JPS62287154A - ニトロ修飾クロマトグラフイ担体材料 - Google Patents

ニトロ修飾クロマトグラフイ担体材料

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JPS62287154A
JPS62287154A JP62128559A JP12855987A JPS62287154A JP S62287154 A JPS62287154 A JP S62287154A JP 62128559 A JP62128559 A JP 62128559A JP 12855987 A JP12855987 A JP 12855987A JP S62287154 A JPS62287154 A JP S62287154A
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ベルント・ウイルメルス
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明はニトロ基により変性されたクロマトグラフィ担
体ｔオ料、これらの製造方法、に関するしのであり、ま
た、これらをゲル透過クロマトグラフィおよび（または
）アフィニティクロマトグラフィにおける成る種の物質
の分離、濃縮および定量に使用することに関するらので
ある。
体液中の１８種のりポヌクレオシドの全部を、タンパク
質を除去したアフイニテイゲルを用いて直接的にまた選
択的に精製、分析する方法はすでに知られている。クロ
マトグラフィ担体材料として、エポキシ化後にｍ−アミ
ノフェニルホウ酸で変性された小球形状の親水性ビニル
重合体か使用されている（Ｋ６ｎｉｇｓｔｅｉｎ　Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇ−ｒａｐｈｙ　Ｃｏｎｒｅｒｅｎｃｅ、
　　９月３０日〜ＩＯ月２日、１９８５年、２１９頁）
。
しかしながら、リボヌクレオチドの定量分析結果は完全
てはなく、体液の多数の重要な成分については、この担
体材料を用いると、分離、濃縮および定量において不満
足な結果しか得られないことが明らかにされている。
本発明の目的はこれらの欠点を有せず、しかもこれによ
って生物学的試料の成分を前らって膜タンパク質化する
ことなく、正確に分析できるという変性された担体材料
を見い出すことにあった。驚くべきことに、ニトロ基を
含有し、そして１−アミノ−（フェニル−５′−ホウ酸
）−２−ヒトａキノ−３−０−プロピル基で修飾されて
いるクロマトグラフィ担体材料か望ましい性質を有する
ことが見い出された。
本発明は、１−アミノ−（２′−ニトロフェニル−５′
−ホウ酸）−２−ヒドコキンー３−〇−プロピル基で修
飾されているクロマトグラフィ担体材料、好ましくはビ
ニル重合体を基材とし、モして１−アミノ−（２′−ニ
トロフェニル−５′−ホウ酸）−２−ヒドロキン−３−
０−プロピル基て修飾されている小球形状多孔質ゲルに
関する。
本発明はまたヒドロキシ基含有担体材料を１−クロロ−
２，３−エポキシプロパンおよびｍ−アミノフェニルホ
ウ酸と連続的に反応さけることによるクロマトグラフィ
担体材料の製造方法に関する乙のであり、この方法は引
き続きニトロ化を行なうことを特徴とするものである。
本発明は、また、これらの担体材料をゲル透過クロマト
グラフィおよび（または）アフィニティクロマトグラフ
ィにおいて使用することに関する。
適当なりロマトグラフイ担体オ科は、これらがヒドロキ
シ基を含有するかぎり、クロマ）・グラフィで慣用の担
体材料の全部であるが、好ましくはビニル重合体、１こ
とえばポリエチレングリコールジメタアクリレート共重
合体、あるいはノリカゲル、アガロース等を基材とする
小球形状の多孔質ゲルである。ビニル重合体を基オとす
る好ましいゲル（たとえばＭｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａ
−ｄｉ製のＦｒａｃｔｏｇｅｌｊＤ　ＴＳＫ）は、高度
の機械的および化学的な安定性を有し、たとえばｐＨ１
〜１４の範囲でｐ＋＋安定性を有し、無視し得る程度の
体積変化を６って１５０バールまでの圧力に対し安定で
あり、そして有機溶剤と良好な適合性を有ずろ。このゲ
ルは殺菌することができる。アフイニテイリカンドによ
ｊつ占められている表面はケルの乾燥重量ｇ当り０１〜
０２ミリモルの範囲、好ましくは０１５ミリモルである
。
本発明による二；・ロ修飾りロマトグラフィ担体オ科は
初めに、ヒドロキノ基含有ゲルを水性＠副液中で１−タ
ロロー２．３−エボキンプロノ（ンと反応させ、次いで
得られた生成物をｍ−アミノフェニルホウ酸塩酸塩の水
溶液と反応させることにより製造される。得られた、１
−アミノ−（フェニル−５′−ホウ酸）−２−ヒドロキ
ン−３−０−プロピル基で修飾されている担体材料を次
いでニトロ化する。このニトロ化は修飾されたゲル１重
量部を４０％硝酸２０重量部に懸濁し、混合物を撹拌し
、次いで固体生成物を２戸取し、洗浄し、次いで乾燥さ
せることによって行なう。
本発明により調整されたゲルはゲル透過クロマトグラフ
ィにおよびアフィニティクロマトグラフィに極めて適し
ている。これらの組合された性質は１５０バールまでの
加圧の下で、タンパク質含釘溶液からのンオール含有物
質のグループ−特異性の分別と濃縮を好ましく可能に下
る。生成しｆこケルは、特に生物学的材料、几とえば血
清、尿、゛脳骨髄液、身体分泌物および組織ポモンネー
トからカテコールアミン、天然のあるいは修飾されたり
ボヌクレオシド、ｗＭ頃、グリコンル化タンパク質並び
にオリゴーリボヌクレオチドおよびポリ−リボヌクレオ
チドを分離、濃縮するのに適している。
種々のパラメーターの定量的測定を完全に自動化された
高速液体クロマトグラフィ分析系と組合せて好ましく行
なうことができる。
例　　１ １−アミノ−（２′−ニトロフェニル−５′−ホウ酸）
−２−ヒドロキシ−３−０−プロピル基で修飾された担
体材料の調製 （、エポキシ化 乾燥粉末としたポリエチレングリコールノメタアクリレ
ート共重合体１重量部を二重蒸留水４重量部中に懸濁し
、次いで１−クロロ−２，３−エイキンプロパン１．１
重量部を加える。このエポキシ化は４５℃で、そして一
定ｐＨ（９，０）で４時間撹拌して進行させる。エポキ
シ化されたゲルを吸引炉別し、二重蒸留水４重量部、メ
タノール４重量部、二重蒸留水４重量部およびメタノー
ル４重量部で順次洗浄し、次いで乾燥させる。
２　ｍ−アミノフェニルホウ酸との反応ｍ−アミノフェ
ニルホウ酸塩酸塩０．１３重量部を二重蒸留水１０重量
部中に溶解し、ｐＨをＮａＯＨ１０モル／Ｑを用いて１
０．５に調製し、次いてエポキシ化された担体材料１重
里部を撹拌しながら加える。反応は５５°Ｃで２４時間
にわたり行なう。得られたゲルを吸引炉別し、二重蒸留
水１０重量部で２回およびメタノールｌＯ重量部で順次
洗浄し、次いで乾燥させる。
３、ニトロ化 水浴中において、前記工程２で得られたゲル１重量部を
４０％硝酸（ｐ、Ａ、）２０重量部中に懸濁し、混合物
を１時間撹拌する。反応混合物を次いで室温でさらに１
時間撹拌し、ニトロ化されたゲルを吸引が別し、二重蒸
留水で中性になるまで洗浄し、次いでメタノール１０重
量部で洗浄し、そして乾燥させろ。
例　　２ 人間の尿＋００．ｄからのカテコールアミン、ノルアド
レナリン、アドレナリンおよびドーパミンの定量 定量は自動サンプラー（〜１ｅｒｃｋ−１１ｉｔａｃｈ
ｉ、６５５Ａ−４０）、２個のＨＰ　Ｌ　Ｃポンプ（Ｍ
ｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ、　６５５Ａ−１１）　、例
１に従い調製されたゲルを充填したプレリミナリカラム
（ディメン７ョン・長さＩＯ〜＋００朋、内径３〜２０
．ｗｗ）、分析用分離カラム（たとえば、ＬｉＣｈｒｏ
ｓｏｒｂＤＲＰ　−１８，７虜、内径２５０　Ｘ　４叩
）、電気稼動高圧、６−ｗａｙバルブ（Ｋｒａｎｎｉｃ
ｈ、　ＥＬＶ　７０００）　、検出器（たとえばフルオ
リメーター、Ｍｅｒｃｋ−１１ｉｔａｃｈｉ、Ｐ−１０
００）、インチグレーター（Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈ
ｉ、Ｆ−２０００）およびコントロールモジュール（Ｍ
ｅｒｃｋ−ｆｌｉｔａｃｈｉ、ＬＣ−コントローラー、
Ｌ−５０００）を具備する高速液体タコマドグラフィ分
計系を用いて行なう。
カラム−スイッチング技法を用いて、完全に自動化した
カテコールアミン分析を次の５段階で行なう； ｌ　ブレリミナリカラムの静置した圧力安定性アフイニ
テイ相上におけるカテコールアミンの化学選択的結合お
よび濃縮。
２、プレリミナリカラムからの残りの生理学的マトリッ
クスの定量的溶出： ３　プレリミナリ力ラムからのカテコールアミンの定量
的溶出ならびに下流分析カラムへのカテコールアミンの
「オン−ライン」移動。
４、１ｓｏｃｒａｔｉｃ条件下におけるカテコールアミ
５　プレリミナリカラムの再調整。
この分析系において、下記の緩衝剤を使用する。
プレリミナリカラム用。
リン酸水素ニアンモニウム　０．２Ｍ（２６，８ｇ／り
）ＥＤＴへ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｉ　　ＯｍＭ（３，７ｇ＃り２５％アンモニア溶
液を使用してｐＨ！３．７に調整。
分析カラム用 リン酸二水素ナトリウム　　０．１Ｍ（１，３，８９／
ｆ２）オクタン−１−スルホン酸　５　ｍＭ（１，，０
８ｇ／（り２０％リン酸を使用してｐ＋！３．０に調整
。
分析結果を次表にまとめて示す。
この完全自動式カテコールアミン分析機は短い始動時間
および分析時間を有しく最高、３０分）、そしてその実
用性に加え、高度の選択性、安定性、精度および検出感
度を有する点で洛別である。分析されたカテコールアミ
ンの事実上定量的な回収率（前記表参照）はこの分析系
の信頼性を示すしのである。生物原性アミン類の濃度測
定がシリーズで、日／日分析で高精度をもって達成され
る。さらにまた、保持時間の小さい変動係数はこの系の
優れた安定性を証明している（旧記表参照）。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）１−アミノ−（２′−ニトロフェニル−５′−ホ
    ウ酸）−２−ヒドロキシ−３−Ｏ−プロピル基で修飾さ
    れているクロマトグラフィ担体材料。
  2. （２）ビニル重合体を基材とし、そして１−アミノ−（
    ２′−ニトロフェニル−５′−ホウ酸）−２−ヒドロキ
    シ−３−Ｏ−プロピル基で修飾されている小球形状多孔
    質ゲル。
  3. （３）ヒドロキシ基を含有する担体材料を１−クロロ−
    ２，３−エポキシプロパンおよびｍ−アミノフェニルホ
    ウ酸と連続的に反応させることによる特許請求の範囲第
    １項または第２項に記載のクロマトグラフィ担体材料の
    製造方法であって、引続きニトロ化を行なうことを特徴
    とする担体材料の製造方法。
  4. （４）特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の担体材
    料のゲル−透過クロマトグラフィおよび（または）アフ
    ィニティクロマトグラフィにおける使用。
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