CN1939568A - 一种硝化苯硼酸亲和色谱预柱及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及亲和色谱柱，具体地说是一种硝化苯硼酸亲和色谱预柱及其制备和应用；预柱填料为硅胶基硝化苯硼酸，用于HPLC在线富集临顺二羟基化合物。本发明预柱除了具有的耐压和不溶涨的特点外，较未硝化苯硼酸功能基团对应的亲和色谱预柱具有保留强度大和保留适用pH宽等优点，非常适于两柱联用的HPLC在线分析系统，定性定量结果好。
Description
技术领域
本发明涉及亲和色谱柱，具体地说是一种硝化苯硼酸亲和色谱预柱及其制备和应用。
背景技术
亲和色谱是分离分析各类生物分子的强有力工具，硼酸类亲和色谱是其中重要的一类。碱性条件下，硼酸基团能与临顺二羟基结构作用，生成稳定的五元环络合物，酸性条件下络合被打开。这一特性赋予了硼酸类亲和色谱材料富集提取含有临顺二羟基结构的各类生物分子的能力，其中苯硼酸为功能基的硼酸类亲和色谱材料应用最多，已报道的富集、纯化、分离的应用很广，比如核糖核苷、核苷、修饰核苷、寡核苷酸等的分离，细胞中苯并芘-DNA加合物的分离，核苷肽类生物分子的分离，儿茶酚类生物分子的分离，儿茶酚雌激素与其它激素的分离，糖类的分离，tRNA混合物中特别结构tRNA的分离，封闭mRNA与未封闭mRNA的分离，二磷酸核糖蛋白与其它一般蛋白的分离，γ-干扰素和免疫球蛋白IgG的分离，糖蛋白的分离，膜糖蛋白的分析，丝氨酸蛋白酶与其它酶的分离等[文献1.RamP.Singhal，S.Shyamali，M.DeSilva.Adv Chromatogr，1992，31：293-335]。
对于硼酸类亲和色谱材料，纤维素，丙烯酰胺，硅胶，多孔玻璃，琼脂糖，右旋糖苷等都能作其支持物[文献1.Ram P.Singhal，S.Shyamali，M.DeSilva.Adv Chromatogr，1992，31：293-335]，另外还有共聚物作支持物的报道[文献2.K-S.Boos，B.Wilmers，E.Schlimme，R.Sauerbrey.J.Chromatography，1988，456：93-104；文献3.K-S.Boos，B.Wilmers，R.Sauerbrey，E.Schlimme.US4767529(1988)]。已见的商品化的硼酸类亲和色谱材料以丙烯酰胺和琼脂糖为支持物，它们的支持基体质地软，且易溶涨，不适于HPLC在线分析系统。申请人以前使用过从Bio-Rad购买的商品化苯基硼酸亲和凝胶Affi-Gel601，该材料以丙烯酰胺为支持物，在较大直径的经典玻璃柱中进行尿样中核苷的亲和预处理，工作烦琐，且材料在管柱内溶涨经常变形，因此所填充的柱床不致密稳定，进而会影响样品平行处理的稳定性，导致定量偏差大。以硅胶为支持物的硼酸类亲和色谱材料有耐压和不溶涨的特点，非常适于两柱联用的HPLC在线分析系统。硅胶为支持物的苯硼酸类亲和色谱材料已见报道的有两种[文献4.M.Glad，S.Ohlson，L.Hansson.，M-O.Mansson.，K.Mosbach.J.Chromatography，1980，200：254-260；文献5.E.Hagemeier，K-S.Boos，E.Schlimme，K.Lechtenborger，Kettrup.J.Chromatography，1983，268：291-295]，K-S.Boos等把其中的一种设计成了硼酸亲和色谱预柱[文献5.E.Hagemeier，K-S.Boos，E.Schlimme，K.Lechtenborger，Kettrup.J.Chromatography，1983，268：291-295]]，申请人把该预柱与本发明制得预柱进行过性能比较，本文中以下称该预柱为“对照预柱”。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的适用于HPLC高压环境，对含有临顺二羟基结构的成分，进行在线富集的硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱预柱，该预柱与后接的分析柱通过阀切换构成中心切割二维HPLC，完成复杂体系的直接进样和分离分析。本发明合成了一种硝化硅胶基苯硼酸填料，高压下装成亲和色谱预柱，对尿中多种修饰核苷进行了分离分析，取得了良好的定性定量结果。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种硝化苯硼酸亲和色谱预柱，预柱填料为硅胶基硝化苯硼酸；即以硅胶为支持物，硝化苯硼酸为功能基团。
所述硝化苯硼酸可为3-氨基-4-硝基苯硼酸，功能基团与支持物间的连接链可为环氧化偶联剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。
硝化苯硼酸亲和色谱预柱具体制备过程如下：
1.预柱填料合成：首先由间氨基苯硼酸制得3-氨基-4-硝基苯硼酸，作为功能基团，选择比表面大硅胶作填料的支持基体，选择环氧化偶联剂γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷作功能基团与支持基体的连接链。按以下三大步反应合成了一种新的硝化硅胶基苯硼酸亲和色谱填料：
第一步为间氨基苯硼酸的硝基化，由氨基保护、硝化和脱保护三个反应完成。
第二步为硅胶的环氧化，为增大预柱苯硼酸功能基的容量，选用比表面大的小粒径5μm硅胶，用无水四氯化碳为反应溶剂，环氧化偶联剂为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。
第三步为硅胶的苯硼酸化，反应在pH值7.5水溶液内进行。
2.制得的硅胶基硝化苯硼酸亲和填料匀浆法装柱，以四氯化碳为匀浆剂。柱子为适于HPLC的耐压抛光不锈钢柱，柱长和内径可以依据实际的分离任务确定。为了适于HPLC在线分析系统，装柱操作压力不低于2000psi。
所述亲和色谱预柱可用于两柱联用的HPLC在线分析系统，用于HPLC在线富集临顺二羟基化合物。
本发明具有如下优点：
1.定性定量结果好。本发明是以硅胶为支持物制得硝化苯硼酸亲和色谱预柱，与对照预柱相比；本发明预柱除了硅胶为支持物预柱都具有的耐压和不溶涨的特点外，具有保留强度大和保留适用pH宽等优点，非常适于两柱联用的HPLC在线分析系统，定性定量结果好。
其优良的特性和苯硼酸功能基团的硝化相关，硝化苯硼酸的pKa比苯硼酸的pKa有明显的下降，同pH条件下硼酸的电离能力加强，亲和能力加大。硝化苯硼酸适用的pH值底线比苯硼酸的低，对照预柱保留核苷的最佳pH值为8.50，而本发明预柱在pH值8.00以下即能达到良好的保留效果。更接近中性的操作条件，对生物样品的稳定性和延长预柱使用的寿命等都会有积极意义。
研究证明人尿中多种修饰核苷作为疾病标志物，在预测人体是否发生癌变方面有重要的应用。中心切割二维HPLC在快速对尿中核苷进行分离分析方面有不可替代的作用，其中能实现在线富集纯化的专用亲和色谱预柱是能否实现快速准确分离分析的一个关键因素[文献6.郑育芳.基于尿中核苷对恶性肿瘤诊断及随访的研究，中国科学院研究生院博士学位论文，2003]。本发明制得的硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱预柱，应用于该中心切割二维HPLC系统，在分离分析作为疾病标志物的尿中多种修饰核苷上取得了良好的效果。
附图说明
图1为六通阀处于“LOAD”位置的中心切割二维HPLC系统图；其中1为高压泵一，2为高压泵二，3为高压泵三，4为混合器，5为六通阀，6为自动进样器，7为本发明实施例中所制备的亲和色谱预柱，8为分析柱，9为紫外-可见检测器，10为废液瓶；
图2.为尿样中核苷及内标Br8G在线分析图；
图中，峰识别：1.假尿嘧啶核苷，2.胞嘧啶核苷，3.尿嘧啶核苷，4.1-甲基腺苷，5.1-甲基次黄嘌呤核苷，6.1-甲基鸟苷，7.N4-乙酰胞苷，8.2-甲基鸟苷，9.腺嘌呤核苷，10.2，2-二甲基鸟苷，11.8-溴化鸟苷，12.6-甲基腺苷；
色谱条件：泵一1：0.25mol/LNH4Ac(pH 7.95)，泵二2：25mmol/LKH2PO4(pH 4.50)，泵三3：甲醇-水(60∶40，v/v)，进样100μl，紫外检测260nm；
图3-1为对照预柱的性能图谱；
图3-2为本发明预柱的性能图谱。
具体实施方式
实施例1
所用药品中，间氨基苯硼酸、LiChrosorb Si100，5μm硅胶和γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷购自Sigma，其余皆分析纯。
(1)硅胶基苯硼酸填料合成
功能基团硝化苯硼酸的制备：称取1.1160g间氨基苯硼酸，溶于24ml二次蒸馏水，加入0.80ml苯甲酰氯，氮气保护下振摇1小时。乙酸乙酯三次萃取，每次30ml，合并有机层，真空抽干。产物加入冰浴中的5mlH2SO4/HNO3(4∶1，v/v)混酸，溶解后加饱和氢氧化钠和碳酸氢钠溶液至pH值3.0，冰浴，缓慢滴加。加等体积乙酸乙酯三次萃取，合并有机层，真空抽干。产物用乙醇/乙酸乙酯(6∶4，v/v)作流动相过硅胶柱，取第二色带，真空抽干，得3-氨基-4-硝基苯硼酸。
支持基体硅胶环氧化：称取LiChrosorb Si100，5μm硅胶1.5g，160℃干燥过夜，加入经分子筛干燥的四氯化碳60ml，氮气保护，加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷6ml，搅拌加热回流24小时。反应后硅胶抽滤，依次用50ml丙酮、二氯甲烷、乙醚冲洗，抽干。
硅胶苯硼酸化：上面获得的环氧化硅胶加二次蒸馏水60ml，称取400mg3-氨基-4-硝基苯硼酸，加入反应液，5mol/L氢氧化钠溶液调pH值7.5，升温至90℃，搅拌反应24小时。产物苯硼酸化硅胶抽滤，依次用50ml水、甲醇、二氯甲烷、乙醚冲洗，抽干。
(2)预柱填装
以四氯化碳为匀浆剂，加填料，超声10分钟。空柱子为耐压抛光卡套式不锈钢柱，柱长35mm，内径4.6mm。选氮气作为匀浆装柱机驱动力，装柱操作压力3000psi。压力稳定后，继续维持装柱压力20分钟，然后停气减压，卸下柱子，加装另一柱头，接入液相系统，甲醇冲洗至无紫外吸收杂质，备用。
(3)预柱应用于中心切割二维HPLC中，对含有临顺二羟基结构生化样品进行在线富集(以分析尿中核苷为例)。
研究证明人尿中多种修饰核苷作为疾病标志物，在预测人体是否发生癌变方面有重要的应用；中心切割二维HPLC在快速对尿中核苷进行分离分析方面有不可替代的作用，其中能实现在线富集纯化的专用亲和色谱预柱是能否实现快速准确分离分析的一个关键因素[文献6.郑育芳.基于尿中核苷对恶性肿瘤诊断及随访的研究，中国科学院研究生院博士学位论文，2003]。
如图1所示，构建中心切割二维HPLC系统，主要由三个高压泵(LC-10ATVP)、自动进样器(SIL 10ADVP)、六通阀(Rheodyne，USA)、混合器(Mixer SUS)、亲和色谱柱(柱7，为实施例中所制备预柱)、分析柱(柱8，对照预柱，Hypersil ODS2，250×4.6mm I.D，大连伊利特)和紫外-可见检测器(SPD-10AVP UV-Vis detector)组成。除色谱柱外，其它部件来自Shimadzu(Kyoto，Japan)。
操作流程如下：
洁净尿样用氨水调节pH值为8.0，加入内标，通过自动进样器直接上样，由泵1提供保留缓冲液经过六通阀1-6淋洗亲和色谱柱(柱7)，使得尿中目标核苷组分亲合到预柱上；尿中保留小的非目标基质成分经过亲和预柱和六通阀4-5流入废液排出管路。
保留完毕后，六通阀切换位置，经由混合器分别来自泵二2、泵三3的梯度洗脱液再经过刚接通的六通阀的3-4-(柱1)-1-2位置，将柱7上络合的尿中核苷组分洗脱下来，到达色谱分析柱，进而完成分离分析。
尿中核昔组分分离图参见图2：
可以从对照预柱与本发明预柱的性能比较看出本发明预柱的优点。实验选择同一尿样，都进样100μl，两柱都处于最佳使用条件下，即除对照预柱使用时泵1缓冲液pH值选择8.50外，其余色谱条件都与实施例中相同。
从以下同尺度输出分离分析图比较可以直观看出，本发明预柱对应结果峰形好，目标组分基线分离好，核苷目标区域内出峰的数目增多，参见图3-1、3-2所示。计算结果显示，本发明预柱线性、重现性和回收率各项指标都优于对照预柱，见表1。
表1.对照预柱与发明预柱线性、重现性和回收率各项指标对比表
| Compound化合物 | Correlation Coefficient(R) | RSD(％) | Recovery | |||
| 对照柱 | 本发明柱 | 对照柱明柱 | 本发 | 对照柱柱 | 本发明 | |
| PseuCUm1Am1Gac4Cm2GAm22Gm6A | 0.99720.99040.99940.99940.99870.99940.99940.99940.99960.9997 | 0.99830.99530.99960.99970.99900.99940.99940.99960.99970.9997 | 1.83.97.72.71.76.64.71.82.12.1 | 1.92.81.62.01.72.21.83.41.47.5 | 95.34-89.4986.1898.2391.7882.8490.3390.87- | 110.813.2383.688.6786.4384.1590.7392.794.3491.25 |
Claims (4)
1.一种硝化苯硼酸亲和色谱预柱，其特征在于：预柱填料为硅胶基硝化苯硼酸。
2，按照权利要求1所述硝化苯硼酸亲和色谱预柱，其特征在于：所述硝化苯硼酸为3-氨基-4-硝基苯硼酸。
3.一种权利要求1所述硝化苯硼酸亲和色谱预柱的制备，其特征在于：预柱填料的合成过程如下，
1)功能基团硝化苯硼酸的制备：以间氨基苯硼酸为原料，苯甲酰氯作为氨基保护剂，以体积比4∶1的浓硫酸和浓硝酸为硝化试剂制得3-氨基-4-硝基苯硼酸；
2)支持基体硅胶环氧化：环氧化偶联剂为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷；
3)硅胶苯硼酸化，合成预柱填料硅胶基硝化苯硼酸。
4.一种权利要求1所述硝化苯硼酸亲和色谱预柱的应用，其特征在于：所述亲和色谱预柱用于两柱联用的HPLC在线分析系统，用于HPLC在线富集临顺二羟基化合物。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103063776A (zh) * | 2012-12-29 | 2013-04-24 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种柱转换测定尿液中cema和hema含量的方法 |
| CN104667877A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-06-03 | 中南大学 | 在表面含有羟基的氧化物表面进行芳基硼酸修饰的方法 |
| CN106076298A (zh) * | 2016-06-13 | 2016-11-09 | 哈尔滨工业大学 | 一种用于壳寡糖分离的苯硼酸化亲和色谱固定相的制备方法 |
| CN112823875A (zh) * | 2019-11-20 | 2021-05-21 | 上海安谱实验科技股份有限公司 | 一种苯硼酸固相萃取柱填料及其制备方法 |
| WO2022244890A1 (ja) * | 2021-05-21 | 2022-11-24 | 東ソー株式会社 | ボロン酸アフィニティクロマトグラフィー用分離剤担体、カラム及びそれを用いた測定方法 |
| CN115584102A (zh) * | 2022-09-15 | 2023-01-10 | 丁克锋 | 一种抗蠕变绝缘工程塑料及其制备方法 |
-
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103063776A (zh) * | 2012-12-29 | 2013-04-24 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种柱转换测定尿液中cema和hema含量的方法 |
| CN104667877A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-06-03 | 中南大学 | 在表面含有羟基的氧化物表面进行芳基硼酸修饰的方法 |
| CN104667877B (zh) * | 2015-01-12 | 2017-07-18 | 中南大学 | 在表面含有羟基的氧化物表面进行芳基硼酸修饰的方法 |
| CN106076298A (zh) * | 2016-06-13 | 2016-11-09 | 哈尔滨工业大学 | 一种用于壳寡糖分离的苯硼酸化亲和色谱固定相的制备方法 |
| CN106076298B (zh) * | 2016-06-13 | 2018-11-02 | 哈尔滨工业大学 | 一种苯硼酸化亲和色谱固定相的应用 |
| CN112823875A (zh) * | 2019-11-20 | 2021-05-21 | 上海安谱实验科技股份有限公司 | 一种苯硼酸固相萃取柱填料及其制备方法 |
| CN112823875B (zh) * | 2019-11-20 | 2023-03-10 | 上海安谱实验科技股份有限公司 | 一种苯硼酸固相萃取柱填料及其制备方法 |
| WO2022244890A1 (ja) * | 2021-05-21 | 2022-11-24 | 東ソー株式会社 | ボロン酸アフィニティクロマトグラフィー用分離剤担体、カラム及びそれを用いた測定方法 |
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