CN110274974A - 一种血清中肾上腺素类物质的检测方法及其富集材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种血清中肾上腺素类物质的检测方法和富集方法，所述方法包括以下步骤：含肾上腺素类的样品按一定比例有机溶剂提取或溶解后，然后采用根据肾上腺素类物质中的氨基结构，设计出疏水性较强的硅胶表面键合直链烷基，苯磺酸基团或磺酸基团键合相填料中；通过优化制备过程中溶剂用法用量及淋洗配比等参数，使富集得到的产物进入已优化好方法的超高效液相色谱串联质谱检测，达到对肾上腺素类物质的富集和特异性高灵敏度检测的目的；富集后的肾上腺素样本能够在一定的色谱条件下，实现快速、准确定量分析，本方法的回收率在91.2％‑104.7％，相对标准偏差均小于5.9％。本发明操作过程简单，同时采用超高效液相色谱串联质谱，具有特异性高、稳定性好、回收率高、定量准确、高通量等特点。

Description

一种血清中肾上腺素类物质的检测方法及其富集材料
技术领域
本发明涉及一种血清中肾上腺素类物质的检测方法及其富集材料，其属于分析化学检测的技术领域。
技术背景
肾上腺素属于儿茶酚胺类的激素，在人体中的含量较少，其次级代谢产物为“甲氧基去甲肾上腺素”和“甲氧基肾上腺素”。临床中很多疾病的诊断与是否存在过多的肾上腺素分泌有关，如嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节神经母细胞瘤、神经节神经瘤、副神经节瘤、高血压，心肌梗死、应激状态、糖尿病酮症酸中毒等(Lenders JW，Eisenhofer G，Mannelle M，et al，Phaeochromocytoma【J】.Lancet，2005，366(9486):665-675)。还有一些疾病跟肾上腺素分泌过少有关，如低血压、植物神经病变、帕金森病等，在临床检验中一直存在着肾上腺素类物质的准确定量的问题。
临床中使用的检测方法酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测、细胞测定法、色谱电化学检测为主，但这些方法往往优缺点较为明显，本发明采用超高效液相色谱串联质谱检测，这种检测方法特异性和灵敏度较高的，同时可以达到理想的准确度。
还有一些方法与本发明中的检测方法类似，采用富集材料去进行微量肾上腺素类物质的检测，例如，“HPLC-MS/MS同时快速检测大鼠血浆中7种神经递质，郭玲等，中国医药导刊，第20卷，第2期，第93-96页，2018年”中公开了建立高效液相色谱串联质谱同时检测包括去甲肾上腺素和肾上腺素等7种神经递质，但其中并没有采用富集材料对血浆中的肾上腺素等进行富集，处理方法差异较大。本发明是针对肾上腺素结构上存在的氨基，采用硅胶材料为表面，键合直链烷基连接的苯磺酸基团或直链烷基连接的磺酸基团，表面键合碳链(n＝3～15)，加入磺酸基团，目的是形成强阴离子，对肾上腺素上的阳离子基团起到交换吸附作用，再通过调整洗脱条件洗脱，在最后一步洗脱目标物的溶液中可以采用酸性或碱性溶液洗脱。较传统的磺酸基团键合相填料相比，本发明所用的填料中加入了长度为3～15的碳链，同时存在强的阴离子，增加了填料的吸附能力，可以实现大体积的样本进样，富集得到更多的肾上腺素类物质。本发明只有在酸性和碱性试剂洗脱下才能将目标物质洗脱下来，其他情况下任何洗脱试剂都不会将小柱上的肾上腺素类物质洗下。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清中肾上腺素类物质的检测方法及其富集材料，原理是针对肾上腺素结构上存在的氨基，采用硅胶材料为表面，键合直链烷基连接的苯磺酸基团或直链烷基连接的磺酸基团，表面键合碳链(n＝3～15)，加入磺酸基团，目的是形成强阴离子，对肾上腺素上的阳离子基团起到交换吸附作用，再通过调整洗脱条件洗脱，在最后一步洗脱目标物的溶液中可以采用酸性或碱性溶液洗脱，除去一些生物基质中的干扰因素，实现样品中肾上腺素的富集制备，再通过超高效液相色谱串联质谱进行特异性检测。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种血清中肾上腺素类物质的检测方法和富集方法，包括以下步骤，
(1)将样品置于离心管底部，加入内标提取液涡旋提取；涡旋混合30秒后，再超声3min，所述内标为肾上腺素同位素，内标浓度范围为10-500umol/L；
(2)装填固相萃取柱：填料装填规格为50-500mg/1-6mL固相萃取柱；
(3)富集肾上腺素样品：对所述固相萃取柱进行活化，平衡，上样，淋洗，洗脱，最后收集所有洗脱液；
(4)样品的分析：将步骤3)收集的洗脱液装入进样小瓶中，将其进入超高效液相色谱串联质谱检测血清中的肾上腺素类物质。
在本发明的一个优选的实施方案中，步骤(1)包括以下步骤：
1)配置样品内标提取液试剂
内标提取液为有机溶剂∶将同位素内标物质溶于100mM缓冲盐溶液，其中有机溶剂和缓冲盐溶液两者体积比介于70∶30—90∶10之间。有机溶剂为甲醇，乙醇，乙腈，丙酮中的任意一种或多种组合；所采用的缓冲盐溶液为甲酸铵或乙酸铵中的一种或两者组合，调剂缓冲盐用的酸为甲酸或乙酸中的一种或两者组合；
2)样本提取
移取5-500uL血清样品到1.5mLEP管底部，加入0.5-50ul内标提取液涡旋提取；涡旋混合30秒后，再超声3min，备用。
在本发明的一个优选的实施方案中，步骤(1)中，所述样本与内标的体积比为10：1。
在本发明的一个优选的实施方案中，步骤(2)中，采用硅胶为载体、表面键合直链烷基连接的阴离子基团的填料，所述阴离子基团为磺酸基团和苯磺酸基团中的一种或多种，烷基碳链长度n＝3～15；结构如下：
键合相填料的粒径为5-100um，孔径60-300nm，比表面积50-800㎡/g，所述填料由本领域常规键合反应制备得到，并经一般鉴定方法验证其结构。
本发明在使用中效果较好的填料选择是，苯磺酸基团为键合相，碳链长度为n＝15，粒径为30um，孔径比表面积300m2/g。
在本发明的一个优选的实施方案中，步骤(3)的操作步骤为：先采用有机溶剂：水的第一混合液对固相萃取柱进行活化；再加入体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水＝90:5:5的第二混合液进行平衡；将全部上清液样品上样后，加入第一和二混合液进行淋洗；最后用体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水：酸或碱＝90:2:7:1的第三混合液进行洗脱；
所述的第一、二种溶剂的有机溶剂及缓冲盐溶液是相对应的，缓冲盐为甲酸铵或乙酸铵，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或多种组成，第三种洗脱液为强洗脱溶剂，主要由水、甲醇、乙醇、乙腈、盐酸、氨水、甲酸铵、乙酸铵；
所述上清液中样品质量占固相萃取柱中填料质量的0.5％-10％。
在本发明的一个更优选的实施方案中，步骤(3)的具体操作步骤为：加入3mL MeOH∶H2O(10∶90v/v)活化后，再加入3mL MeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)和1mL MeOH∶H2O(10∶90，v/v)淋洗。最后加入500uLMeOH∶NH4FA∶H2O∶HCL(90:2:7:1，v/v/v/v)洗脱，并收集所有的洗脱。平衡、活化、上样、淋洗、洗脱所使用的有机溶剂、缓冲盐溶液和酸需一一对应。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述的第一混合液、第二混合液、第三混合液中的有机溶剂及碱溶液是相对应的，所述的有机溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、乙醇、丙酮中的一种或几种，所述的缓冲盐溶液为氨水或乙二胺溶液，碱浓度0.1-5％。
在本发明的一个优选的实施方案中，步骤(4)中的高效液相色谱条件：
色谱柱：Waters T3，100mm×2.1mm，1.7μm；流动相A：甲醇-10mM甲酸铵B：水-10mM甲酸铵；流动相流速：0.3mL/min；梯度洗脱；柱温：30-45℃；进样量：2μL
所述的梯度洗脱，条件为；
时间(min) 流速(ml/min) A％ B％
0 0.3 10 90
0.5 0.3 95 5
2.5 0.3 95 5
2.6 0.3 10 90
4 0.3 10 90
质谱分析条件：
离子化模式：ESI+；喷雾电压：5.5kV；脱溶剂气温度：500℃；雾化气(GS 1)：55psi；辅助雾化气(GS 2)：55psi；气帘气：45psi；碰撞气：10psi；扫描方式：多反应监测(MRM)。
本发明具有的有益效果是：
(1)操作简单、通量高
前处理过程不需要蛋白沉淀，可直接上样，只需要按照步骤加入不同的洗脱液，便可得到富集和净化后含有肾上腺素类物质的样本，由于材料的特殊性，可以进行大样本量的富集，方法简单，所采用的固体吸附剂易于制成96孔SPE板，实现批量化。重复性好，操作简单可控，易实现自动化，过程稳定；
(2)洗脱体系稳定
本发明只有在碱性和酸性的洗脱液中才能将目标物质洗脱出来，其他的洗脱液只会产生除杂和富集的效果，不会影响对目标物质洗脱；
(3)定性和定量准确
本发明采用亲水作用色谱分离，三重四级杆串联质谱法检测，基质加标外标法定量，结果准确度高且稳定，克服了原来离子色谱定量可能存在的干扰和假阳性问题，可用于血清中肾上腺素类物质的同时定性定量，回收率在91.2％-104.7％，相对标准偏差均小于5.9％。
本发明是针对肾上腺素结构上存在的氨基，采用硅胶材料为表面，键合直链烷基连接的苯磺酸基团或直链烷基连接的磺酸基团，表面键合碳链(n＝3～15)，加入磺酸基团，目的是形成强阴离子，对肾上腺素上的阳离子基团起到交换吸附作用，再通过调整洗脱条件洗脱杂质，在最后一步洗脱目标物的溶液中可以采用酸性或碱性溶液洗脱。材料可以进行大样本量的富集，方法简单，所采用的固体吸附剂易于制成96孔SPE板，实现批量化。重复性好，操作简单可控，易实现自动化，过程稳定。净化后的肾上腺素样本用超高效液相串联质谱检测，能同时检测各种样品中多种肾上腺素类物质。
附图说明
图1为甲氧基肾上腺素实际样本的MRM色谱图
图2为甲氧基去甲肾上腺素实际样本的MRM色谱图
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。实例所用到血浆样品均由大连医科大学附属第二医院提供，其它样品购买于市场。在实施方式中，以下实施例中所有净化的样品取10uL，用液质联用的方法进行检测。其中液相色谱流动相条件包括A和B：A甲醇-10mM甲酸铵、，流动相B为水-10mM甲酸铵。流速为0.3mL/min，柱温45℃，色谱柱：Waters T3，100mm×2.1mm，1.7μm粒径色谱柱。梯度条件如下：
时间(min) 流速(ml/min) A％ B％
0 0.3 80 20
0.5 0.3 95 5
2.5 0.3 95 5
2.6 0.3 80 20
4 0.3 80 20
质谱分析参数
离子化模式：ESI+；喷雾电压：5.5kV；脱溶剂气温度：500℃；雾化气(GS 1)：55psi；辅助雾化气(GS 2)：55psi；气帘气：45psi；碰撞气：10psi；扫描方式：多反应监测(MRM)；建立肾上腺素的物质标准品的标准曲线。
选取两种常见的肾上腺素类物质
序号 英文名称 中文名称 分子量
1 Metanephrine 甲氧基肾上腺素 197.10
2 Normetanephrine 甲氧基去甲肾上腺素 183.20
保留时间和MRM参数如下
序号 中文名称 Rt(min) 检测离子对 去簇电压(DP) 碰撞能(CE)
1 甲氧基肾上腺素 2.45 180.1＞148.1 80 30
2 甲氧基去甲肾上腺素 2.46 166.1＞137.1 80 25
根据液相色谱和质谱条件对肾上腺素类物质进行标准曲线测定。并根据保留时间以及质谱离子对区别鉴定所有的氨基酸。本实施例中配置肾上腺素类标准品的浓度如下：0.05nmol/L，0.2nmol/mL，1nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，500nmol/L。以检测限10倍含量配置标准品混标，进行方法回收率考察，平行测定3次。经液质联用检测数据处理，肾上腺素标准品的出峰面积(y)与浓度(x)之间的回归方程及方法检测限如下表：
实施例1：测试不同填料之间的准确度对比。
分别使用硅胶表面键合直链碳链连接的苯磺酸基团键合相填料1，其中碳链长度为15，粒径为30um，孔径比表面积300m2/g与硅胶表面键合苯环的填料2。
填料1结构.
填料2结构.
采用相同的处理方式和检测条件，取100mg装填与2mL固相小柱中，加入1mL MeOH∶H2O(10∶90v/v)活化后，再加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入500uLMeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)和500uL MeOH∶H2O(10∶90，v/v)淋洗。最后加入200uLMeOH∶NH4FA∶H2O∶氨水(90∶2∶7∶1，v/v/v/v)洗脱，并收集所有的洗脱液，装入进样小瓶中，前处理过程中分为低中高三个浓度点，每个点6个样本，带入标准溶液做的标准曲线当中，结果取浓度均值，计算准确度。
通过数据对比，发现本发明中的填料的准确度要优于苯环的填料准确度。
实施例2：测试不同前处理方法的检测下限对比。
使用蛋白沉淀的方法，取血清样本200ul，加入0.2％甲酸乙腈溶液400uL沉淀，冰箱放置30min后离心3min转速12000r/min取上清，进样10uL。使用固相萃取的方法，取200uL血清，到1.5mL EP管中，再加入20uL内标溶液涡旋混合，然后加入700μL甲醇，涡旋混合30秒，超声3min，；硅胶表面直链烷基连接的苯磺酸基团键合相填料碳链长度为15，粒径为30um，孔径比表面积300m2/g。
填料结构
500mg装填与5mL固相小柱中，加入3mL MeOH∶H2O(10∶90v/v)活化后，再加入3mLMeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)和1mL MeOH∶H2O(10∶90，v/v)淋洗。最后加入500uLMeOH∶NH4FA∶H2O∶HCl(90∶2∶7∶1，v/v/v/v)洗脱，并收集所有的洗脱液，装入进样小瓶中。两种不同的方法处理后的样本进入超高效液相色谱串联质谱检测血清中的甲氧基去甲肾上腺素的定量下限。
通过数据对比，发现本发明方法使用填料的定量下限准确度要优于蛋白沉淀方法定量下限准确度。
实施例3：血清样品检测。
取200uL血清，到1.5mL EP管中，再加入20uL内标提取液涡旋混合，然后加入700μL甲醇，涡旋混合30秒，超声3min；硅胶表面键合直链烷基连接的苯磺酸基团键合相填料碳链长度为15，粒径为30um，孔径比表面积300m2/g，500mg装填于5mL固相小柱中，加入3mLMeOH∶H2O(10∶90v/v)活化后，再加入3mL MeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)和1mL MeOH∶H2O(10∶90，v/v)淋洗。最后加入500uLMeOH∶NH4FA∶H2O∶HCl(90∶2∶7∶1，v/v/v/v)洗脱，并收集所有的洗脱液，装入进样小瓶中，进入超高效液相色谱串联质谱检测，带入同相同方法处理过的标准曲线中(此实施例中标准曲线浓度范围0.2-20nmol/L)，测定的甲氧基肾上腺素的含量。
浓度(nmol/L) 第一条标曲 第二条标曲 第三条标曲
0.2 0.1132 0.0986 0.1134
0.5 0.2000 0.2015 0.2555
2.0 0.8177 0.7608 0.8260
4.0 1.5045 1.4898 1.6854
8.0 2.9208 2.9963 2.9433
20.0 7.3168 7.2682 7.5543
斜率 2.7524 2.7580 2.6785
截距 -0.1219 -0.1073 -0.1887
相关系数 0.9999 0.9998 0.9993
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (8)

1.一种血清中肾上腺素类物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)将样品置于离心管底部，加入内标提取液涡旋提取；涡旋混合30秒后，再超声3min，所述内标为肾上腺素同位素，内标浓度范围为10-500umol/L；
(2)装填固相萃取柱：填料装填规格为50-500mg/1-6mL固相萃取柱；
(3)富集肾上腺素样品：对所述固相萃取柱进行活化，平衡，上样，淋洗，洗脱，最后收集所有洗脱液；
(4)样品的分析：将步骤3)收集的洗脱液装入进样小瓶中，将其进入超高效液相色谱串联质谱检测血清中的肾上腺素类物质。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：
1)配置样品内标提取液试剂
内标提取液为有机溶剂∶将同位素内标物质溶于100mM缓冲盐溶液，其中有机溶剂和缓冲盐溶液两者体积比介于70∶30—90∶10之间；有机溶剂为甲醇，乙醇，乙腈，丙酮中的任意一种或多种组合；所采用的缓冲盐溶液为甲酸铵或乙酸铵中的一种或两者组合，调剂缓冲盐用的酸为甲酸或乙酸中的一种或两者组合；
2)样本提取
移取5-500uL血清样品到1.5mLEP管底部，加入0.5-50ul内标提取液涡旋提取；涡旋混合30秒后，再超声3min，备用。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样品与内标提取液的体积比为10：1。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，采用硅胶为载体、表面键合直链烷基连接的阴离子基团的填料，所述阴离子基团为磺酸基团和苯磺酸基团中的一种或多种，烷基碳链长度n＝3～15；结构如下：
键合相填料的粒径为5-100um，孔径60-300nm，比表面积50-800㎡/g。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)的操作步骤为：先采用有机溶剂：水的第一混合液对固相萃取柱进行活化；再加入体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水＝90:5:5的第二混合液进行平衡；将全部上清液样品上样后，加入第一和二混合液进行淋洗；最后用体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水：酸或碱＝90:2:7:1的第三混合液进行洗脱；
所述的第一、二种溶剂的有机溶剂及缓冲盐溶液是相对应的，缓冲盐为甲酸铵或乙酸铵，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或多种组成，第三种洗脱液为强洗脱溶剂，主要由水、甲醇、乙醇、乙腈、盐酸、氨水、甲酸铵、乙酸铵；
所述上清液中样品质量占固相萃取柱中填料质量的0.5％-10％。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作步骤为：加入3mLMeOH∶H2O(10∶90v/v)活化后，再加入3mL MeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O(90∶5∶5，v/v/v)和1mL MeOH∶H2O(10∶90，v/v)淋洗；最后加入500uLMeOH∶NH4FA∶H2O∶HCl(90:2:7:1，v/v/v/v)洗脱，并收集所有的洗脱；其中，平衡、活化、上样、淋洗、洗脱所使用的有机溶剂、缓冲盐溶液和酸需一一对应。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的第一混合液、第二混合液、第三混合液中的有机溶剂及碱溶液是相对应的，所述的有机溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、乙醇、丙酮中的一种或几种，所述的缓冲盐溶液为氨水或乙二胺溶液，碱浓度0.1-5％。
8.根据权利要求1所述的检测方法，步骤(4)中的超高效液相色谱条件：
色谱柱：Waters T3，100mm×2.1mm，1.7μm；流动相A：甲醇-10mM甲酸铵B：水-10mM甲酸铵；流动相流速：0.3mL/min；梯度洗脱；柱温：30-45℃；进样量：2μL所述的梯度洗脱，条件为；
时间(min) 流速(ml/min) A％ B％ 0 0.3 10 90 0.5 0.3 95 5 2.5 0.3 95 5 2.6 0.3 10 90 4 0.3 10 90
质谱分析条件：
离子化模式：ESI+；喷雾电压：5.5kV；脱溶剂气温度：500℃；雾化气(GS1)：55psi；辅助雾化气(GS 2)：55psi；气帘气：45psi；碰撞气：10psi；扫描方式：多反应监测(MRM)。
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