CN111675738A - 一种吡柔比星的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种吡柔比星的纯化方法,包括S1将吡柔比星粗品配制成上样液;S2对制备柱进行上样;S3洗脱纯化分离,得到纯化的吡柔比星纯品。其中,纯化分离的溶剂和洗脱剂均由酸、水和有机相组成;其制备柱的填料为硅胶基质,该硅胶基质上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯。本发明的纯化方法采用以硅胶基质为填料,其硅胶上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的专用特色填料,经过分离纯化得到吡柔比星纯品,其纯度可达99.5%以上,单杂含量小于0.1%,回收率76%以上的吡柔比星纯品;该方法操作方便,省时省力,对环境污染小,其所使用的特色填料寿命长,可反复利用,且该纯化方法已经过放大生产验证,适合工业放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学纯化技术领域,具体涉及一种吡柔比星的纯化方法。
背景技术
吡柔比星(Pirarubicin),为红色结晶粉末。是一种广谱的抗肿瘤抗生素,对多种肿瘤均有作用,属于周期非特异性药物。适用于治疗乳腺癌,同时对输尿管癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌等恶性肿瘤也有一定的疗效。其分子式为:C32H37NO12,分子量为:627.636,分子结构式如式一所示:
吡柔比星为蒽环类抗生素药物,该药物的作用机理为:直接嵌入DNA双链核酸碱基对之间,干扰酶的转录过程,阻止mRNA的合成,抑制DNA聚合酶,从而干扰DNA的合成,使得在G2期的细胞不能进行有效分裂,最终导致肿瘤细胞死亡。
基于上述特性,研究吡柔比星的合成制备以及分离提出技术具有重要价值,其中,合成制备方法比较多,但是针对吡柔比星的纯化技术其专利及文献相对较少。其中专利CN101181280A提供了一种吡柔比星冻干制剂及其制备方法、专利CN101879144A吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质体冻干剂及其制备方法以及专利CN101352418A吡柔比星或盐酸吡柔比星脂质纳米粒及其制备方法等三篇,所涉及的方法均为吡柔比星药物制剂的制备方法,并未提及吡柔比星的纯化方法和相关分离技术。而中国药科大学的许建良等在西北药学杂志公开的《吡柔比星的分离与纯化》文献中提到了吡柔比星的纯化方法,该文献所提供的纯化工艺为用硅胶层析柱纯化吡柔比星粗品,以二氯甲烷-甲醇为洗脱液经过两步纯化,将含量35.7%的吡柔比星粗品纯化后得到纯度为99.6%的吡柔比星纯品。但其所提供的纯化方法,是采用硅胶色谱柱层析,对环境污染比较严重,且该纯化方法需要采用两步纯化法,其操作步骤繁琐,对吡柔比星纯化的工业放大生产借鉴意义不大。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,提供一种吡柔比星的纯化方法,该方法采用以硅胶基质为填料,其硅胶上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的专用特色填料,经过分离纯化得到吡柔比星纯品,其纯度可达99.5%以上,单杂含量小于0.1%,回收率76%以上的吡柔比星,且该纯化方法已经过放大生产验证。
为了实现上述目的,本发明提供一种吡柔比星的纯化方法,该纯化方法包括:
S1将吡柔比星粗品配制成上样液;S2对制备柱进行上样;S3洗脱纯化分离,得到纯化的吡柔比星纯品。
其中,所述步骤S1上样液由吡柔比星粗品加入溶剂进行充分溶解配制而成;
所述步骤S2制备柱进行上样,是用所述步骤S1吡柔比星粗品的上样液,对洗脱剂平衡好的吡柔比星制备柱进行上样,所述制备柱内装填硅胶基质填料,所述硅胶基质上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯;
所述步骤S3洗脱纯化分离是用洗脱剂对吡柔比星粗品的制备柱进行洗脱纯化分离,收集洗脱纯化分离组分,取样检测和冷冻干燥;所述洗脱纯化分离的溶剂和洗脱剂均由酸、水和有机相组成;所述酸为甲酸、三氟乙酸中的一种或两种混合;所述有机相为甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯中的一种或几种混合;所述酸、水和有机相组成的体积配比为0.5~2:100~400:600~900;所述制备柱的填料为硅胶基质,所述硅胶基质上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯。
优先的,所述十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比为1~10:1;
优先的,所述吡柔比星粗品的质量含量为65%~97%;
优先的,所述吡柔比星粗品与制备柱的填料的质量含量为0.1%~10%;
优先的,所述吡柔比星粗品的上样液的浓度为50mg/ml~100mg/ml;
优先的,所述吡柔比星粗品的上样液的流速为10ml/min~400ml/min;
优先的,所述纯化分离的洗脱剂的流速为10ml/min~400ml/min。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
1、该方法采用以硅胶基质为填料,其硅胶上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的专用特色填料,经过分离纯化得到吡柔比星纯品,其纯度可达99.5%以上,单杂含量小于0.1%,回收率76%以上的吡柔比星纯品。
2、其中有机相为甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯中的一种或某几种的组合,对生产设备及其检测仪器的腐蚀损坏小,可以有效节省设备仪器的维护成本。
3、本发明采用液相制备系统进行分离纯化,其方法操作方便,省时省力,对环境污染小,其所使用的特色填料寿命长,可反复利用,且该纯化方法已经过放大生产验证,适合工业放大生产。
附图说明
图1是本发明一种吡柔比星的纯化方法的样品制备图;
图2是本发明一种吡柔比星的纯化方法的实施例1得到的纯化吡柔比星HPLC检测结果;
图3是本发明一种吡柔比星的纯化方法的吡柔比星粗品的HPLC检测结果;
图4是本发明一种吡柔比星的纯化方法的对比例1得到的纯化吡柔比星HPLC检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明作进一步的详细说明,以使本领域技术人员能够充分理解本发明的技术内容。应当说明的是,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明提供一种吡柔比星的纯化方法,该纯化方法包括:S1将吡柔比星粗品配制成上样液;S2对制备柱进行上样;S3洗脱纯化分离,得到纯化的吡柔比星纯品。
其中,步骤S1上样液由吡柔比星粗品加入溶剂进行充分溶解配制而成;
步骤S2制备柱进行上样,是用步骤S1吡柔比星粗品的上样液,对洗脱剂平衡好的吡柔比星制备柱进行上样,制备柱内装填硅胶基质填料,硅胶基质上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯;
步骤S3洗脱纯化分离是用洗脱剂对吡柔比星粗品的制备柱进行洗脱纯化分离,收集洗脱纯化分离组分,取样检测和冷冻干燥;洗脱纯化分离的溶剂和洗脱剂均由酸、水和有机相组成;酸为甲酸、三氟乙酸中的一种或两种混合;有机相为甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯中的一种或几种混合;酸为甲酸、三氟乙酸中的一种或两种混合;酸、水和有机相组成的体积配比为(0.5~2):(100~400):(600~900)。
该制备柱的填料为硅胶基质,硅胶基质上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯;其中十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比为(1~10):1;
该吡柔比星粗品的质量含量为65%~97%;
该吡柔比星粗品与制备柱的填料的质量含量为0.1%~10%;
该吡柔比星粗品的上样液的浓度为50mg/ml~100mg/ml;
该吡柔比星粗品的上样液的流速为10ml/min~400ml/min;
该纯化分离的洗脱剂的流速为10ml/min~400ml/min。
该纯化方法包括如下步骤:
S1配制上样液:称取适量吡柔比星粗品,加入适量的溶剂充分溶解,配制成吡柔比星粗品的上样液;
S2制备柱上样:取适量步骤S1的吡柔比星粗品的上样液,对洗脱剂平衡好的吡柔比星制备柱进行上样,所用的吡柔比星制备柱内装填硅胶基质填料;
S3洗脱纯化分离:用洗脱剂对步骤S2上样完成的吡柔比星的制备柱进行洗脱纯化分离,收集洗脱纯化分离组分,取样经HPLC检测,合并合格样品,冻干即得吡柔比星纯品。
在本发明的步骤S1中的溶剂为酸、水和有机相组成。其中有机相为甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯中的一种或几种混合;优选的,酸、水和有机相的体积比为=0.5~2:100~400:600~900;酸优选为甲酸、三氟乙酸中的一种或两种,酸的体积百分比为0.1%~0.3%,更优选为0.15%~0.25%;优选的,其有机相的体积百分比为60%~90%,更优选为75%~85%。
所述吡柔比星粗品的纯度(质量百分数)为65%~97%,更优选为75%~85%。
所述吡柔比星粗品含量为65%~97%(质量比),吡柔比星粗品上样液的浓度为50~100mg/ml,吡柔比星粗品上样液与制备柱的填料的质量比即载量为0.1%~10%,优选为1%~9%,更优选为4%~9%,最优选为6.6%~8.6%。所述上样液的流速为10ml/min~400ml/min,所述洗脱剂的流速为10ml/min~400ml/min。
在本发明的步骤S2中的制备柱的填料为硅胶基质,硅胶基质上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯;其中,十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量百分比为(1~10):1,优选为(2~8):1,更优选为(4~6):1。
在本发明的步骤S2和S3中的洗脱剂为有机酸:水:有机溶剂:乙酸乙酯=0.5~2:100~400:600~900:20~80;其中有机酸优选为甲酸、三氟乙酸中的一种或两种;有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或几种。
在本发明的步骤S3中吡柔比星纯品的合并标准为样品纯度高于99.5%,且单杂小于0.1%。
1、仪器和材料:
吡柔比星粗品、高效液相色谱仪HPLC(紫外检测器)、Sepax制备液相色谱仪LC6000、分析色谱柱Sepax-SAP-C18-5um(4.6mm×250mm)一根、吡柔比星制备柱(100mm×250mm)、分析天平(百分之一)一台、分析天平(万分之一)一台、容量瓶(10ml)、移液枪1ml和200ul各一把(配枪头)、磁力搅拌器一台、涡旋混合器、量筒(500ml、100ml)各一个、一次性滴管和5ml离心管各一包、2L锥形瓶若干、保鲜膜、记号笔及标签纸。
2、试剂:
甲醇(分析纯)、甲酸(分析纯)、乙腈(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)、三氟乙酸(分析纯)、乙醇(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、纯化水等。
3、具体方法如下:
T1溶剂配制:
按比例配制溶剂A、B两份,溶剂体积比为甲酸:水:甲醇=(0.5~2):(100~400):(600~900),配制400ml,两份;
按比例配制洗脱剂C一份,洗脱剂体积比为甲酸:水:甲醇:乙酸乙酯=(0.5~2):(100~400):(600~900):(25~50),配制30L,一份;
T2样品称取:在分析天平上称取一定量的吡柔比星粗品(含量65%~97%),并放入锥形瓶;
T3样品溶解:将步骤T1配好的溶剂A加入到步骤T2的样品配制瓶中,并加入磁力搅拌子,用保鲜膜封闭瓶口,在磁力搅拌器上保持搅拌状态,使吡柔比星粗品充分溶解,形成吡柔比星粗品上样液,浓度为50mg/ml~100mg/ml;
T4制备柱平衡:在Sepax制备液相色谱仪LC6000仪器上,在接通吡柔比星制备柱(100mm×250mm)的条件下,用步骤T1配好的洗脱剂C以10ml/min~400ml/min的流速冲洗制备柱进行平衡,平衡时间15min,完成后停止泵;
T5样品上样:将D管道插入T1配好的溶剂B中,以10ml/min~400ml/min的速度冲洗管道,0.5min后停止泵;将D管道换到步骤T3配好的吡柔比星粗品上样液中,以10ml/min~400ml/min的速度上样,1min后停止泵;再将D管道换到溶剂B剩余液中以10ml/min~400ml/min的速度冲洗管道,0.5min后停止泵;
T6样品洗脱:将步骤T5的D管道换到洗脱剂C中,同时开启制备工作站的在线信号记录,在10ml/min~400ml/min的条件开始进行洗脱纯化分离;
T7样品收集:在见到目标峰出现时开始收集样品,收集保留时间为30min~54min的组分,如图1所示为实施例1样品制备图;
T8收集样品分析:收集样品在分析色谱柱Sepax-SAP-C18-5um上分析;
T9样品分析合并:取样经过HPLC检测后收集所有合格组分,合并后真空冷冻干燥,即得吡柔比星纯品,并计算样品回收率和对样品取样进行纯度检测。
实施例1:
洗脱剂体积比:甲酸:水:甲醇:乙酸乙酯=1:300:700:50;流速:400ml/min;进样量:400ml;柱温:室温;样品:100mg/ml;压力:1.1MPa;
仪器:Sepax制备色谱仪LC6000;吡柔比星制备柱(100mm×250mm,含填料质量约0.98kg);
检测波长:UV@254nm;等度洗脱70%C;
具体方法如下:
T1溶剂配制:按比例配制溶剂A、B两份,溶剂体积比为甲酸:水:甲醇=1:300:700,配制400ml,两份;按比例配制洗脱剂C一份,洗脱剂体积比为甲酸:水:甲醇:乙酸乙酯=1:300:700:50,配制30L,一份;
T2样品称取:在分析天平上称取吡柔比星粗品40g(含量65.87%,见表1或图2),并放入锥形瓶;
T3样品溶解:将步骤T1配好的溶剂A加入到步骤T2的样品配制瓶中,并加入磁力搅拌子,用保鲜膜封闭瓶口,在磁力搅拌器上保持搅拌状态,使吡柔比星粗品充分溶解,形成吡柔比星粗品上样液;
T4制备柱平衡:在Sepax制备液相色谱仪LC6000仪器上,在接通吡柔比星制备柱(100mm×250mm,含填料质量约0.98kg)的条件下,用步骤T1配好的洗脱剂C以400ml/min的流速冲洗制备柱进行平衡,平衡时间15min,完成后停止泵;
T5样品上样:将D管道插入T1配好的溶剂B中,以400ml/min的速度冲洗管道,0.5min后停止泵;将D管道换到步骤T3配好的吡柔比星粗品上样液中,以400ml/min的速度上样,1min后停止泵;再将D管道换到溶剂B剩余液中以400ml/min的速度冲洗管道,0.5min后停止泵;
T6样品洗脱:将步骤T5的D管道换到洗脱剂C中,同时开启制备工作站的在线信号记录,在400ml/min的条件下以70%C(280ml/min)开始进行洗脱洗脱纯化分离,冲洗制备柱;
T7样品收集:在见到目标峰出现时开始收集样品,3min/管,收集10管,收集保留时间为30min~54min的组分,如图1所示为实施例1样品制备图;
T8收集样品分析:收集样品在分析色谱柱Sepax-SAP-C18-5um上分析;
T9样品分析合并:取样经过HPLC检测后收集所有合格组分,合并后真空冷冻干燥,即得吡柔比星纯品,并计算样品回收率和对样品取样进行纯度检测(见表1或图3)。
其吡柔比星回收率结果如表1:
表1
项目 | 质量(g) | 纯度(%) | 回收率(%) |
粗品 | 40.00 | 65.87 | -- |
纯化后样品 | 31.29 | 99.72 | 78.23 |
注:该方法纯化后吡柔比星样品质量及纯度均是指冻干后取样检测的结果。
关于上述吡柔比星产品纯度的检测方法,是通过多方面对HPLC检测条件进行摸索得到的上述吡柔比星的分析方法,并对该方法进行了验证,验证过程如下:
将已知粗品纯度约为65.8%的样品作为待测样品;色谱柱SepaxSAP-C18-5um(4.6mm×250mm);流动相:磷酸0.1%,乙腈;流速1ml/min;进样量5μl;柱温40℃;样品:2mg/ml(60%甲醇溶解溶解);仪器:Agilent1260;检测波长:UV@254nm;
按照表2梯度进行洗脱:
表2
时间 | 磷酸(%) | 乙腈(%) |
0 | 40 | 60 |
45 | 30 | 70 |
粗品分析结果如图2所示,图2为吡柔比星粗品待测样的纯度验证结果,从图中可以看出,该检测方法可以用于吡柔比星纯度的检测,且与理论结果一致,可以用于吡柔比星纯度的检测。
对得到的吡柔比星纯化样品,用高效液相色谱HPLC进行纯度分析,分析方法如下:
分析色谱柱Sepax-SAP-C18-5um(4.6mm×250mm);流动相:磷酸0.1%,乙腈;流速1ml/min;进样量5μl;柱温40℃;样品:2mg/ml(60%甲醇溶解溶解);仪器:Agilent1260;检测波长:UV@254nm;
按照表3的梯度进行洗脱:
表3
时间 | 磷酸(%) | 乙腈(%) |
0 | 40 | 60 |
45 | 30 | 70 |
分析结果见图3,图3为实施例1得到的纯化的吡柔比星的HPLC检测结果。
实施例2:
采用与实施例1相同的制备色谱仪,制备柱和洗脱方法,其区别在于:
取吡柔比星粗品65g(载量6.6%),含量70.15%,用溶剂(甲酸:水:乙腈=1:350:650,体积比)400ml,磁力搅拌使充分溶解;经过洗脱剂(甲酸:水:乙腈:乙酸乙酯=1:350:650:30)洗脱平衡后的吡柔比星制备柱(100mm×250mm,含填料质量约0.98kg),上样液流速200ml/min,上样后用洗脱剂洗脱,洗脱剂流速400ml/min,共洗脱60min,收集吡柔比星纯化样品并用HPLC检测收集吡柔比星组分溶液,合并合格组分,冻干后即得吡柔比星纯品49.68g,HPLC检测纯度为99.71%,单杂小于0.1%,回收率76.43%。
按照上述方法制备的吡柔比星的检测结果参见表4。
表4
实施例3:
采用与实施例1相同的制备色谱仪,制备柱和洗脱方法,其区别在于:
取吡柔比星粗品77g(载量7.86%),含量85.80%,用溶剂(三氟乙酸:水:乙腈=1:350:650,体积比)400ml,磁力搅拌使充分溶解;经过洗脱剂(三氟乙酸:水:乙腈:乙酸乙酯=1:350:650:25)洗脱平衡后的吡柔比星制备柱(100mm×250mm,含填料质量约0.98kg),上样液流速200ml/min,上样后用洗脱剂洗脱,洗脱剂流速400ml/min,共洗脱60min,收集吡柔比星纯化样品并用HPLC检测收集吡柔比星组分溶液,合并合格组分,冻干后即得吡柔比星纯品59.87g,HPLC检测纯度为99.73%,单杂小于0.1%,回收率77.75%。
按照上述方法制备的吡柔比星的检测结果参见表5。
表5
项目 | 质量(g) | 纯度(%) | 回收率(%) |
粗品 | 77 | 85.80 | -- |
纯化后样品 | 59.87 | 99.73 | 77.75 |
实施例4:
采用与实施例1相同的制备色谱仪,制备柱和洗脱方法,其区别在于:
取吡柔比星粗品85g(载量8.67%),含量90.55%,用溶剂(三氟乙酸:水:甲醇=1:300:700,体积比)400ml,磁力搅拌使充分溶解;经过洗脱剂(三氟乙酸:水:甲醇:乙酸乙酯=1:300:700:45)洗脱平衡后的吡柔比星制备柱(100mm×250mm,含填料质量约0.98kg),上样液流速200ml/min,上样后用洗脱剂洗脱,洗脱剂流速400ml/min,共洗脱60min,收集吡柔比星纯化样品并用HPLC检测收集吡柔比星组分溶液,合并合格组分,冻干后即得吡柔比星纯品64.73g,HPLC检测纯度为99.79%,单杂小于0.1%,回收率76.15%。
按照上述方法制备的吡柔比星的检测结果参见表6。
表6
项目 | 质量(g) | 纯度(%) | 回收率(%) |
粗品 | 85 | 90.55 | -- |
纯化后样品 | 64.73 | 99.79 | 76.15 |
实施例5:
采用与实施例1相同的制备色谱仪,制备柱和洗脱方法,其区别在于:
取吡柔比星粗品90g(载量9.18%),含量96.75%,用溶剂(三氟乙酸:水:乙醇=1:330:670,体积比)400ml,磁力搅拌使充分溶解;经过洗脱剂(三氟乙酸:水:乙醇:乙酸乙酯=1:330:670:45)洗脱平衡后的吡柔比星制备柱(100mm×250mm,含填料质量约0.98kg),上样液流速200ml/min,上样后用洗脱剂洗脱,洗脱剂流速400ml/min,共洗脱60min,收集吡柔比星纯化样品并用HPLC检测收集吡柔比星组分溶液,合并合格组分,冻干后即得吡柔比星纯品68.81g,HPLC检测纯度为99.64%,单杂小于0.1%,回收率76.45%。
按照上述方法制备的吡柔比星的检测结果参见表7。
表7
项目 | 质量(g) | 纯度(%) | 回收率(%) |
粗品 | 90.00 | 96.75 | -- |
纯化后样品 | 68.81 | 99.64 | 76.45 |
对比例1:
依据背景技术中提到《西北药学杂志》公开的文献《吡柔比星的分离与纯化》中提到的吡柔比星纯化方法有两步纯化,而本发明专利采用的是一步纯化法。故将文献《吡柔比星的分离与纯化》中提到的吡柔比星纯化方法选取精制这一步(即重复文献中公开的方法)作为本发明专利的对比例一,具体步骤如下:
规格3cm*50cm静态玻璃制备柱装填200-300目硅胶(青岛海洋化工厂,粗孔,ZCX-Ⅱ型,试剂纯)一根,高度17cm(柱床体积120ml),待用;纯化条件为:含量65.87%(m/m)的吡柔比星粗品上样2.00g(上样载量为16.6mg/ml柱体积),用洗脱剂二氯甲烷-甲醇按9:1进行洗脱,洗脱流速3.5ml/min。HPLC检测收集吡柔比星组分溶液,合并合格组分,冻干后即得吡柔比星纯品0.83g,HPLC检测纯度为99.64%,回收率41.50%。实验可知回收率较低。样品HPLC检测结果见图4。
按照上述方法制备的吡柔比星的检测结果参见表8。
表8
项目 | 质量(g) | 纯度(%) | 回收率(%) |
粗品 | 2.00 | 65.87 | -- |
纯化后样品 | 0.83 | 99.64 | 41.50 |
对比例2:
采用与实施例1相同的制备色谱仪和制备柱。
取吡柔比星粗品32.58g,(上样载量为16.6mg/ml柱体积)含量65.87%(m/m),加入三氟乙酸:水:甲醇=1:300:700(V/V)400ml,搅拌使充分溶解;上经过洗脱液(三氟乙酸:水:甲醇:乙酸乙酯=1:300:700:45)平衡后的吡柔比星层析柱(100mm×250mm,含填料质量约0.98kg),上样流速200ml/min,上样后用洗脱液(三氟乙酸:水:甲醇:乙酸乙酯=1:300:700:45)洗脱,洗脱流速400ml/min,共洗脱60min,HPLC检测收集吡柔比星组分溶液,合并合格组分,冻干后即得吡柔比星纯品26.77g,HPLC检测纯度为99.79%,回收率82.17%。实验可知,相同16.6mg/ml柱体积时,本发明的收率是与对比例1的近2倍。
按照上述方法制备的吡柔比星的检测结果参见表9。
表9
项目 | 质量(g) | 纯度(%) | 回收率(%) |
粗品 | 32.58 | 65.87 | -- |
纯化后样品 | 26.77 | 99.79 | 82.17 |
对比例3:
采用与实施例1相同的制备色谱仪和制备柱。
取吡柔比星粗品99g(上样载量10.1%),含量97.02%(m/m),用三氟乙酸:水:甲醇=1:300:700(V/V)400ml,搅拌使充分溶解;上经过洗脱剂(三氟乙酸:水:甲醇:乙酸乙酯=1:300:700:45)平衡后的吡柔比星制备柱(100mm×250mm,含填料质量约0.98kg),上样流速200ml/min,上样后用洗脱剂(三氟乙酸:水:甲醇:乙酸乙酯=1:300:700:45)洗脱,洗脱流速400ml/min,共洗脱60min,HPLC检测收集吡柔比星组分溶液,合并合格组分,冻干后即得吡柔比星纯品25.43g,HPLC检测纯度为99.64%,回收率25.69%。上样量高(上样载量10.1%)时收率严重下降。
按照上述方法制备的吡柔比星的检测结果参见表10。
表10
项目 | 质量(g) | 纯度(%) | 回收率(%) |
粗品 | 99 | 97.02 | -- |
纯化后样品 | 25.43 | 99.64 | 25.69 |
通过上述实施例,我们可知,本发明的纯化方法采用以硅胶基质为填料,其硅胶上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯的专用特色填料,经过分离纯化得到吡柔比星纯品,其纯度可达99.5%以上,单杂含量小于0.1%,回收率76%以上的吡柔比星。其方法操作方便,省时省力,对环境污染小,其所使用的特色填料寿命长,可反复利用,且该纯化方法已经过放大生产验证,适合工业放大生产。
需要指出的是,上述较佳实施例仅为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种吡柔比星的纯化方法,该纯化方法包括如下步骤:
S1将吡柔比星粗品配制成上样液;
S2对制备柱进行上样;
S3洗脱纯化分离,得到纯化的吡柔比星纯品。
2.根据权利要求1所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:
所述步骤S1上样液由吡柔比星粗品加入溶剂进行充分溶解配制而成;
所述步骤S3洗脱纯化分离是用洗脱剂对吡柔比星粗品的制备柱进行洗脱纯化分离,收集洗脱纯化分离组分,取样检测和冷冻干燥;
所述洗脱纯化分离的溶剂和洗脱剂均由酸、水和有机相组成。
3.根据权利要求2所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:
所述酸为甲酸、三氟乙酸中的一种或两种混合;
所述有机相为甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯中的一种或几种混合。
4.根据权利要求2或3所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:所述酸、水和有机相组成的体积配比为0.5~2:100~400:600~900。
5.根据权利要求1所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:
所述步骤S2制备柱进行上样,是用所述步骤S1吡柔比星粗品的上样液,对洗脱剂平衡好的吡柔比星制备柱进行上样,所述制备柱内装填硅胶基质填料,所述硅胶基质上键合十八烷基硅烷和二乙烯基苯。
6.根据权利要求5所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:所述十八烷基硅烷和二乙烯基苯的质量比为1~10:1。
7.根据权利要求1或2或5所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:所述吡柔比星粗品的质量含量为65%~97%。
8.根据权利要求7所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:所述吡柔比星粗品与制备柱的填料的质量含量为0.1%~10%。
9.根据权利要求8所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:所述吡柔比星粗品的上样液的浓度为50mg/ml~100mg/ml。
10.根据权利要求9所述的一种吡柔比星的纯化方法,其特征在于:所述吡柔比星粗品的上样液的流速为10ml/min~400ml/min;洗脱剂的流速为10ml/min~400ml/min。
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