CN113262768B - 豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱及制备方法和应用,具体为一种基于共价印迹及印迹后修饰方法制备豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱。以豆蔻酰化四肽为模板,利用功能单体4‑烯丙氧基苯甲醛中的醛基与模板分子中的氨基发生共价反应形成席夫碱的特点得到模板‑功能单体复合物,除去模板分子后,再利用氢氧化钠的歧化作用使醛基发生歧化反应变成羟基和羧基,得到印迹后修饰的分子印迹整体柱。该方法简便易行,可提高印迹整体柱的富集效果,对于豆蔻酰化蛋白组学的研究具有重要的研究意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱及制备方法和应用,具体为一种基于共价印迹及印迹后修饰方法制备豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱。以豆蔻酰化四肽(Myristoylated tetrapeptide)为模板,利用共价印迹方法合成新型印迹整体柱,并通过印迹后修饰方法对整体柱进行后处理,解决了模板与功能单体再结合困难的问题,而且提高了印迹整体柱的富集效果,增强了豆蔻酰化修饰的多肽鉴定能力,在修饰蛋白组学领域有良好的应用前景。
背景技术
蛋白质N-豆蔻酰化修饰是由豆蔻酰化转移酶介导的,在蛋白质N端甘氨酸上共价连接上14-碳饱和脂肪酸的一种重要的蛋白质翻译后修饰。其首次发现是在1982年,cAMP依赖性蛋白激酶的N端被豆蔻酰化,目前已确定了100多种豆蔻酰化蛋白质,包括丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶、激酶底物蛋白、磷酸酯酶和参与信号传导的其他蛋白,主要参与细胞生长发育、信号传导、肿瘤发生及病毒复制组装等生理过程。由于本身的低丰度、强亲脂性和差抗原性,目前常规的检测方法是放射性同位素标记法,但是存在耗时、价格昂贵、易产生有毒物质等问题。另一种方法是采用叠氮肉豆蔻酸类似物对蛋白质进行代谢标记,然后通过生物素偶联的捕获试剂富集。该方法的优点是背景标记少,但是,由于高度混杂的脂肪酰化机制和脂肪酸代谢,特异性较差。因此,研究豆蔻酰化蛋白质直接高效富集方法对于豆蔻酰化蛋白质组学的鉴定具有很大的研究意义。
分子印迹是为模板分子量身定做的具有识别性能高聚物材料的合成技术,该法制备的分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer,MIP)具有与目标分子形状和功能基高度匹配的三维空穴,可实现对目标分子“锁-钥”模式的识别,是优异的选择性分离及纯化手段。MIP具有选择性强、稳定性好、方法简单等优点,目前常用于固相微萃取、电化学传感、色谱分离等领域。分子印迹技术大多采用非共价印迹法,即模板与功能单体间通过非共价键(氢键、离子键、配位键等)相互结合,该方法具有操作简便的优点,但存在选择性差,容易产生非特异性吸附等问题,因此在蛋白组学的研究较少,发展相对缓慢。近来,针对蛋白质翻译后修饰发展了一些分子印迹新技术,如基于硼酸配体与顺式二羟基化合物可逆结合的原理的硼亲和分子印迹技术可实现对糖蛋白的特异性识别与富集;基于磷酸基团与金属离子的亲和力与分子印迹技术相结合,可以选择性地对磷酸化蛋白质及肽段进行富集与纯化等,但这些方法难于用于豆蔻酰化肽的富集。
为了解决这一问题,本发明通过共价印迹法结合印迹后修饰方法为豆蔻酰化肽的特异性识别开辟一条新的途径。
共价印迹法是指模板分子与功能单体以共价键的形式结合形成模板-功能单体复合物,该复合物在交联剂的作用下连接到聚合物基质上。例如,中国专利 CN201610480736. 2 利用共价印迹法,通过丹参素与丙烯醇的共价结合, 在交联剂、引发剂、致孔剂的作用下制备丹参素的分子印迹聚合物,用于从丹参中选择性地提取丹参素。目前,常见的共价键包括硼酸酯、席夫碱、缩醛(酮)等。其中,席夫碱是指由醛或酮与氨或胺缩合形成具有亚胺或甲亚胺特性基团(-C=N-)的一类有机化合物。迄今为止,尚无涉及基于合成席夫碱的共价印迹方法制备的豆蔻酰化四肽分子印迹整体柱的专利申请件。利用此原理制备印迹整体柱,可以提高对模板分子的选择性,成功地解决了非共价印迹方法存在的非特性吸附问题,但是共价印迹方法存在模板-功能单体再结合困难的问题。
印迹后修饰(post-imprinting modification, PIM)是对印迹孔穴内功能单体的残基进行定点修饰,通过定点化学修饰的手段赋予了印迹聚合物新的性能,不仅可以实现官能团的转化,还能够在印迹孔穴内引入其他功能,例如结合活性的开/关切换,荧光信号,催化功能等。本发明利用功能单体4-烯丙氧基苯甲醛中的醛基在氢氧化钠强碱性条件下发生歧化反应变成羟基和羧基的原理,对整体柱进行印迹后修饰。迄今为止,尚无涉及基于此原理对整体柱进行印迹后修饰的专利申请件。该方法不仅能够灵活地调控功能单体的选择性及富集能力,而且能够增加模板与功能单体的结合位点,提高了印迹聚合物对模板分子的富集效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱及制备方法和应用。首先利用功能单体4-烯丙氧基苯甲醛中的醛基与模板分子中的氨基形成席夫碱的特点形成模板-功能单体复合物,除去模板分子后,再利用氢氧化钠的歧化作用使醛基变成羟基和羧基,得到印迹后修饰的印迹整体柱。本发明利用了共价印迹方法专一性强的特点,及印迹后修饰方法增加模板分子与功能单体间的结合位点,能够提高印迹整体柱的选择性和富集效果。该方法简便易行,可提高印迹整体柱的富集效果,对于豆蔻酰化四肽的分析研究具有重要的意义。
本发明提供的豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱的原料的质量比为:
豆蔻酰化四肽 2.17 %-2.27 %
4-烯丙氧基苯甲醛 0.01 %-0.65 %
N, N’-二烯丙基酒石酸二酰胺 0.01 %-4.03 %
N, N’-亚甲基双丙烯酰胺 6.69 %-10.84 %
八乙烯基笼型倍半硅氧烷 0.01 %-0.36 %
二甲基亚砜 47.69 %-49.97 %
十二醇 35.55 %-37.25 %
偶氮二异丁腈 0.39 %-0.41 %
上述的各原料的质量百分比组成之和为100 %。
本发明提供的豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱的制备方法具体经过下列步骤:
1)按计量将豆蔻酰化四肽与 4-烯丙氧基苯甲醛溶于DMSO中,在水浴60℃条件下反应20-24小时,生成模板-功能单体复合物,然后加入功能单体N, N’-二烯丙基酒石酸二酰胺,交联剂八乙烯基笼型倍半硅氧烷及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺,引发剂偶氮二异丁腈,并以二甲基亚砜和十二醇作为致孔剂,将上述试剂混合在一起,将反应液超声处理15-20分钟直到混合物均匀,澄清,不发生相分离,得到混合溶液。
2)将混合溶液注入到毛细管中,毛细管两端用橡皮塞密封,置于水浴锅60-65℃下反应4-5个小时,得到印迹整体柱。
3)制备的印迹整体柱依次用乙腈、甲醇-乙酸(9:1,体积比)冲洗,除去模板及未反应的试剂。NIP印迹整体柱除不加模板分子外,其余步骤同上。
4)制备的印迹整体柱通过700 μL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液冲洗, 功能单体4-烯丙氧基苯甲醛的醛基通过歧化反应, 变成羟基和羧基,从而产生与模板分子的结合位点,最终得到基于共价印迹及印迹后修饰方法的印迹整体柱。
步骤1)中的毛细管柱为250 μm I.D.。
不采用共价印迹方法制备的毛细管整体柱除不含共价功能单体4-烯丙氧基苯甲醛外,其余步骤同上。
本发明得到基于共价印迹及印迹后修饰方法制备的豆蔻酰化四肽的分子整体柱可用于富集豆蔻酰化蛋白质组学的鉴定,如富集 MCF-7 细胞中豆蔻酰化修饰蛋白质及肽段。
附图说明
图1为本发明制备的基于共价印迹方法制备的整体柱与不含共价功能单体4-烯丙氧基苯甲醛整体柱吸附量的对比图。
图2为无印迹后修饰方法和采用印迹后修饰方法制备的印迹整体柱、共价印迹整体柱的红外光谱对比图。
图3为本发明制备的印迹整体柱考察氢氧化钠体积对豆蔻酰化四肽吸附量的影响。
图4为本发明制备的印迹整体柱考察洗脱液的浓度对豆蔻酰化四肽吸附量的影响。
图5为MCF-7细胞蛋白酶解产物通过本发明制备的MIP印迹整体柱处理前后,通过质谱鉴定到豆蔻酰化蛋白、肽段及位点的数量对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件;所用的通用设备、材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
基于共价印迹方法制备的整体柱与不含共价功能单体4-烯丙氧基苯甲醛整体柱吸附量的对比图,如图1。具体步骤如下:
基于共价印迹及印迹后修饰方法印迹整体柱的制备方法:
将质量百分数为 2.22 % 的豆蔻酰化四肽(豆蔻酰化-甘氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-赖氨酸,分子量614.77,厂家吉尔生化(上海)有限公司,纯度95%)与 0.63 % 4-烯丙氧基苯甲醛溶于48.75 % DMSO中,在水浴60℃条件下反应24小时,生成模板-功能单体复合物。然后加入2.46 % 功能单体N, N’-二烯丙基酒石酸二酰胺,0.35% 交联剂八乙烯基笼型倍半硅氧烷及8.86 % N, N’-亚甲基双丙烯酰胺,0.40 % 引发剂偶氮二异丁腈,36.33 % 十二醇,将上述试剂混合在一起,将反应液超声(室温,功率150 W)处理(15-20分钟)直到混合物均匀,澄清,不发生相分离。将混合溶液注入到毛细管中,毛细管两端用橡皮塞密封,置于水浴锅65℃下反应4个小时。制备的印迹整体柱依次用乙腈、甲醇-乙酸(9:1,体积比)冲洗,除去模板及未反应的试剂。
NIP印迹整体柱除不加模板分子外,其余步骤同上。
制备的印迹整体柱通过700 μL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液冲洗, 功能单体4-烯丙氧基苯甲醛的醛基通过歧化反应, 变成羟基和羧基。
不含共价功能单体4-烯丙氧基苯甲醛的印迹整体柱除4-烯丙氧基苯甲醛外,其余步骤同上。
结果表明,基于共价方法制备印迹整体柱的吸附量显著高于非共价方法制备的印迹整体柱的吸附量,这是由于共价印迹过程中,单体与模板分子间的作用力强,形成的复合物稳定,对模板分子具有专一性识别作用,并且通过印迹后修饰方法,增加了模板与功能单体的结合位点。
实施例2
红外光谱图表征。图2分别为无印迹后修饰NIP整体柱、印迹后修饰NIP整体柱及共价MIP整体柱制备的印迹整体柱的红外光谱图。
如图2,印迹后修饰NIP整体柱与未修饰的NIP整体柱相比,-OH伸缩振动峰(3289cm-1)强度变大,C=O伸缩振动峰(1654 cm-1)强度变小,结果表明羟基基团数量增大,功能单体4-烯丙氧基苯甲醛中的醛基发生歧化反应,变为羟基和羧基。共价MIP印迹整体柱的红外光谱图中,由于模板分子中赖氨酸的氨基与4-烯丙氧基苯甲醛中醛基形成的C=N键与C=O键吸收峰重合,因此无法辨别,但1315 cm-1处的吸收峰代表C-N键的形成,能够说明MIPs中席夫碱的合成。
结果表明,基于共价方法制备印迹整体柱的吸附量显著高于非共价方法制备的印迹整体柱的吸附量,这是由于共价印迹过程中,单体与模板分子间的作用力强,形成的复合物稳定,对模板分子具有专一性识别作用,并且通过印迹后修饰方法,增加了模板与功能单体的结合位点。
实施例3
印迹整体柱考察氢氧化钠体积对豆蔻酰化四肽吸附量的影响, 如图3。在印迹后修饰过程中,碱浓度的大小对4-烯丙氧基苯甲醛发生歧化反应的影响很大。当碱浓度降低,因水的溶剂化效应,亲核试剂进攻羰基的速度大大降低, 导致歧化反应难以进行。当碱的浓度偏高, 虽然提高了 OH - 进攻羰基碳的几率, 但易形成乳状固体, 将苯甲醛包裹在其中, 从而降低印迹效果,并且高浓度的碱溶液容易破坏毛细管整体柱的内部结构。因此,本实验在固定氢氧化钠浓度0.5 mol/L不变的情况下,研究其体积对印迹整体柱吸附量的影响。具体步骤如下:
称取80 mg的氢氧化钠固体,加入4 mL水,超声溶解后,得到0.5 mol/L的氢氧化钠溶液。在注射器内分别吸入400 μL、500 μL、600 μL、700 μL、800 μL的氢氧化钠溶液通过数字泵以2 μL/min的速度注入整体柱中,考察不同体积的氢氧化钠对整体柱吸附量的影响。根据所得到的数据,画出对应的图3。
结果表明,随着氢氧化钠浓度的增加,印迹整体柱的吸附量呈现先升高后降低的趋势。如图3,当氢氧化钠体积为700 μL时,MIP印迹整体柱的吸附量达到最大,印迹效果最好, 这是由于氢氧化钠体积增加,能够促进功能单体4-烯丙氧基苯甲醛的歧化反应,印迹后修饰得到的羟基和羧基含量越多,与模板分子形成氢键的作用力越强。但是,加入的氢氧化钠体积过大时,容易形成乳状固体导致4-烯丙氧基苯甲醛被包裹起来,形成的氢键结合位点被掩盖。因此,使用700 μL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液对整体柱进行印迹后修饰方法,不仅能够增加功能单体与模板的印迹位点,而且对模板分子的吸附选择性最好。
实施例4
印迹整体柱考察洗脱液的浓度对豆蔻酰化四肽吸附量的影响,如图4。固相微萃取包括活化、上样、淋洗、洗脱四个过程。其中,选择合适的洗脱条件在目标化合物分析中十分重要,必须破坏目标物与功能单体结合位点间的相互作用,将目标物完全洗脱下来,才能获得最佳的印迹效果。因此,为了完全洗脱目标物,必须选择合适的洗脱溶剂及体积。具体步骤如下:
首先,将制备好的印迹整体柱通过50 μL 50 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 对整体柱进行活化,激活整体柱中的活性基团,然后以上述PBS缓冲溶液配置100 μL 100 μg/mL的豆蔻酰化四肽溶液进行上样,以50 μL 50 mmol/L的PBS缓冲溶液-乙腈(9:1,体积比)混合溶液进行淋洗,除去杂质对目标物的干扰,最终分别以25 μL、50 μL、75 μL、100 μL的甲醇-乙酸溶液(8:2,体积比)作为洗脱溶剂,研究其对印迹整体柱吸附量的影响。根据所得到的数据,画出对应的图4。
结果表明,随着洗脱体积的增加,MIP印迹整体柱的吸附量逐渐增大,当洗脱体积为100 μL时,吸附量达到最大,为 9.20 μg/mL,回收率达到 92.06 %。基于此,选择100 μL甲醇-乙酸(8:2,体积比)作为印迹整体柱的洗脱条件,能够大大提高印迹整体柱的富集效果。
实施例5
MCF-7细胞蛋白酶解产物通过制备的MIP印迹整体柱处理前后,通过质谱鉴定到豆蔻酰化蛋白、肽段及位点的数量对比,如图5。本发明将制备的MIP印迹整体柱用于富集MCF-7 细胞中豆蔻酰化修饰蛋白质及肽段, 通过质谱进行鉴定。具体步骤如下:
1.5 mg MCF-7细胞蛋白质溶解于1 mL 3mol/L的尿素溶液,在微流控芯片上以0.3μL /min的流速,100μL的体积被20mmol/L的二硫苏糖醇和30mmol/ L的碘乙酰胺在线变性-还原-烷基化。上述溶液均由50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)配置。变性后的蛋白质被直接转移到胰蛋白酶固定化酶反应器中进行在线酶解,然后再将酶解液转移到MIP印迹整体柱中进行富集。吸附后的印迹整体柱用数字泵通过离线方式进行淋洗和富集。淋洗条件为50 μL 50 mmol/L的PBS缓冲溶液-乙腈(9:1,体积比)混合溶液,洗脱条件为100 μL甲醇-乙酸溶液(8:2,体积比),流速均为2 μL/min。将未经MIP印迹整体柱处理样品,及富集后的上样流出液、淋洗液、洗脱液冻干,用0.1 % TFA水复溶后,用Milli poreZipTips C18柱除盐,并再次冻干,通过质谱进行检测。根据所得到的数据,画出对应的图5。
结果表明,经过MIP印迹整体柱富集后得到的豆蔻酰化蛋白质为55个、豆蔻酰化肽段及位点为56个,未经MIP印迹整体柱处理的样品中鉴定到的数量较少,其中豆蔻酰化蛋白为19个、豆蔻酰化肽段及位点为24个,证明了MIP印迹整体柱的富集效果。
Claims (6)
1.一种豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱,其特征在于它的原料的质量比为:
豆蔻酰化四肽 2.17 %-2.27 %
4-烯丙氧基苯甲醛 0.01 %-0.65 %
N, N’-二烯丙基酒石酸二酰胺 0.01 %-4.03 %
N, N’-亚甲基双丙烯酰胺 6.69 %-10.84 %
八乙烯基笼型倍半硅氧烷 0.01 %-0.36 %
二甲基亚砜 47.69 %-49.97 %
十二醇 35.55 %-37.25 %
偶氮二异丁腈 0.39 %-0.41 %
上述的各原料的质量百分比组成之和为100 %;
制备方法经过下列步骤:
1)按计量将豆蔻酰化四肽与 4-烯丙氧基苯甲醛溶于DMSO中,在水浴60℃条件下反应20-24小时,生成模板-功能单体复合物,然后加入功能单体N, N’-二烯丙基酒石酸二酰胺,交联剂八乙烯基笼型倍半硅氧烷及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺,引发剂偶氮二异丁腈,并以二甲基亚砜和十二醇作为致孔剂,将上述试剂混合在一起,将反应液超声处理15-20分钟直到混合物均匀,澄清,不发生相分离,得到混合溶液;
2)将混合溶液注入到毛细管中,毛细管两端用橡皮塞密封,置于水浴锅60-65℃下反应4-5个小时,得到印迹整体柱;
3)制备的印迹整体柱依次用乙腈、体积比为9:1的甲醇和乙酸冲洗,除去模板及未反应的试剂;
4)制备的印迹整体柱通过700 μL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液冲洗, 功能单体4-烯丙氧基苯甲醛的醛基通过歧化反应, 变成羟基和羧基,从而产生与模板分子的结合位点,最终得到基于共价印迹及印迹后修饰方法的印迹整体柱。
2.按照权利要求1所述的豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱,其特征在于它的原料的质量比为:
豆蔻酰化四肽 2.22 %
4-烯丙氧基苯甲醛 0.63 %
N, N’-二烯丙基酒石酸二酰胺 2.46 %
N, N’-亚甲基双丙烯酰胺 8.86 %
八乙烯基笼型倍半硅氧烷 0.35 %
二甲基亚砜 48.75 %
十二醇 36.33 %
偶氮二异丁腈 0.40 % 。
3.权利要求1所述的豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱的制备方法,其特征在于经过下列步骤:
1)按计量将豆蔻酰化四肽与 4-烯丙氧基苯甲醛溶于DMSO中,在水浴60℃条件下反应20-24小时,生成模板-功能单体复合物,然后加入功能单体N, N’-二烯丙基酒石酸二酰胺,交联剂八乙烯基笼型倍半硅氧烷及N, N’-亚甲基双丙烯酰胺,引发剂偶氮二异丁腈,并以二甲基亚砜和十二醇作为致孔剂,将上述试剂混合在一起,将反应液超声处理15-20分钟直到混合物均匀,澄清,不发生相分离,得到混合溶液;
2)将混合溶液注入到毛细管中,毛细管两端用橡皮塞密封,置于水浴锅60-65℃下反应4-5个小时,得到印迹整体柱;
3)制备的印迹整体柱依次用乙腈、体积比为9:1的甲醇和乙酸冲洗,除去模板及未反应的试剂;
4)制备的印迹整体柱通过700 μL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液冲洗, 功能单体4-烯丙氧基苯甲醛的醛基通过歧化反应, 变成羟基和羧基,从而产生与模板分子的结合位点,最终得到基于共价印迹及印迹后修饰方法的印迹整体柱。
4.按照权利要求3所述的制备方法,其特征在于步骤1)中的毛细管柱为250 μm I.D.。
5.权利要求1所述的豆蔻酰化四肽的分子印迹整体柱在富集豆蔻酰化蛋白质组学的鉴定中的应用。
6.按照权利要求5所述的应用,其特征在于用于富集 MCF-7 细胞中豆蔻酰化修饰蛋白质及肽段。
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CN112675823A (zh) * | 2020-11-29 | 2021-04-20 | 南京师范大学 | 一种糖蛋白分子印迹纳米粒子及其合成方法 |
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2021
- 2021-05-25 CN CN202110568394.0A patent/CN113262768B/zh active Active
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