CN104513286B

CN104513286B - 一种分离纯化非达米星的方法

Info

Publication number: CN104513286B
Application number: CN201310446552.0A
Authority: CN
Inventors: 袁建栋; 黄仰青; 姚翠萍
Original assignee: Borui Pharmaceutical (suzhou) Ltd By Share Ltd
Current assignee: Brightgene Bio Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: CN104513286A

Abstract

本发明提供了一种分离纯化非达米星的方法，所述方法在分离纯化中采用C8反相硅胶作为填料进行柱层析，将非达米星用醋酸溶解上样，流动相洗脱，收集样品，经分离纯化后得到的非达米星HPLC纯度≥99.5%，单杂≤0.10%。本方法提供的非达米星的纯化方法，采用具有高选择性和高载样量的新型介质，柱效高，分辨率高，分离纯化效果更好，保留时间短，洗脱剂用量少，克服了现有技术中因柱效低，分离度差，制备的非达米星纯度低，杂质多的缺点。

Description

一种分离纯化非达米星的方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化方法，具体涉及高纯度非达米星的分离纯化方法，尤其是涉及HPLC纯度在99%以上的非达米星的分离纯化方法。

背景技术

非达米星（通用名：fidaxomicin，商品名：Dificid）是一种18元大环内酯类抗生素，由桔橙指孢囊菌（Dactylosporangium aurantiacum）发酵得到，属于台勾菌素（Tiacumicins）类化合物。非达米星由Optimer公司研发，于2011年5月27日获FDA批准，是近20多年来首次被FDA批准用于治疗难辨梭菌（难辨梭状芽胞杆菌）相关性腹泻（CDAD）的抗生素。其作用机理新颖，主要是通过抑制细菌的RNA聚合酶而产生迅速的抗难治梭状芽孢杆菌感染（CDI）作用。其治疗CDI优于现有药物。非达米星CAS: 873857-62-6；分子式：C₅₂H₇₄Cl₂O₁₈；结构式如下式I：

。

中国专利CN1688707A公开了采用反相介质压力液相色谱法，以硅胶键合C18为固定相，以乙腈/水/乙酸为流动相，提纯非达霉素的方法。该方法的缺点是只能制得93%纯度的非达霉素，收率只有30%，成本较高不适合工业化生产。

中国专利CN102993251A公开了一种用高效液相色谱纯化台勾霉素B的方法。该方法用Uni30BPC单分散性聚合物微球作为填料进行制备柱层析以制得较高纯度的非达霉素。但该方法的缺点是填料上样量少，制备色谱的投入大，成本高，台勾霉素B的回收率低。

中国专利CN102030791B公开了四种台勾菌素的制备方法，该方法将从大孔吸附树脂中提取的粗提物，先进行萃取和浓缩，得到粗品，粗品经过硅胶柱层析，凝胶柱层析，再次用硅胶柱层析，最后经过ODS反相中压液相色谱才能分别制备得到四中台勾菌素类化合物。该方法需要使用两次硅胶柱层析，并用到ODS反相中压液相色谱，操作繁琐，成本高。

现有技术中普遍存在纯化效率低，回收率低，分离效果差，操作繁琐的缺点。因此寻找一种操作简便，纯化效果好，回收率和纯度高的非达米星制备方法，对非达米星的产业开发具有很重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离纯化非达米星的方法，该方法不仅能提高非达米星的纯度和回收率，而且操作简单，收率高，生产成本低，适合于工业生产。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种分离纯化非达米星的方法，所述方法在纯化层析柱中采用C8反相硅胶作为填料进行柱层析，其中所述的C8反相硅胶填料粒径为5~50μm；优选，所述的C8反相硅胶填料粒径为5~30μm；进一步优选，所述的C8反相硅胶填料粒径为7~15μm；更进一步优选，所述的C8反相硅胶填料为UniSil 10-120-C8、SP-100-8-C8-HP、UniSil 10-170-C8、LiChrosorb RP-8、Kromasil 100-10-C8或Outstanding-7-C8。

所述的分离纯化非达米星的方法，是采用C8反相硅胶作为色谱柱的固定相，再将非达米星的样品溶液上样在色谱柱上，用流动相洗脱吸附在填料上的非达米星，收集样品。

进一步的，所述非达米星样品溶液是将非达米星粗品先用醋酸溶解，再用流动相稀释获得，优选将浓度稀释1倍。

进一步的，所述流动相为含有有机溶剂的水溶液，其中有几溶剂为色谱纯乙腈，水溶液为含有1%的冰醋酸的水溶液。

其中，用流动相洗脱吸附在填料上的非达米星的过程为乙腈与水溶液以45:55的体积比等度洗脱，流速800ml/min，洗脱150min；或者先用乙腈与水溶液以40:60的体积比洗脱50min，再以50:50的体积比洗脱100min，流速800ml/min。检测波长为280nm。

终产品非达米星的纯度的检测采用分析型反相高效液相色谱法，分析检测纯度在99.5%以上，且单杂均≤0.10%；回收率达到80%以上（色谱条件：色谱柱：YMC 4.6*250mm，5um，C18；柱温：30℃；流速：1mL/min；吸收波长：228nm；流动相：A：0.1%磷酸水溶液，B:乙腈（A:B=45:55等度洗脱））。

本发明提供的分离纯化非达米星方法，在纯化层析柱中采用粒径范围为5~50μm的C8反相硅胶作为填料进行柱层析，分离效果好，分离得到的非达米星纯度在99.5%以上，且单杂含量≤0.10%；同时，使用C8反相硅胶作为色谱柱的固定相，保留时间短，可以大大节省洗脱剂，减少有机溶剂的用量，降低生产成本，减少环境污染；本发明提供的分离纯化非达米星的方法，操作简单，非达米星的纯度和回收率显著提高。

附图说明

图1显示非达米星粗品的HPLC色谱图，HPLC纯度为63%。

图2显示由实施例1分离纯化的非达米星的HPLC色谱图，HPLC纯度为99.5%，杂质含量≤0.10%。

图3显示由实施例2分离纯化的非达米星的HPLC色谱图，HPLC纯度为99.9%，杂质含量≤0.10%。

图4显示由实施例3分离纯化的非达米星的HPLC色谱图，HPLC纯度为99.8%，杂质含量≤0.10%。

具体实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制，这里描述的特定的实施例仅仅是提供示范例子，在不背离本发明的精神和范围的前提下对本发明进行修改和变化，这一点对于本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明所用非达米星均为重庆乾泰生物医药有限公司发酵部门用微生物培育手段获得；所使用的UniSil 10-120 C8反相硅胶和UniSil 5-120 C18分析柱是由苏州纳微生物科技有限公司生产；其他未作说明试剂如乙腈、醋酸等及其他仪器均通过常规方法购得。

实施例1

（1）上样液准备

取65g非达米星粗品（HPLC谱图如附图1所示），溶于650ml冰醋酸中，溶解后用0.45μm聚四氟乙烯乙烯滤膜过滤，滤液进一步用650ml乙腈-1%的冰醋酸水溶液（乙腈与1%的冰醋酸水溶液的体积比为45:55）稀释至50mg/ml，作为下一步制备非达米星的样品溶液。

（2）分离纯化：

将步骤（1）稀释后的溶液1300ml，注入反相高效液相制备色谱仪（采用内径200cm，高25cm的玻璃柱，UniSil 10-120-C8反相硅胶作为层析填料，用量为4kg，先用45%的乙腈水溶液冲洗2个柱体积（CV），然后再用20%乙腈平衡2个CV），流动相由乙腈-1%的冰醋酸水溶液组成，乙腈-1%的冰醋酸水溶液的体积比为45:55，等度洗脱，流速800ml/min，共洗脱150min；紫外检测器在线检测，检测波长为280nm，针对性收集非达米星的制备组分，得到非达米星收集液。

（3）产品回收

将步骤（2）反相高效液相色谱分离得到非达米星溶液中乙腈经减压蒸馏（0.08~0.09MPa，20~30℃）除去，母液过滤，即得非达米星产品，真空干燥，总收率可达80%，产品经HPLC测定，纯度≥99.5%，单杂≤0.10%（HPLC色谱图见附图2）。

实施例2

按照实施例1中步骤（1）的方法准备非达米星的上样液，将稀释后的溶液13000ml，注入到反相高效液相制备色谱仪（采用内径200cm，高25cm的玻璃柱，UniSil 10-120-C8反相硅胶作为层析填料，用量为4kg，先用45%的乙腈水溶液冲洗2个柱体积CV，然后再用20%乙腈平衡2个CV），流动相由乙腈-水（含1%的冰醋酸）组成，对固定相进行梯度洗脱，即0~50min期间，乙腈-1%的冰醋酸水溶液的体积比为40:60；51~150min期间，乙腈-1%的冰醋酸水溶液的体积比为50:50；流速800ml/min，紫外检测器在线检测，检测波长为280nm，针对性收集非达米星的制备组分，得到非达米星收集液。

产品回收：将上述反相高效液相色谱分离得到非达米星溶液中乙腈经减压蒸馏（0.08~0.09MPa，20~30℃）除去，母液过滤，即得非达米星产品，真空干燥，总收率可达85%，产品经HPLC测定，纯度为99.9%，单杂≤0.10%（HPLC色谱图见附图3）。

实施例3

（1）上样液的准备：

取65g非达米星粗品（HPLC谱图如附图1所示），溶于650ml冰醋酸中，溶解后用0.45μm聚四氟乙烯乙烯滤膜过滤，滤液进一步用650ml乙腈-1%的冰醋酸水溶液（乙腈-1%的冰醋酸水溶液体积比为45:55）稀释至50mg/ml，作为下一步制备非达米星的样品溶液。

（2）样品的分离纯化

将步骤（1）稀释后的溶液1300ml，注入反相高效液相制备色谱仪（采用内径200cm，高25cm的玻璃柱，SP-100-8-C8-HP反相硅胶作为层析填料，用量为4kg，先用45%的乙腈水溶液冲洗2个柱体积CV，然后再用20%乙腈平衡2个CV），流动相由乙腈-1%的冰醋酸水溶液组成，乙腈-1%的冰醋酸水溶液的体积比为45:55，等度洗脱，流速800ml/min，紫外检测器在线检测，检测波长为280nm，针对性收集非达米星的制备组分，得到非达米星收集液。

将步骤（2）反相高效液相色谱分离得到非达米星溶液中乙腈经减压蒸馏（0.08~0.09MPa，20~30℃）除去，母液过滤，即得非达米星产品，真空干燥，总收率可达83.1%，产品经HPLC测定，纯度为99.8%，单杂≤0.10%（HPLC色谱图见附图4）。

实施例4

如实施例3的方法制备非达米星的样品溶液1300ml。

样品的分离纯化：将上述非达米星样品溶液1300ml，注入反相中压制备色谱仪（采用内径200cm，高25cm的玻璃柱，粒度为50μm的YWG-C8反相硅胶作为层析填料，用量为4kg，先用45%的乙腈水溶液冲洗2个柱体积CV，然后再用20%乙腈平衡2个CV），流动相由乙腈-1%的冰醋酸水溶液组成，乙腈-1%的冰醋酸水溶液的体积比为45:55，等度洗脱，流速800ml/min，紫外检测器在线检测，检测波长为280nm，针对性收集非达米星的制备组分，得到非达米星收集液。

将上述非达米星收集液中乙腈经减压蒸馏（0.08~0.09MPa，20~30℃）除去，母液过滤，即得非达米星产品，真空干燥，总收率可达83.1%，产品经HPLC测定，纯度为99.5%，单杂为0.10%。

参考实施例1的方法，分别以UniSil 10-170-C8、LiChrosorb RP-8、Kromasil100-10-C8和Outstanding-7-C8反相硅胶作为色谱柱的固定相，分离纯化非达米星，得到的非达米星终产品纯度均在99.5%以上，单杂均≤0.10%。

Claims

1.一种分离纯化非达米星的方法，其特征在于，所述方法在纯化层析柱中采用C8反相硅胶作为填料进行柱层析，其中所述的C8反相硅胶填料粒径为5～50μm；所述方法是采用C8反相硅胶作为色谱柱的固定相，再将非达米星的样品溶液上样在色谱柱上，用流动相洗脱吸附在填料上的非达米星，收集样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的C8反相硅胶填料粒径为5～30μm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的C8反相硅胶填料粒径为7～15μm。

4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述的C8反相硅胶填料为UniSil10-120-C8、SP-100-8-C8-HP、UniSil 10-170-C8、LiChrosorb RP-8、Kromasil 100-10-C8或Outstanding-7-C8。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非达米星的样品溶液是将非达米星粗品先用醋酸溶解，再用流动相稀释获得。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相为含有有机溶剂的水溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为色谱纯乙腈，水溶液为含有1％的冰醋酸的水溶液。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，流动相洗脱吸附在填料上的非达米星的过程为乙腈与水溶液以45:55的体积比等度洗脱，流速800ml/min，洗脱150min；或者是先用乙腈与水溶液以40:60的体积比洗脱50min，再以50:50的体积比洗脱100min，流速800ml/min。