CN109847407A

CN109847407A - 一种戊柔比星的纯化方法

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Publication number: CN109847407A
Application number: CN201910286955.0A
Authority: CN
Inventors: 贺元康; 王艺
Original assignee: SHENZHEN SEPAX TECHNOLOGIES Inc
Current assignee: SHENZHEN SEPAX TECHNOLOGIES Inc
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2039-04-10
Also published as: CN109847407B

Abstract

本发明提供了一种戊柔比星的纯化方法，包括：将含戊柔比星粗品的溶液经过制备色谱仪进行纯化分离，得到纯化后的戊柔比星，其中，通过使所述纯化分离的洗脱剂由水、有机相和酸组成；且所述酸为甲酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸；所述有机相为甲醇或乙醇；纯化分离的洗脱方式为等度洗脱以及所述洗脱剂中的有机相的体积百分含量为65％～90％。进而使得本发明的纯化分离效果好，得到的纯化戊柔比星纯品纯度可达99.8％以上，单杂小于0.1％，收率可达66％以上。且通过以制备液相进行制备，耗时短，且使用溶剂易于回收，环境污染小。且该方法经过中试放大，工艺简单易行，适合工业放大生产。

Description

一种戊柔比星的纯化方法

技术领域

本发明涉及有机合成领域，尤其涉及一种戊柔比星的纯化方法。

背景技术

戊柔比星(Valrubicin)，为橙黄色或橙红色粉末，是治疗卡介菌难治性膀胱原位癌的蒽环类药物。具有极强的亲脂性，在二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、无水乙醇中易溶解，正己烷、正戊烷、庚烷、石油醚中微溶，在水中几乎不溶。戊柔比星分子式为：C₃₄H₃₆F₃NO₁₃，分子量：723.6，分子结构如式一所示：

戊柔比星为蒽环类药物，主要作用机制为干扰正常的DNA分裂重组，从而影响细胞的各种生物学功能。主要表现为干涉核酸的代谢：戊柔比星很容易渗入细胞内，进一步的抑制核苷形成核酸，从而引起大量染色体损伤并使细胞的周期停止在G2期。

基于此，研究戊柔比星的制备以及得到高纯度的戊柔比星具有重要意义，目前，关于制备工艺研究的比较多，如专利CN108530502A提供了一种戊柔比星晶体的制备方法，涉及到戊柔比星晶体的制备，但并未提供戊柔比星的纯化方法。专利CN103694291A和专利CN108484689A分别提供了一种戊柔比星的合成方法。专利CN103694291A和专利CN108484689A均涉及到了戊柔比星粗品的纯化，均采用正相柱层析法分离纯化，采用的是常压吸附和常压洗脱，费时费力，操作复杂，且使用的到大量的有机溶剂二氯甲烷和乙酸乙酯，环境污染大。通过正相柱层析纯化得到的戊柔比星纯品纯度尚可，但是单杂含量不明确，且单杂含量较高。

因此，提高一种戊柔比星粗品的纯化方法以期得到高纯度，单杂含量低的戊柔比星纯品具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供戊柔比星的纯化方法，本发明提供的方法得到的戊柔比星的纯度和收率均比较高。

本发明提供了一种戊柔比星的纯化方法，包括：将含戊柔比星粗品的溶液经过制备色谱仪进行纯化分离，得到纯化后的戊柔比星，

其中，所述纯化分离的洗脱剂由水、有机相和酸组成；

所述有机相为甲醇或乙醇；

所述酸为甲酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸；

所述纯化分离的洗脱方式为等度洗脱；

所述洗脱剂中的有机相的体积百分含量为65％～90％。

优选的，所述戊柔比星粗品的纯度为60％～97％。

优选的，所述含戊柔比星粗品的溶液的浓度为10～500mg/mL。

优选的，所述洗脱剂中的酸的体积百分含量为0.05％～0.5％。

优选的，所述洗脱剂中的有机相的体积百分含量为75％～85％。

优选的，所述制备色谱仪中的色谱柱填料为键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的硅胶。

优选的，所述键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的硅胶中十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比为(1～6)：1。

优选的，所述戊柔比星粗品与制备色谱仪中的色谱柱填料的质量比0.1～9％。

优选的，所述纯化分离中洗脱剂的流速为10～600mL/min。

优选的，所述纯化分离中洗脱剂的流速为100～500mL/min。

与现有技术相比，本发明提供了一种戊柔比星的纯化方法，包括：将含戊柔比星粗品的溶液经过制备色谱仪进行纯化分离，得到纯化后的戊柔比星，其中，通过使所述纯化分离的洗脱剂由水、有机相和酸组成；且所述有机相为甲醇或乙醇：所述酸为甲酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸；纯化分离的洗脱方式为等度洗脱以及所述洗脱剂中的有机相的体积百分含量为65％～90％。进而使得本发明的纯化分离效果好，得到的纯化戊柔比星纯品纯度可达99.8％以上，单杂小于0.1％，收率可达66％以上。且通过以制备液相进行制备，耗时短，且使用溶剂易于回收，环境污染小。且该方法经过中试放大，工艺简单易行，适合工业放大生产。

附图说明

图1为实施例1的样品制备图；

图2为实施例1得到的纯化的戊柔比星的HPLC检测结果；

图3为戊柔比星粗品待测样的纯度验证结果。

具体实施方式

其中，所述纯化分离的洗脱剂由A相和B相组成；

所述A相为水；

所述B相为甲醇或乙醇；

所述纯化分离的洗脱方式为等度洗脱；

所述酸为甲酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸；

所述洗脱剂中的有机相的体积百分含量为65％～90％。

本发明中，本发明对戊柔比星粗品的来源没有特殊要求，可以是任意现有工艺制备的戊柔比星粗品，其中，所述戊柔比星粗品的纯度优选为60％以上，更优选为60％～97％，更优选为70～90％，最优选为80～86％；所述含戊柔比星粗品的溶液的浓度优选为10～500mg/mL，优选为80～120mg/mL，更优选为90～110mg/mL，最优选为100mg/mL。本发明对溶解戊柔比星粗品的溶剂亦没有特殊要求，可以与后续色谱分离用洗脱剂的组成相同。

本发明中，所述色谱纯化分离的洗脱剂中，所述酸优选为甲酸或三氟乙酸；其中，所述洗脱剂中的酸的体积百分含量优选为0.1％～0.4％，更优选为0.1％～0.2％；所述有机相优选为甲醇；所述洗脱剂中的有机相的体积百分含量优选为70％～85％，更优选为74.9％～79.9％。

本发明中，所述戊柔比星粗品与制备相色谱仪中的色谱柱填料的质量比(即载量)优选为0.1～9％，更优选为1～8％，最优选为2～6％，最优选为4.8～5.5％；所述所述制备色谱仪中的色谱柱填料为键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的硅胶，所述键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的硅胶中十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比优选为(1～6)∶1，更优选为(2～5)∶1，最优选为(3～4)∶1。

本发明中，所述色谱纯化分离中洗脱剂的流速优选为10～600mL/min，更优选为100～500mL/min；更优选为300～500mL/min，最优选为400～450mL/min。

本发明提供了一种戊柔比星的纯化方法，包括：将含戊柔比星粗品的溶液经过制备色谱仪进行纯化分离，得到纯化后的戊柔比星，其中，通过使所述纯化分离的洗脱剂由A相和B相组成；且所述A相为甲酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸与水组成酸性水溶液；所述B相为甲醇或乙醇；纯化分离的洗脱方式为等度洗脱以及所述洗脱剂中的甲B相的体积百分含量为65％～90％。进而使得本发明的纯化分离效果好，得到的纯化戊柔比星纯品纯度可达99.8％以上，单杂小于0.1％，收率可达66％以上。且通过以制备液相进行制备，耗时短，且使用溶剂易于回收，环境污染小。且该方法经过中试放大，工艺简单易行，适合工业放大生产。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

仪器和材料

戊柔比星粗品、高效液相色谱仪(紫外检测器)、Sepax制备液相色谱仪、分析色谱柱SAP-C18-5um(4.6mm*250mm)一根、分析天平(百分之一)一台、分析天平(万分之一)一台、容量瓶(10ml)、移液枪1ml和200ul各一把(配枪头)、磁力搅拌器一台、涡旋混合器、旋转蒸发仪一台、量筒(500ml、100ml)各一个、一次性滴管和5ml离心管各一包、2L锥形瓶若干、保鲜膜、记号笔及标签纸等

试剂

甲醇(工业级)、甲酸(分析纯)、磷酸(分析纯)、纯化水、三氟乙酸(分析纯)、乙腈(HPLC级)

实施例1戊柔比星粗品纯化

色谱柱：戊柔比星制备柱(100mm x 250mm)(所用填料为键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的硅胶)

流动相：

A：0.1％甲酸水溶液 B：甲醇(含0.1％的甲酸)

流速：400ml/min 进样量：400ml 柱温：室温

样品：100mg/ml 压力：1.2M Pa

仪器：Sepax制备色谱仪

检测波长：UV@254nm

等度洗脱：75％B

具体方法如下：

1.样品称取：在分析天平上称取戊柔比星粗品40g(4.8％载量)；

2.溶剂配制：配制含0.1％甲酸的75％的甲醇水溶液400ml，甲醇量取328ml，纯化水量取72ml，用移液枪量取甲酸400ul。三者混在一起，并搅拌均匀，配制两份，待用；

3.样品溶解：将上(2)配好的溶剂一份加到(1)40g戊柔比星粗品中，用保鲜膜封口，加入搅拌子，在磁力搅拌器上保持搅拌状态，使其充分溶解；

4.色谱柱平衡：在LC6000仪器上，A通道为0.1％甲酸水溶液，B通道为甲醇(含0.1％甲酸)，在接通戊柔比星制备柱的条件下，以400ml/min的流速冲洗，以25％B(100ml/min)、75％A(300ml/min)平衡柱子。平衡15min；

5.样品上样：(4)完成后停止所有泵，将A管道插入配好溶剂(2)的另一份中，以400ml/min的速度冲洗A管道，0.5min后停泵，将A管道换到配好的戊柔比星粗品中，以400ml/min的速度上样1min后停泵，换到前面(2)剩下的溶剂中以400ml/min冲洗0.5min后停泵；

6.样品洗脱：在(5)完成后将A泵换到0.1％甲酸水溶液中，同时开启制备工作站的在线信号记录，在400ml/min的条件下以75％B(300ml/min)冲洗柱子；

7.样品收集：在见到目标峰出现时开始收集样品，3min/管，一共接收12管。如图1所示，收集保留时间为24-60min的组分；图1为实施例1的样品制备图。

8.收集样品分析：收集样品在分析柱C18-5um上分析。

9.样品分析合并：取样经过HPLC检测后收集所有合格组分，合并后冷冻干燥，计算收率及取样通过对产品纯度进行检测。

其收率结果如表1所述，

表1

	质量(g)	液相纯度(％)	回收率(％)
				粗品	40	86.09	--
纯化后样品	28.78	99.87	71.95

注：纯化后样品质量及纯度均是指冻干后取样检测的结果。

通过高效液相对得到的纯化的戊柔比星进行纯度分析，分析方法如下：

色谱柱：Sepax SAP-C18(5um，4.6x 250mm)

流动相：

A：0.1％磷酸

B：乙腈

流速：1ml/min 进样量：5ul 柱温：40℃

样品：2mg/ml(60％甲醇溶解溶解)

仪器：Agilent 1260

检测波长：UV@254nm

按照表2梯度进行洗脱：

表2

Time(min)	A％	B％
			0	40	60
40	35	75

结果见图2，图2为实施例1得到的纯化的戊柔比星的HPLC检测结果。

关于上述戊柔比星产品纯度的检测方法，通过多方面对HPLC检测条件进行摸索得到上述戊柔比星的分析方法，并对该方法进行了验证，验证过程如下：

将已知粗品纯度为约86％的样品作为待测样；

色谱柱：Sepax SAP-C18(5um，4.6x 250mm)

流动相：

A：0.1％磷酸

B：乙腈

流速：1ml/min 进样量：5ul 柱温：40℃

样品：2mg/ml(60％甲醇溶解溶解)

仪器：Agilent 1260

检测波长：UV@254nm

按照表3梯度进行洗脱：

表3

Time(min)	A％	B％
			0	40	60
40	35	75

粗品分析结果如图3所示，图3为戊柔比星粗品待测样的纯度验证结果，从图中可以看出，该检测方法可以用于戊柔比星纯度的检测与理论结果一致，可以用于戊柔比星纯度的检测。

实施例2

采用与实施例1相同的制备色谱仪、制备柱以及洗脱方法

取含量86.09％(m/m)戊柔比星粗品40g，加入含0.1％三氟乙酸的80％的甲醇水溶液(V/V)400ml，搅拌使充分溶解；上经过80％的甲醇(含0.1％三氟乙酸)水溶液平衡后的戊柔比星层析柱(100mm×250mm，含填料质量约0.98kg)，上样流速200ml/min，上样后用80％的甲醇(含0.1％三氟乙酸)和20％含0.1％三氟乙酸的水溶液洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱85min，HPLC检测收集戊柔比星组分溶液，合并合格组分，冻干后即得戊柔比星纯品26.67g，HPLC检测纯度为99.87％，回收率66.68％。

实施例3

取戊柔比星粗品85g(纯度96.5％)，加入含0.1％三氟乙酸的80％甲醇(V/V)的水溶液800ml，搅拌使充分溶解；上经过80％的甲醇(水溶液(含0.1％三氟乙酸)平衡后的戊柔比星制备柱(100mm×250mm，含填料质量约0.98kg)，上样流速200ml/min，上样后用80％的甲醇(含0.1％三氟乙酸)和20％含0.1％三氟乙酸的水溶液洗脱，洗脱流速400ml/min，洗脱流速400ml/min，共洗脱85min，HPLC检测收集戊柔比星组分溶液，HPLC检测后各组分数据如表4：

表4

	质量(g)	回收率(％)
			粗品	85.00	--
纯度≥99.5	76.37	89.85
			纯度≥99.5，且单杂＜0.1％	69.15	81.35

对比例1

采用与实施例1相同的制备色谱仪以及制备柱

取含量96.50％(m/m)左右的戊柔比星粗品98g(10％载量)，加入含0.1％三氟乙酸的80％的甲醇(V/V)水溶液400ml，搅拌使充分溶解；上经过80％的甲醇(含0.1％三氟乙酸)水溶液平衡后的戊柔比星层析柱(100mm×250mm，含填料质量约0.98kg)，上样流速200ml/min，上样后用80％的甲醇(含0.1％三氟乙酸)水溶液洗脱，洗脱流速400ml/min，共洗脱85min，HPLC检测收集戊柔比星组分溶液，检测各收集组分，合并合格组分(单杂小于0.1％)，冻干后即得戊柔比星纯品27.38g，HPLC检测纯度为99.86％，回收率27.94％。实验可知上样载量高于10％时，收率明显下降。

对比例2

采用与实施例1相同的制备色谱仪以及制备柱

取含量86.09％(m/m)左右的戊柔比星粗品40g，加入含0.1％三氟乙酸的95％的甲醇(V/V)的水溶液400ml，搅拌使充分溶解；上经过95％的甲醇(含0.1％三氟乙酸)平衡后的戊柔比星层析柱(100mm×250mm，含填料质量约0.98kg)，上样流速200ml/min，上样后用95％的甲醇(含0.1％三氟乙酸)和5％含0.1％三氟乙酸的水溶液洗脱，洗脱流速400ml/min，洗脱流速400ml/min，共洗脱85min，HPLC检测收集戊柔比星组分溶液，检测各收集组分，合并合格组分(单杂小于0.1％)，冻干后即得戊柔比星纯品11.65g，HPLC检测纯度为99.86％，回收率29.13％。实验可知甲醇浓度高于95％时，收率明显下降。

对比例3

以专利CN108484689A一种戊柔比星合成方法提供的纯化方法作为对比例，与本发明的实施例3做详细对比。具体方法如下：

1.取一支规格为φ4*800的层析柱，用二氯甲烷清洗干净。

2.取200-300目硅胶62g，加入二氯甲烷适量，搅拌成稀糊状，倒入层析柱中，再以二氯甲烷充分洗涤，待用。

3.取戊柔比星粗品(纯度96.5％)5.2g以114ml二氯甲烷溶解充分，慢慢加入层析柱中，常压吸附。

4.吸附完毕后，分别以2倍柱体积二氯甲烷洗涤，然后分别以5倍柱体积二氯甲烷：乙酸乙酯(v：v)＝30∶1；5倍柱体积二氯甲烷：乙酸乙酯(v：v)＝20∶1；3倍柱体积二氯甲烷∶乙酸乙酯(v∶v)＝15∶1的展开剂洗脱，当有产品出来时，以二氯甲烷∶乙酸乙酯(v：v)＝12∶1洗脱，直至产品出完，HPLC跟踪检测。经过实验，本次洗脱耗时6.5h。

5.样品分析合并：HPLC检测后各组分数据如表5：

表5

	质量(g)	回收率(％)
			粗品	5.20	--
纯度≥99.5	4.05	77.88
			纯度≥99.5，且单杂＜0.1％	1.11	21.35

经过对比发现专利CN108484689A中的纯化方法纯化出的戊柔比星纯品加上单杂小于0.1％的限制要求后，收率才21.35％，而经过本方法制得的戊柔比星纯品收率可达到81.35％。对比之后发现，采用本方法获得的戊柔比星纯品收率更高，且耗时更短，具体对比数据如表6所示。对比之后本方法优势明显，且使用溶剂易于回收，环境污染小。

表6

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种戊柔比星的纯化方法，包括：将含戊柔比星粗品的溶液经过制备色谱仪进行纯化分离，得到纯化后的戊柔比星，

其中，所述纯化分离的洗脱剂由水、有机相和酸组成；

所述有机相为甲醇或乙醇；

所述酸为甲酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸；

所述纯化分离的洗脱方式为等度洗脱；

所述洗脱剂中的有机相的体积百分含量为65％～90％。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述戊柔比星粗品的纯度为60％～97％。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含戊柔比星粗品的溶液的浓度为10～500mg/mL。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱剂中的酸的体积百分含量为0.05％～0.5％。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱剂中的有机相的体积百分含量为75％～85％。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述制备色谱仪中的色谱柱填料为键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的硅胶。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的硅胶中十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比为(1～6)∶1。

8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述戊柔比星粗品与制备色谱仪中的色谱柱填料的质量比0.1～9％。

9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化分离中洗脱剂的流速为10～600mL/min。

10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化分离中洗脱剂的流速为100～500mL/min。