CN114814044B

CN114814044B - 一种检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法

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Publication number: CN114814044B
Application number: CN202210682031.4A
Authority: CN
Inventors: 刘春冉; 贾永娟; 张�杰; 倪君君
Original assignee: Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Current assignee: Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Priority date: 2022-02-24
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2024-03-01
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN114814044A

Abstract

本公开涉及一种检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将内标工作液与至少三种含有不同浓度的儿茶酚胺及其代谢物的标准工作液混合，制备至少三种标准溶液；所述儿茶酚胺及其代谢物为去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3‑甲氧基酪胺；(2)利用LC‑MS/MS对标准溶液进行检测，并分别建立上述六种化合物的标准曲线；(3)对待测样品进行检测，同时利用步骤(2)建立的标准曲线确定待测样品中上述六种化合物各自的含量。本公开提供的检测方法能够快速且准确地检测儿茶酚胺及其代谢物的含量，检测的准确性和灵敏度较高。

Description

一种检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法

技术领域

本公开涉及化合物检测技术领域，尤其涉及一种检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法，特别是一种LC-MS/MS检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法。

背景技术

嗜铬细胞瘤起源于肾上腺髓质，副神经节瘤是起源于肾上腺外的交感神经链，均为具有激素分泌功能的神经内分泌肿瘤，主要合成、分泌和释放大量儿茶酚胺，包括去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)和多巴胺(DA)等，引起血压升高、代谢改变等一系列临床症候群，造成心、脑、肾、血管等重要器官损害，甚至成为死亡的主要原因。目前，带有嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)的患者通常临床表现不典型，甚至有些无症状，即使有高血压，血压升高的表现也是多种多样的，但是若PPGL肿瘤突然分泌大量儿茶酚胺，则会出现血压骤升甚至高血压危象，严重可能导致死亡，目前对于PPGL的检测，首选对变肾上腺素(MN)进行定性诊断试验，但仍建议检测血或尿中的去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺及其他代谢产物，同时，检测3-甲氧基酪胺(3-MT)可提高诊断头颈部PPGL的灵敏度；而血浆中多巴胺和3-MT浓度明显增高则高度提示转移性肿瘤。

儿茶酚胺物质的化学结构特点是：带有一个双羟基苯核和一个带氨基的侧链，多数文献报道实际生物样品中儿茶酚胺含量极微，且活性的稳定性极差，极易氧化，此外加上生物样品中同时存在的各种结构相似和/或带有相同化学基团的代谢产物的内源性化学干扰物，导致了生物样本中儿茶酚胺浓度精确测定的困难，高选择性且高灵敏度地测定生物样本中某一种特定的儿茶酚胺类物质，例如精确同时测定血浆中儿茶酚胺及其代谢物，是目前尚难以达到的目标。

因此，提供一种前处理方法简单，且能够对儿茶酚胺及其代谢物含量快速准确测量、精确定量，且灵敏度高的方法是目前迫切需要的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本公开提供了一种检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法。

第一方面，本公开提供了一种检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将内标工作液与含有儿茶酚胺及其代谢物的标准工作液混合，得到标准溶液，所述标准工作液包括至少三个浓度梯度；

所述儿茶酚胺及其代谢物为去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)、去甲变肾上腺素(NMN)、变肾上腺素(MN)和3-甲氧基酪胺(3-MT)；

(2)利用LC-MS/MS对标准溶液进行检测，并分别建立上述六种化合物的标准曲线；

(3)对待测样品进行检测，同时利用步骤(2)建立的标准曲线确定待测样品中上述六种化合物各自的含量。

本公开提供的方法能够同时实现去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺六种物质的检测，无需重复制样，能够缩短检测时间，提高检测效率。

在本公开中，在LC-MS/MS检测中，使用的色谱分析柱为Waters HSS PFP(2.1×100，2.5μm)、phenomenex F5(4.6×100，2.6μm)。

在本公开中，在LC-MS/MS检测中，液相色谱参数包括：

色谱柱流动相：A为含有0.1-0.5v/v％甲酸、5-10mM甲酸铵或乙酸铵的水溶液，B为甲醇含有0-0.5v/v％甲酸、0-10mM甲酸铵或乙酸铵的甲醇溶液；

梯度洗脱为：

0.00-2.50min：A 98-100％，B 0-2％；

2.01-4.50min：A 60-90％，B 10-40％；

3.51-6.50min：A 98-100％，B 0-2％；

流速：0.3-0.6mL/min，分析时间为5.50-6.50min，优选5.50min。

在本公开提供的梯度洗脱条件中，对于0.00-2.50min和2.01-4.50min对应的梯度洗脱条件，本领域技术人员须知，其并不是指二者存在时间上的交叉，而是指对于2.01-2.50min，A相占比既可以为98-100％，也可以选择60-90％，选择其一并对应性的调整B相即可。同理，对于3.51-4.50min对应的洗脱条件也作此理解。

在本公开中，在LC-MS/MS检测中，质谱参数包括：

离子源温度：500-600℃；气帘气1：10-30L/min；碰撞气1：6-10L/min；IS电压：1500-3000V；干燥气1：45-60L/min；干燥气2：15-40L/min。

对于6种待测物，尤其是肾上腺素和去甲变肾上腺素，二者为同分异构体，难以实现有效分离；而本公开通过采用特定的色谱柱配合特定的流动相和梯度洗脱条件，能够实现6种化合物的有效分离，尤其是肾上腺素和去甲变肾上腺素，本公开的液相色谱条件能够实现二者的有效分离，不会相互产生干扰，进而能够确保检测结果的准确性；本公开公开的液相色谱条件(色谱柱、流动相和梯度洗脱条件)缺一不可。

为了能够尽可能的缩短检测的前期准备工作，提供一种简单的前处理方法，在本公开中，所述待测样品的制备方法包括：

取血浆或血清、内标工作液和pH缓冲液混合，混合液利用固相萃取柱进行萃取，取洗脱液作为待测样品。

作为本公开的一种优选技术方案，所述血浆选自EDTA血浆或者肝素锂血浆，优选为肝素锂血浆。本公开所述的肝素锂血浆指的是：将血液置于肝素锂真空抗凝采血管中，然后进行离心，得到的肝素锂血浆。

本公开特异性的优选肝素锂血浆进行后续处理检测，相比于其他血浆，例如EDTA血浆，在肝素锂血浆中，儿茶酚胺的三种化合物(肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA))的稳定性较优，能够进一步确保检测结果的准确性。

作为本公开的一种优选技术方案，所述血浆或血清与pH缓冲液的体积比1:(1-2.5)，优选1:1.5，所述血浆或血清与内标工作液的体积比(20-35):1优选20:1，所述pH缓冲液为甲酸铵溶液或乙酸铵溶液。

作为本公开的一种优选技术方案，所述肝素锂抗凝血浆的含量为200μL，本公开能够将血浆采样量从300μL降至200μL，且不影响检测结果的准确性。

作为本公开的一种优选技术方案，所述混合的方式为旋涡振荡混合。

作为本公开的一种优选技术方案，所述利用固相萃取柱进行萃取的方法包括：

对固相萃取柱进行活化，然后将混合液转移至活化后的固相萃取柱，利用洗涤剂进行洗涤，最后利用洗脱液进行洗脱，取洗脱液作为待测样品。

作为本公开的一种优选技术方案，所述洗涤剂为水和乙腈，所述洗脱液为浓度为0.5-1v/v％的甲酸水溶液，所述固相萃取柱利用甲醇和浓度为2v/v％的甲酸水溶液进行活化。

本公开发现，在最后利用0.5-1v/v％的甲酸水溶液进行洗脱时，固相萃取柱(SPE柱)中会出现对目标物(尤其是多巴胺)具有较大干扰的杂质，进而影响对目标物的准确定量，因此，本公开特异性的优选在活化时，先利用2％的甲酸水对固相萃取柱进行活化清洗，能够去除杂质，避免后续测试的干扰。

在目前的对儿茶酚胺或其代谢物进行样本前处理时，使用的SPE小柱为WCX即混和弱阳离子交换柱，均是采用大比例有机相进行洗脱，然后对洗脱液进行氮气吹干复溶之后再进行上机分析，而本公开特异性的采用0.5％的甲酸水溶液作为洗脱液，既保证目标物的有效洗脱又可以简化前处理步骤。

作为本公开的一种具体实施方式，所述利用固相萃取柱进行萃取的方法包括：

首先用200μL甲醇和200μL甲酸含量为2％的水溶液活化SPE柱，再将混合液(优选肝素锂血浆、内标工作液和乙酸铵溶液的混合液)转移至SPE柱，依次用200μL水和200μL乙腈进行洗涤，洗涤结束之后用大气流吹2-3min，最后加入100μL洗脱液(甲酸含量为0.5％的水溶液)进行洗脱。

作为本公开的一种优选技术方案，所述内标工作液中含有去甲肾上腺素-d6、肾上腺素-d3、多巴胺-d5、去甲变肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3和3-甲氧基酪胺-d4。

作为本公开的一种优选技术方案，所述标准溶液的制备方法包括：将内标工作液、含有儿茶酚胺及其代谢物的标准工作液和甲酸水溶液混合，得到所述标准溶液，所述标准工作液包括至少三个级别浓度，优选包括八个级别浓度；

各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由中间液稀释得到，所述中间液利用稀释剂由母液稀释得到，所述母液利用溶剂溶解所述儿茶酚胺及其代谢物各自的标准品得到。

作为本公开的一种优选技术方案，所述标准工作液的制备方法包括：

分别将去甲肾上腺素盐酸盐、肾上腺素、多巴胺盐酸盐、去甲变肾上腺素盐酸盐、变肾上腺素盐酸盐或3-甲氧基酪胺盐酸盐与甲酸含量为0.5％的甲酸水溶液混合、定容，得到分别含有六种化合物的母液。

作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释剂为甲醇和水的体积比为1:(0-1)的甲醇水溶液，优选为浓度为0.04％的甲酸水溶液。

在制备六种化合物的母液时，本公开特异性的选择了甲酸含量为0.5％的甲酸水溶液作为溶剂，能够使化合物很快且充分溶解的同时，保持优异的稳定性，制备的母液在放置3个月以上不浑浊、不沉淀，可以随用随取，避免了在检测时现用现配而导致检测时间过长的缺陷。

若选用水或者甲酸含量在0.5％以下的甲酸水溶液作为溶剂，溶解性较差，需要较长时间或者借助超声等条件进行充分溶解，甚至存在部分不溶解的现象；若选用0.1M的盐酸溶液，虽然能够很快溶解，但是得到的母液稳定性较差，不能够较长时间存储。

在进行稀释时，特异性的选用了0.04％的甲酸水溶液，其与0.5％的甲酸水溶液进行配合得到标准工作液，能够使儿茶酚胺及其代谢物的标曲工作稳定性至少达到9个月以上，采用0.04％的甲酸水溶液既可以在保证准确度又可以减少甲酸的用量，降低成本。

对于本公开提供的去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺六种物质的检测。

去甲肾上腺素在62.50pg/mL到4000.00pg/mL范围内，线性良好，相关系数R²＞0.999；

肾上腺素在15.63pg/mL到1000.00pg/mL范围内，线性良好，相关系数R²＞0.999；

多巴胺在10.00pg/mL到640.00pg/mL范围内，线性良好，相关系数R²＞0.999；

去甲变肾上腺素在15.63pg/mL到1000.00pg/mL范围内，线性良好，相关系数R²＞0.999；

变肾上腺素在12.50pg/mL到800.00pg/mL范围内，线性良好，相关系数R²＞0.999；

3-甲氧基酪胺在6.25pg/mL L到400.00pg/mL范围内，线性良好，相关系数R²＞0.999。

在本公开提供的方法中，前处理条件步骤简单，能够在较短时间内完成多个样本的前处理，一般能够在1h内完成96个样本的前处理，前处理效率高，并且使用的试剂配制简单，对检测人员的要求较低，可操作性极强，能够进行大规模应用。

在本公开中，所述的甲酸含量为体积含量。

本公开实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

(1)本公开提供的母液能够长时间存储，避免了现用现配，节约了检测时间，提高了检测效率；

(2)本公开提供的检测方法能够同时检测肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺六种物质的含量，在本公开提供的检测条件下，六种物质均能够有效分离，不互相干扰，能够确保检测的准确性，且检测灵敏度较高；

(3)本公开提供的方法检测时间短，分析时间仅为5.5min，1h内能够同时分析10个样本，分析时间短，成本低。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。

为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为血浆样本的色谱图；

图2为标准溶液中的去甲肾上腺素的色谱图；

图3为标准溶液中的去甲肾上腺素-d6的色谱图；

图4为标准溶液中的肾上腺素的色谱图；

图5为标准溶液中的肾上腺素-d3的色谱图；

图6为标准溶液中的多巴胺的色谱图；

图7为标准溶液中的多巴胺-d5的色谱图；

图8为标准溶液中的去甲变肾上腺素的色谱图；

图9为标准溶液中的去甲变肾上腺素-d3的色谱图；

图10为标准溶液中的变肾上腺素的色谱图；

图11为标准溶液中的变肾上腺素-d3的色谱图；

图12为标准溶液中的3-甲氧基酪胺的色谱图；

图13为标准溶液中的3-甲氧基酪胺-d4的色谱图；

图14为实施例7提供的检测条件得到的血浆样本的色谱图；

图15为对比例5提供的检测条件得到的血浆样本的色谱图；

图16为对比例6提供的检测条件得到的血浆样本的色谱图；

图17为对比例7提供的检测条件得到的血浆样本的色谱图一；

图18为对比例7提供的检测条件得到的血浆样本的色谱图二；

图19为利用对比例8提供的检测条件得到的NE色谱峰图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

本实施例提供了一种标准工作液的制备方法。

(1)制备母液

天平精密称量去甲肾上腺素盐酸盐标准品1.083mg，以0.5％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为443.51μg/mL的母液；

天平精密称量肾上腺素标准品1.30mg，以0.5％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为637μg/mL的母液；

天平精密称量多巴胺盐酸盐标准品0.973mg，以0.5％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为389.7μg/mL的母液；

天平精密称量去甲变肾上腺素盐酸盐标准品1.383mg，以0.5％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为553.3μg/mL的母液；

天平精密称量变肾上腺素盐酸盐标准品3.42mg，以0.5％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为1413.5μg/mL的母液；

天平精密称量3-甲氧基酪胺盐酸盐标准品0.84mg，以0.5％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为333.2μg/mL的母液；

上述六种化合物的母液均贴签，标注品名，置于-80℃冰箱保存，有效期3个月；

(2)制备标准工作液

六种化合物的母液分别利用甲酸含量为0.04％的甲酸水溶液稀释、混合，得到标准工作液，本实施例提供了7种不同的浓度的标准工作液，标准工作液中的6种化合物的浓度见表1：

表1

对比例1-2

本对比例提供了一种母液的制备方法。

与实施例1的区别在于，在本对比例制备母液的过程中，溶剂采用的是去离子水(对比例1)、0.1M盐酸溶液(对比例2)。

性能测试1：母液的稳定性

两名实验员按照实施例1和对比例1-2提供的方法分别制备样品母液，参照实施例1提供的制备方法，制备标准工作液，进行LC-MS/MS检测，建立标准曲线；

同样两名实验员，利用在-80℃下存储6个月后的母液制备标准工作液，进行LC-MS/MS检测，建立标准曲线；

对比现用现配的母液与存储后的母液得到的标准曲线，检查标准曲线上的最大浓度点，比较各自化合物的最大浓度点对应的峰面积S，通过准确性,％＝S_存储后/S_现用现配×100％的方法计算准确性，并求平均值，结果见表2：

表2

注：对比例1利用去离子水配制肾上腺素母液时，溶解性较差，出现部分不溶现象，因此没有进行检测。

由实施例和对比例的对比可知，在本公开中，利用甲酸含量为0.5％的甲酸水溶液制备母液，能够在迅速充分溶解的同时保持母液的稳定性，能够长时间存储，随用随取，无需现用现配，节约了大量的检测时间及成本。

性能测试2：标准工作液的稳定性

参照性能测试1的方法，将实施例1制备得到的标准工作液在-80℃下存储两个月，同时与现用现配的标准工作液进行比较，每个标准工作液测试三次，最后的准确性结果为平均值，确定标准工作液的存储稳定性，结果见表3：

表3

目标物	准确性/％	目标物	准确性/％
				NE	98.5％	NMN	104.4％
E	102.4％	MN	100.2％
				DA	98.2％	3-MT	96.8％

由表3可知，本公开通过选用0.04％的甲酸水溶液作为稀释剂，能够使儿茶酚胺及其代谢物的标曲具有优异的稳定性。

实施例2

本实施例提供了一种内标工作液的制备方法。

(1)制备母液

天平精密称量去甲肾上腺素-d6标准品8.15mg，以0.5％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为2847.8μg/mL的母液；

天平精密称量肾上腺素-d3标准品1.49mg，以0.5％甲酸水溶解定容至3mL，得到浓度为486.7μg/mL的母液；

天平精密称量多巴胺-d5标准品0.92mg，以0.5％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为360.18μg/mL的母液；

市售浓度为100μg/mL的去甲变肾上腺素-d3母液，溶剂为水；

市售浓度为100μg/mL的变肾上腺素-d3母液，溶剂为水；

天平精密称量3-甲氧基酪胺-d4标准品0.63mg，以0.04％甲酸水溶解定容至2mL，得到浓度为253.3μg/mL的母液；

在得到的六种母液的试剂瓶上贴标签，标注品名、浓度、配制时间和配制人，存放于-80℃冰箱保存，有效期1年；

(2)制备内标工作液

将六种化合物各自的母液利用甲酸含量为0.04％的甲酸水溶液稀释、混合，得到所述内标工作液，所述去甲肾上腺素-d6的浓度为8ng/mL、肾上腺素-d3的浓度为2ng/mL、多巴胺-d5的浓度为1ng/mL、去甲变肾上腺素-d3的浓度为2ng/mL、变肾上腺素-d3的浓度为1.2ng/mL和3-甲氧基酪胺-d4的浓度为0.8ng/mL。

实施例3

本实施例提供了一种标准溶液的制备方法。

取实施例1提供的标准溶液1-7中的任意一种10μL，实施例2提供的内标工作液10μL和甲酸含量为0.5％的甲酸水溶液80μL置于1.5mL离心管中，在转速为2000rpm下涡旋混匀30s，得到至少三种不同浓度的标准溶液。

实施例4

本实施例提供了一种标准曲线的建立方法。

(1)对实施例3提供的至少三种不同浓度的标准溶液利用液相色谱质谱联用仪器对上述标准溶液进行检测，得到色谱图；

(2)以标准溶液含有的目标物的色谱峰面积与对应的内标的峰面积的比值为Y，以目标物的浓度与对应的内标的浓度的比值为X，拟合得到6种目标物对应的标准曲线方程如下：

去甲肾上腺素：Y＝0.00187X+0.000523，R²＞0.999；

肾上腺素：Y＝0.000882X+0.00257，R²＞0.999；

多巴胺：Y＝0.0033X+0.0149，R²＞0.999；

去甲变肾上腺素：Y＝0.00702X+0.011，R²＞0.999；

变肾上腺素：Y＝0.0113X+0.00281，R²＞0.999；

3-甲氧基酪胺：Y＝0.00301X+0.00127，R²＞0.999。

实施例5

本实施例提供了一种待测样品的制备方法。

(1)将至少2mL血液置于肝素锂真空抗凝采血管中，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到肝素锂血浆，得到的血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；

(2)用移液枪移取实施例2提供的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，然后加入肝素锂血浆200μL，加入300μL 50mmol/L乙酸铵溶液，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s；

其中，肝素锂血浆的制备方法为：采取静脉血置于肝素锂采血管中，静置30min后，在4000r/min的转速下离心10min，得到肝素锂血浆；

(3)用200μL甲醇和200μL水(甲酸含量为2％)活化SPE柱，再将步骤(2)的混合液转移至SPE柱，依次用200μL水和200μL乙腈进行洗涤，洗涤结束之后用大气流吹2-3min，最后加入100μL洗脱液(甲酸含量为0.5％的水溶液)进行洗脱，得到待测样品。

对比例4

本对比例提供了一种待测样品的制备方法。

与实施例5的区别在于，在本对比例中，血浆采用的是EDTA血浆，制备方法如下：采取静脉血置于EDTA采血管中，静置30min后，在4000r/min的转速下离心10min，得到的样本即为EDTA血浆。

性能测试3：肝素锂血浆的稳定性

考察实施例5提供的血浆和对比例4提供的血浆中待测化合物的稳定性，方法如下：

(1)征集志愿者，分别采取肝素锂血浆和EDTA血浆，然后在常温、4℃下放置96h，分别于0.5h、3h、8h、24h、48h、72h和96h取样，参照实施例5的方法进行前处理，利用液相色谱质谱联用进行上机检测，对比其稳定性，具体数据见表4-7；

表4：肝素锂血浆在常温下放置的检测结果

表5：EDTA血浆在常温下放置的检测结果

表6：肝素锂血浆在4℃下放置的检测结果(浓度：pg/mL)

表7：EDTA血浆在4℃下放置的检测结果(浓度：pg/mL)

由表4-7可知，肝素锂血浆的稳定性明显优于EDTA血浆的稳定性。

实施例6

本实施例提供了一种检测待测样品中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法。

(1)移取待测样品80μL，使用液相色谱质谱联用仪对待测样品进行检测，进样量为20μL，得出待测样品中儿茶酚胺及其代谢物的内标色谱图；

对于LC-MS/MS检测，本实施例使用的仪器为高效液相色谱质谱联用仪AB SCIEX；型号/规格：Exion HPLC/MS 6500高效液相色谱质谱联用仪。

使用的分析色谱柱为Waters HSS PFP(2.1×100，2.5μm)；设置柱温为40℃，进样量为20μL，分析色谱柱流动相为：A相：水(0.1％甲酸+5mmol/L甲酸铵)，B相：纯甲醇，分析色谱柱采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表8：

表8

对于质谱条件，所述质谱检测器为ESI(+)检测模式，所述质谱参数见表9和表10：

表9

参数	设定值	参数	设定值
				气帘气1	20.0L/min	离子源温度	500℃
碰撞气1	8L/min	干燥气1	45L/min
				IS电压	2000V	干燥气2	15L/min

表10

(2)分别确定得到的肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度。

性能测试4：对本公开提供的方法进行评价

(1)准确性和灵敏度：

10μL实施例1提供的标准工作液、10μL内标工作液和190μL空白血浆混匀进样，按实施例6提供的测定条件，将实施例1提供的标准工作液浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，通过标准曲线确定去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的检测限、定量限和线性范围，见表11：

表11

由表11可知，本公开提供的方法对于儿茶酚胺及其代谢物的检测限较低，在儿茶酚胺及其代谢物含量极低的情况下能够对其进行定性分析，同时定量限较低，能够在儿茶酚胺及其代谢物含量极低的情况下对其进行定量分析，且线性范围较宽。

(2)回收率和精密度

取实施例1提供的标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例6提供的方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度见表12。

表12

由表12可知，儿茶酚胺及其代谢物在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为96.24-104.93％，相对标准偏差为0.59-5.39％。

由实施例和性能测试可知，本公开提供的方法能够准确检测血液中儿茶酚胺及其代谢物的含量，其检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，对于血液中儿茶酚胺及其代谢物的浓度检测重现性良好，加样回收率高，检测结果的准确度高。

(3)对于待测血浆样本中的目标物和标准溶液中的目标物的色谱图，结果如下：

图1血浆样本的色谱图，图2、4、6、8、10、12为标准溶液中的去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺的色谱图；图3、5、7、9、11、13分别为标准溶液中的去甲肾上腺素-d6、肾上腺素-d3、多巴胺-d5、去甲变肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3、3-甲氧基酪胺-d4的色谱图；由图1-13的对比可知，去甲肾上腺素及内标的保留时间为1.26min，肾上腺素及内标的保留时间为1.70-1.71min，多巴胺及内标的保留时间为2.02-2.05min，去甲变肾上腺素及内标的保留时间为1.97-1.98min，变肾上腺素及内标的保留时间为3.11-3.12min，3-甲氧基酪胺及内标的保留时间为4.08-4.09min，采用本公开提供的方法对目标物(去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺)识别准确，分析时间短、干扰小，特异性强。

实施例7

与实施例6的区别在于，在本实施例中，色谱柱为phenomenex F5(4.6×100，2.6μm)，洗脱条件见表13：

表13

图14为本实施例得到的待测样本的色谱图，由图1和图14以及实施例6-7可知，采用本公开提供的色谱柱配合色谱条件能够成功实现6种待测物的有效分离，尤其是肾上腺素和去甲变肾上腺素的有效分离。

对比例5

本对比例提供了一种检测待测样品中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法。

与实施例6的区别在于，在本实施例中，梯度洗脱方式见表14：

表14

图15为本对比例得到的待测样本的色谱图，由图可知，与对比例5进行对比，利用本公开提供的梯度洗脱条件得到的色谱图基线平稳，有利于后续的定量分析，当不采用本公开提供的梯度洗脱条件时，容易导致3-MT出峰时基线明显抬高。

对比例6

与实施例6的区别在于，在本对比例中，梯度洗脱方式见表15：

表15

图16为本对比例得到的待测样本的色谱图，由图可知，利用本公开提供的梯度洗脱条件能够使E和NMN完全分离，不互相干扰，当改变梯度洗脱条件时，E和NMN分离度变差，二者容易相互干扰导致检测结果准确度降低。

对比例7

与实施例6的区别在于，在本对比例中，色谱柱为phenomenex F5(2.1×100，2.6μm)，梯度洗脱条件见表16：

表16

图17-18为本对比例得到的待测样本的色谱图，由图可知，利用本公开提供的梯度洗脱条件能够使E和NMN完全分离，且峰型较好，而不采用本公开的色谱柱配合梯度洗脱条件，容易导致峰型出现拖尾，且E和NMN未完全达到基线分离。

对比例7

与实施例6的区别在于，在本对比例中，色谱检测条件如下：

色谱柱条件：phenomenex F5(3.0*100，2.6μm)，柱温40℃，进样量20μL，分析色谱柱流动相为：A相：水(0.1％FA+5mM甲酸铵)，B相：纯甲醇，分析色谱柱采用梯度洗脱方式，色谱条件参数见表17：

表17

图19为利用对比例5的条件测试得到的NE色谱峰图，由图可知，利用对比例5的条件测试得到的NE色谱峰分叉，不利于积分进行后续的分析计算。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）将内标工作液与含有儿茶酚胺及其代谢物的标准工作液混合，得到标准溶液，所述标准工作液包括至少三个浓度梯度；

所述儿茶酚胺及其代谢物包括去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺六种化合物；

（2）利用LC-MS/MS对标准溶液进行检测，并分别建立所述六种化合物的标准曲线；

（3）利用LC-MS/MS对待测样品进行检测，同时利用步骤（2）建立的标准曲线确定待测样品中上述六种化合物各自的含量；

所述标准溶液的制备方法包括：将内标工作液、含有儿茶酚胺及其代谢物的标准工作液和甲酸水溶液混合，得到所述标准溶液，所述标准工作液包括至少三个级别浓度；

各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂由中间液稀释得到，所述中间液利用稀释剂由母液稀释得到，所述母液利用溶剂溶解所述儿茶酚胺及其代谢物各自的标准品得到，所述溶剂为0.5%甲酸水溶液，所述稀释剂为0.04%的甲酸水溶液；

在LC-MS/MS检测中，使用的色谱分析柱为Waters HSS PFP或phenomenex F5；

在LC-MS/MS检测中，液相色谱参数包括：

色谱柱流动相：A为含有0.1-0.5v/v%甲酸、5-10 mM缓冲剂的水溶液，B为含有0-0.5v/v%甲酸、0-10 mM缓冲剂的甲醇溶液，所述缓冲剂选自甲酸铵或乙酸铵；

梯度洗脱为：

流速：0.3-0.6 mL/min；

0.00-2.50 min：A 98-100%，B 0-2%；

2.01-4.50 min：A 60-90%，B 10-40%；

3.51-6.50 min：A 98-100%，B 0-2%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS检测的分析时间为5.50-6.50 min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS检测的分析时间为5.50min。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其特征在于，在LC-MS/MS检测中，质谱参数包括：

离子源温度：500-600℃；气帘气1：10-30 L/min；碰撞气1：6-10 L/min；IS电压：1500-3000V；干燥气1：45-60 L/min；干燥气2：15-40 L/min。

5.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品的制备方法包括：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述血浆选自EDTA血浆或者肝素锂血浆；

和/或，所述血浆或血清与pH缓冲液的体积比1:(1-2.5)；

和/或，所述血浆或血清与内标工作液的体积比(20-35):1；

和/或，所述pH缓冲液为甲酸铵溶液或乙酸铵溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述血浆为肝素锂血浆。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述血浆或血清与pH缓冲液的体积比为1:1.5。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述利用固相萃取柱进行萃取的方法包括：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂为水和乙腈。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为浓度为0.5-1 v/v%的甲酸水溶液。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述固相萃取柱利用甲醇和浓度为2 v/v%的甲酸水溶液进行活化。

13.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述内标工作液中含有去甲肾上腺素-d6、肾上腺素-d3、多巴胺-d5、去甲变肾上腺素-d3、变肾上腺素-d3和3-甲氧基酪胺-d4。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准工作液包括八个级别浓度。