六种浓度的校准品冻干粉、质控品QCL冻干粉、质控品QCM冻干粉和质控品QCH冻干粉中分别加入超纯水，室温静置待冻干材料溶解，轻轻涡旋振荡并倒置校准品瓶、质控品瓶，直到混匀；

(2)固相萃取：将内标溶液、PBS溶液，加入反应试管中涡旋混合；加样本或者校准品或者质控品到反应试管中，涡旋震荡混匀；用甲醇和超纯水依次平衡96孔净化板；转移稀释后的样本或校准品或质控品至96孔净化板，在重力作用下等待，然后用正压装置加压，保持3-5秒每滴的速度；用超纯水淋洗96孔净化板，重复该步骤一次；用淋洗液淋洗96孔净化板；用洗脱液洗脱96孔净化板至96孔进样板中，将洗脱液用氮气吹至近干；

(3)衍生反应；

在96孔进样板中加入缓冲液I、缓冲液II和衍生液，涡旋震荡混匀，置于37-60℃温浴5-40分钟；

(4)超高效液相色谱分离；

流动相A为0.1-0.5％V/V甲酸水溶液，流动相B为80-90％甲醇水溶液；

采用梯度淋洗的方式进行分离；

(5)质谱检测

在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数；

(6)建立校准曲线：以标准物的浓度为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，得到线性拟合方程；

(7)计算待测样本中儿茶酚胺中间代谢物的浓度：将待测样本与内标物峰面积的比值带入对应的线性拟合方程中，计算得到待测样本中儿茶酚胺中间代谢物的浓度。

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