JP3377516B2 - 蛋白質と炭素鎖が結合した担体 - Google Patents
蛋白質と炭素鎖が結合した担体Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアビジン、オボアルブミ
ンから選択した蛋白質が炭素鎖を介して担体に結合した
高速液体クロマトグラフィ−用充填剤に関する。
ンから選択した蛋白質が炭素鎖を介して担体に結合した
高速液体クロマトグラフィ−用充填剤に関する。
【０００２】
【従来技術】近年種々の物質の定性、定量分析あるいは
分離などに高速液体クロマトグラフィ−が広く用いられ
ているがその分離能力は、接続されるカラムに大きく依
存するため、さまざまな種類のカラムが市販されてい
る。中でももっとも汎用されているのがシリカゲルなど
の担体に炭素鎖を結合させたものを使用する逆相カラム
である。
分離などに高速液体クロマトグラフィ−が広く用いられ
ているがその分離能力は、接続されるカラムに大きく依
存するため、さまざまな種類のカラムが市販されてい
る。中でももっとも汎用されているのがシリカゲルなど
の担体に炭素鎖を結合させたものを使用する逆相カラム
である。
【０００３】一方、高速液体クロマトグラフィ−による
分析方法は、高感度であるため、生体成分例えば血漿中
の低分子化学物質の定量などに使用されることも多い。
しかしながら、生体成分は、特に逆相系のカラムを使用
した場合、カラムに吸着し、分離能の低下や溶媒送液圧
の上昇をもたらすため生体成分を除去するための前処理
が必須であった。
分析方法は、高感度であるため、生体成分例えば血漿中
の低分子化学物質の定量などに使用されることも多い。
しかしながら、生体成分は、特に逆相系のカラムを使用
した場合、カラムに吸着し、分離能の低下や溶媒送液圧
の上昇をもたらすため生体成分を除去するための前処理
が必須であった。
【０００４】これらの欠点を克服するため、ピンカ−ト
ンら（Anal. Chem. 1985,Vol.57,p.1757-1763 ）は、多
孔性のシリカゲル担体の内側のみを化学修飾したカラム
を開発している。
ンら（Anal. Chem. 1985,Vol.57,p.1757-1763 ）は、多
孔性のシリカゲル担体の内側のみを化学修飾したカラム
を開発している。
【０００５】
【発明が解決しようとする問題点】ピンカ−トンらの開
発したカラムは、分析中における生体成分の妨害を除去
する点において優れているが、低分子化学物質の保持
力、分離力などの点においては十分に満足できるもので
はない。本発明者らは、生体成分の妨害を除去し、か
つ、低分子化学物質に対しても十分な保持力と分離力を
有した充填剤及びその充填剤を充填したカラムについて
鋭意研究してきたが、下記に示す構成により、従来のカ
ラムの有する欠点を解決できることを見いだし本発明を
完成した。
発したカラムは、分析中における生体成分の妨害を除去
する点において優れているが、低分子化学物質の保持
力、分離力などの点においては十分に満足できるもので
はない。本発明者らは、生体成分の妨害を除去し、か
つ、低分子化学物質に対しても十分な保持力と分離力を
有した充填剤及びその充填剤を充填したカラムについて
鋭意研究してきたが、下記に示す構成により、従来のカ
ラムの有する欠点を解決できることを見いだし本発明を
完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はアビ
ジン、オボアルブミンから選択した蛋白質または同蛋白
質に化学修飾を施した蛋白質が炭素鎖を介して担体に結
合することを特徴とする充填剤及び該充填剤を充填した
カラムに関する。本発明により生体成分を直接カラムに
注入しても生体成分の影響を受けずに、かつ、低分子化
学物質に対しても十分な保持時間と分離能を有した分析
が可能となり、また、生体成分の前処理における除去が
容易になるが、これらがすなわち本発明の目的である。
ジン、オボアルブミンから選択した蛋白質または同蛋白
質に化学修飾を施した蛋白質が炭素鎖を介して担体に結
合することを特徴とする充填剤及び該充填剤を充填した
カラムに関する。本発明により生体成分を直接カラムに
注入しても生体成分の影響を受けずに、かつ、低分子化
学物質に対しても十分な保持時間と分離能を有した分析
が可能となり、また、生体成分の前処理における除去が
容易になるが、これらがすなわち本発明の目的である。
【０００７】本発明における蛋白質は、アビジン、オボ
アルブミンである。アビジンは、卵白中に含まれる分子
量約６８０００の塩基性糖蛋白質であり、マンノ−ス、
ヘキソサミンなどの糖を含む。オボアルブミンは卵白中
にもっとも多量に含まれる糖蛋白質であり、分子量４５
０００で、グルコサミン、マンノ−スが結合している。
本発明では、分子量数千から数十万の蛋白質が炭素鎖を
介して担体に結合していることが重要であり、またこれ
らの蛋白質の１種または２種以上を組み合わせて用いる
ことができる。更に、これらの蛋白質は、グルタ−ル
化、ジオ−ル化、アシル化等の化学修飾を施すことによ
り、耐久性の向上等を図ることができる。
アルブミンである。アビジンは、卵白中に含まれる分子
量約６８０００の塩基性糖蛋白質であり、マンノ−ス、
ヘキソサミンなどの糖を含む。オボアルブミンは卵白中
にもっとも多量に含まれる糖蛋白質であり、分子量４５
０００で、グルコサミン、マンノ−スが結合している。
本発明では、分子量数千から数十万の蛋白質が炭素鎖を
介して担体に結合していることが重要であり、またこれ
らの蛋白質の１種または２種以上を組み合わせて用いる
ことができる。更に、これらの蛋白質は、グルタ−ル
化、ジオ−ル化、アシル化等の化学修飾を施すことによ
り、耐久性の向上等を図ることができる。
【０００８】本発明における炭素鎖は、直鎖状もしくは
分岐を有する炭素鎖であり、炭素鎖のいずれかの炭素原
子に側鎖としてシアノ基もしくはアリ−ル基が結合して
いても良く、更に、炭素鎖中にアリ−ル基を有してもま
たジスルフィド結合を有しても良い。アリ−ル基とは、
例えば置換基を有しても良いフェニル基もしくはナフチ
ル基を意味する。直鎖状の炭素鎖はＣ3 〜Ｃ18が望まし
いが、炭素数はその先端に結合する蛋白質の分子量との
関係で最も好ましい数が決定される。本発明において炭
素鎖は親水性である蛋白質が結合した充填剤に、疎水性
を付与するために導入されている。後の作用の項におい
て説明するように低分子薬物はこの炭素鎖の部分におい
て種々の相互作用の結果分離される。薬物との相互作用
は炭素鎖の炭素数や置換基により異なるため目的に応じ
て適宜炭素鎖を選択することができる。炭素鎖の両末端
は、蛋白質及び担体に化学結合される。化学結合は特に
限定されないが、例えばアミド結合により蛋白質及び担
体のアミノ基と結合することができる。
分岐を有する炭素鎖であり、炭素鎖のいずれかの炭素原
子に側鎖としてシアノ基もしくはアリ−ル基が結合して
いても良く、更に、炭素鎖中にアリ−ル基を有してもま
たジスルフィド結合を有しても良い。アリ−ル基とは、
例えば置換基を有しても良いフェニル基もしくはナフチ
ル基を意味する。直鎖状の炭素鎖はＣ3 〜Ｃ18が望まし
いが、炭素数はその先端に結合する蛋白質の分子量との
関係で最も好ましい数が決定される。本発明において炭
素鎖は親水性である蛋白質が結合した充填剤に、疎水性
を付与するために導入されている。後の作用の項におい
て説明するように低分子薬物はこの炭素鎖の部分におい
て種々の相互作用の結果分離される。薬物との相互作用
は炭素鎖の炭素数や置換基により異なるため目的に応じ
て適宜炭素鎖を選択することができる。炭素鎖の両末端
は、蛋白質及び担体に化学結合される。化学結合は特に
限定されないが、例えばアミド結合により蛋白質及び担
体のアミノ基と結合することができる。
【０００９】本発明における担体は、通常用いられるも
のであればいかなるものでも良いが、例えば、シリカゲ
ル、セルロ−ス、ガラス、合成ポリマ−などを用いるこ
とができる。担体は、炭素鎖と結合するための官能基を
有する必要があり、官能基を有しない担体は適切な基を
導入する必要があるが、例えばアミノプロピルシリカゲ
ルなどは官能基を有するため本発明にかかる充填剤の製
造に適している。
のであればいかなるものでも良いが、例えば、シリカゲ
ル、セルロ−ス、ガラス、合成ポリマ−などを用いるこ
とができる。担体は、炭素鎖と結合するための官能基を
有する必要があり、官能基を有しない担体は適切な基を
導入する必要があるが、例えばアミノプロピルシリカゲ
ルなどは官能基を有するため本発明にかかる充填剤の製
造に適している。
【００１０】本発明にかかる蛋白質が炭素鎖を介して担
体に結合した充填剤を充填したカラムは高速液体クロマ
トグラフィ−用カラムとすることができる。さらに本発
明にかかる蛋白質が炭素鎖を介して担体に結合した充填
剤を充填したカラムは前処理段階における血中成分の除
去にも優れた効果を発揮する。この場合のカラムは、高
速液体クロマトグラフィ−用とは異なり、高圧に耐える
必要はなく、高分子材料等の比較的柔軟なカラム中に充
填すれば良い。質量分析等により、血中に含まれる薬物
等の微量の低分子物質の構造を決定する際等には必ず生
体成分などの妨害物質を除去する必要があり、従来は非
常に複雑な操作を行っていた。しかし、本発明にかかる
前処理用カラムは、注射器等により試料をそのまま通過
させるだけで生体成分の除去ができる。すなわち、生体
成分等の高分子物質はカラムに保持されずに流出してし
まうのに対し、低分子薬物等は、カラムに保持されるの
で、生体成分等の妨害物質が流出した後、適切な溶媒に
より流出させることにより容易に低分子薬物等を精製で
きる。したがって、本発明は、蛋白質が化学結合により
炭素鎖の一方に結合し、さらにその炭素鎖のもう一方が
化学結合によりアミノアルキル基を有するシリカゲルの
アミノ基に結合した充填剤を用い生体試料中に存在する
低分子医薬を精製または分離する方法である。
体に結合した充填剤を充填したカラムは高速液体クロマ
トグラフィ−用カラムとすることができる。さらに本発
明にかかる蛋白質が炭素鎖を介して担体に結合した充填
剤を充填したカラムは前処理段階における血中成分の除
去にも優れた効果を発揮する。この場合のカラムは、高
速液体クロマトグラフィ−用とは異なり、高圧に耐える
必要はなく、高分子材料等の比較的柔軟なカラム中に充
填すれば良い。質量分析等により、血中に含まれる薬物
等の微量の低分子物質の構造を決定する際等には必ず生
体成分などの妨害物質を除去する必要があり、従来は非
常に複雑な操作を行っていた。しかし、本発明にかかる
前処理用カラムは、注射器等により試料をそのまま通過
させるだけで生体成分の除去ができる。すなわち、生体
成分等の高分子物質はカラムに保持されずに流出してし
まうのに対し、低分子薬物等は、カラムに保持されるの
で、生体成分等の妨害物質が流出した後、適切な溶媒に
より流出させることにより容易に低分子薬物等を精製で
きる。したがって、本発明は、蛋白質が化学結合により
炭素鎖の一方に結合し、さらにその炭素鎖のもう一方が
化学結合によりアミノアルキル基を有するシリカゲルの
アミノ基に結合した充填剤を用い生体試料中に存在する
低分子医薬を精製または分離する方法である。
【００１１】本発明にかかる充填剤は次の様にして製造
することができる。炭素鎖の両端に１級アミンと反応す
る基を有する化合物、例えばスクシンイミジルスベレイ
ト（以下ＤＳＳと略す）をアセトニトリルに溶解し更に
炭酸水素ナトリウム緩衝液とアミノプロピルシリカゲル
を加え反応させる。有機溶媒をよく洗浄した後、炭酸水
素ナトリウム緩衝液中でアミノ基を有する蛋白質と更に
反応させることにより炭素鎖を介して蛋白質が結合した
充填剤を得ることができる。この場合には、蛋白質はア
ミド結合を介してｎ−ヘキシル基に結合し、更にアミド
結合を介してアミノプロピルシリカゲルのプロピルシリ
カゲル残基に結合している。あるいは、アミノプロピル
シリカゲルをステンレスカラムに充填後、上述の溶媒、
反応剤をポンプで送液して炭素鎖を介して蛋白質が結合
した充填剤が充填された高速液体クロマトグラフィ−用
カラムを得ることもできる。
することができる。炭素鎖の両端に１級アミンと反応す
る基を有する化合物、例えばスクシンイミジルスベレイ
ト（以下ＤＳＳと略す）をアセトニトリルに溶解し更に
炭酸水素ナトリウム緩衝液とアミノプロピルシリカゲル
を加え反応させる。有機溶媒をよく洗浄した後、炭酸水
素ナトリウム緩衝液中でアミノ基を有する蛋白質と更に
反応させることにより炭素鎖を介して蛋白質が結合した
充填剤を得ることができる。この場合には、蛋白質はア
ミド結合を介してｎ−ヘキシル基に結合し、更にアミド
結合を介してアミノプロピルシリカゲルのプロピルシリ
カゲル残基に結合している。あるいは、アミノプロピル
シリカゲルをステンレスカラムに充填後、上述の溶媒、
反応剤をポンプで送液して炭素鎖を介して蛋白質が結合
した充填剤が充填された高速液体クロマトグラフィ−用
カラムを得ることもできる。
【００１２】更に、化学修飾した蛋白質を使用する場合
には、例えば、オボムコイドのような蛋白質及びグルタ
−ルアルデヒドをｐＨ６．８のりん酸塩緩衝液にいれ、
３０℃で１５時間撹拌後して、グルタ−ル化オボムコイ
ド（非還元型）を得る。更に、水素化ホウ素ナトリウム
を用いて、ｐＨ６．８のりん酸緩衝液中で、４℃、１２
時間撹拌し還元してグルタ−ル化オボムコイド（還元
型）を得ることができる。次に、ＤＳＳをアセトニトリ
ルに溶解し、炭酸水素ナトリウム緩衝液とアミノプロピ
ルシリカゲルを加え反応させる。有機溶媒をよく洗浄し
た後、炭酸水素ナトリウム緩衝液中で上記の化学修飾し
た蛋白質を反応させることにより、化学修飾した蛋白質
が結合した充填剤を得ることができる。化学修飾した蛋
白質が結合した充填剤は、また、蛋白質が炭素鎖を介し
て結合した充填剤を化学修飾することによっても得るこ
とができる。
には、例えば、オボムコイドのような蛋白質及びグルタ
−ルアルデヒドをｐＨ６．８のりん酸塩緩衝液にいれ、
３０℃で１５時間撹拌後して、グルタ−ル化オボムコイ
ド（非還元型）を得る。更に、水素化ホウ素ナトリウム
を用いて、ｐＨ６．８のりん酸緩衝液中で、４℃、１２
時間撹拌し還元してグルタ−ル化オボムコイド（還元
型）を得ることができる。次に、ＤＳＳをアセトニトリ
ルに溶解し、炭酸水素ナトリウム緩衝液とアミノプロピ
ルシリカゲルを加え反応させる。有機溶媒をよく洗浄し
た後、炭酸水素ナトリウム緩衝液中で上記の化学修飾し
た蛋白質を反応させることにより、化学修飾した蛋白質
が結合した充填剤を得ることができる。化学修飾した蛋
白質が結合した充填剤は、また、蛋白質が炭素鎖を介し
て結合した充填剤を化学修飾することによっても得るこ
とができる。
【００１３】
【作用】本発明にかかるカラムを高速液体クロマトグラ
フィ−に接続して、生体成分とともに低分子化学物質を
注入すると生体成分の妨害を受けずに低分子化学物質の
精度の良い分析ができる。そのメカニズムは必ずしも明
らかではないが、次のように考えることができる。生体
成分とともに低分子化合物を、高速液体クロマトグラフ
ィ−に接続した本発明にかかるカラムに注入すると、生
体成分中に含まれるアルブミン、グロブリンなどの高分
子物質は本発明にかかる充填剤の表面に存在する蛋白質
を通り抜けることができず、また蛋白質は親水性である
ためにカラムに保持されることなく流出する。
フィ−に接続して、生体成分とともに低分子化学物質を
注入すると生体成分の妨害を受けずに低分子化学物質の
精度の良い分析ができる。そのメカニズムは必ずしも明
らかではないが、次のように考えることができる。生体
成分とともに低分子化合物を、高速液体クロマトグラフ
ィ−に接続した本発明にかかるカラムに注入すると、生
体成分中に含まれるアルブミン、グロブリンなどの高分
子物質は本発明にかかる充填剤の表面に存在する蛋白質
を通り抜けることができず、また蛋白質は親水性である
ためにカラムに保持されることなく流出する。
【００１４】一方、低分子化学物質は蛋白質を通り抜け
炭素鎖に達し疎水的相互作用等を受け種々の成分に分離
する。この低分子化学物質と炭素鎖の相互作用は炭素鎖
の種類に応じて種々変化するため目的に応じてもっとも
適切なものを選ぶことが可能である。しかし、特願昭６
１−７４３６９に開示するような蛋白質が直接アミノプ
ロピルシリカゲルに化学結合した充填剤では低分子物質
は保持されない。更に驚くべきことには、本発明者らは
蛋白質に光学的に活性な物質を用いると、低分子化学物
質の光学異性体をも分離できることを見いだし、しかも
その光学異性体分離能は、担体に直接蛋白質を結合した
場合よりすぐれていることを見いだした。
炭素鎖に達し疎水的相互作用等を受け種々の成分に分離
する。この低分子化学物質と炭素鎖の相互作用は炭素鎖
の種類に応じて種々変化するため目的に応じてもっとも
適切なものを選ぶことが可能である。しかし、特願昭６
１−７４３６９に開示するような蛋白質が直接アミノプ
ロピルシリカゲルに化学結合した充填剤では低分子物質
は保持されない。更に驚くべきことには、本発明者らは
蛋白質に光学的に活性な物質を用いると、低分子化学物
質の光学異性体をも分離できることを見いだし、しかも
その光学異性体分離能は、担体に直接蛋白質を結合した
場合よりすぐれていることを見いだした。
【００１５】すなわち、本発明にかかる充填剤あるいは
カラムは生体成分の影響を受けることなく精度良く低分
子物質の分析ができるだけでなくその光学分割もできる
のである。また、本発明を例えば血漿中の薬物濃度を測
定する際の前処理用カラムとして使用する場合には、従
来のような複雑な操作を必要とせずに血漿中の生体成分
を分離できるため前処理に要する時間を大幅に短縮でき
る。
カラムは生体成分の影響を受けることなく精度良く低分
子物質の分析ができるだけでなくその光学分割もできる
のである。また、本発明を例えば血漿中の薬物濃度を測
定する際の前処理用カラムとして使用する場合には、従
来のような複雑な操作を必要とせずに血漿中の生体成分
を分離できるため前処理に要する時間を大幅に短縮でき
る。
【００１６】
【効果】アビジンまたはオボアルブミンをＣ6 の炭素鎖
を介してアミノプロピルシリカゲル担体に結合した充填
剤を充填したカラムを用いて、血漿中の蛋白質の回収率
を測定した結果を表１に示す。結果は、ヒト血漿２０μ
ｌを、高速液体クロマトグラフィ−に接続した上記カラ
ムに注入して、カラムからの流出液を１０分間集め流出
液中の蛋白量を測定したものである。蛋白量の測定は、
ブラッドフォ−ド（Analytical Biochemistry Vol.72,2
48-254(1976)）の方法に従い、比色定量により行った。
を介してアミノプロピルシリカゲル担体に結合した充填
剤を充填したカラムを用いて、血漿中の蛋白質の回収率
を測定した結果を表１に示す。結果は、ヒト血漿２０μ
ｌを、高速液体クロマトグラフィ−に接続した上記カラ
ムに注入して、カラムからの流出液を１０分間集め流出
液中の蛋白量を測定したものである。蛋白量の測定は、
ブラッドフォ−ド（Analytical Biochemistry Vol.72,2
48-254(1976)）の方法に従い、比色定量により行った。
【００１７】
【表１】
【００１８】表１より、血漿中の蛋白質はｐＨ２及びｐ
Ｈ７では本発明によるカラムにほとんど吸着しないこと
が分かる。ｐＨ４．５における回収率が悪い理由は、血
漿中の蛋白質の等電点が、ｐＨ４．５付近であるため、
疎水性が増加しカラムに保持されたものと考えられる。
Ｈ７では本発明によるカラムにほとんど吸着しないこと
が分かる。ｐＨ４．５における回収率が悪い理由は、血
漿中の蛋白質の等電点が、ｐＨ４．５付近であるため、
疎水性が増加しカラムに保持されたものと考えられる。
【００１９】次に、ケトプロフェン対掌体を本発明によ
るカラム（アビジンをＣ6 炭素鎖を介してアミノプロピ
ルシリカゲル担体に結合した充填剤を充填したカラム）
に注入した場合のクロマトグラムを図１に示す。実験
は、ヒト血漿２０μｌにケトプロフェン鏡像体５０μｇ
を添加したサンプルを注入して行った。
るカラム（アビジンをＣ6 炭素鎖を介してアミノプロピ
ルシリカゲル担体に結合した充填剤を充填したカラム）
に注入した場合のクロマトグラムを図１に示す。実験
は、ヒト血漿２０μｌにケトプロフェン鏡像体５０μｇ
を添加したサンプルを注入して行った。
【００２０】高速液体クロマトグラフィ−条件は次のよ
うである。移動相 ５％アセトニトリル／９５％
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７） 流速 １ｍｌ／ｍｉｎ 検出波長 ２６０ｎｍ
うである。移動相 ５％アセトニトリル／９５％
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７） 流速 １ｍｌ／ｍｉｎ 検出波長 ２６０ｎｍ
【００２１】図１より、血漿成分に妨害されずにケトプ
ロフェンの分析ができることが分かる。しかも、ケトプ
ロフェンの光学分割が同時に行えることが明らかであ
る。
ロフェンの分析ができることが分かる。しかも、ケトプ
ロフェンの光学分割が同時に行えることが明らかであ
る。
【００２２】
【実施例】実施例 1
アミノプロピルシリカゲル３ｇ及びＤＳＳ２ｇを０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）とアセトニトリ
ルの１：１混液１００ｍｌに入れ、一夜撹拌し、ガラス
フィルタ−上に取り、十分に洗浄して、活性化アミノプ
ロピルシリカゲルを得た。別に、アビジンを０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム緩衝液１００ｍｌに溶解し、前記の活
性化アミノプロピルシリカゲルを加え１６時間反応さ
せ、アビジンがＣ6 の炭素鎖を介してアミノプロピルシ
リカゲル担体に結合した充填剤を得た。
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）とアセトニトリ
ルの１：１混液１００ｍｌに入れ、一夜撹拌し、ガラス
フィルタ−上に取り、十分に洗浄して、活性化アミノプ
ロピルシリカゲルを得た。別に、アビジンを０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム緩衝液１００ｍｌに溶解し、前記の活
性化アミノプロピルシリカゲルを加え１６時間反応さ
せ、アビジンがＣ6 の炭素鎖を介してアミノプロピルシ
リカゲル担体に結合した充填剤を得た。
【００２３】実施例２
実施例１で得た充填剤をステンレスカラムに充填し、高
速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。 実施例３ 実施例２で得た高速液体クロマトグラフィ−用カラムを
用いヒト血漿中のケトプロフェンの分析を行った。移動
相の組成は５％アセトニトニル／９５％ ０．１Ｍリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）であり、流速は１ｍｌ／ｍ
ｉｎ，検出波長は２６０ｎｍであった。
速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。 実施例３ 実施例２で得た高速液体クロマトグラフィ−用カラムを
用いヒト血漿中のケトプロフェンの分析を行った。移動
相の組成は５％アセトニトニル／９５％ ０．１Ｍリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）であり、流速は１ｍｌ／ｍ
ｉｎ，検出波長は２６０ｎｍであった。
【００２４】実施例４
実施例１で得た充填剤をカラムに充填し、蛋白質などの
生体成分を除去し、低分子量物質を精製できるカラムを
得た。 実施例５ 実施例４で得たカラムを用いヒト血漿中のケトプロフェ
ンの分離を行った。カラムに薬物を含んだ血漿を直接注
入し、少量のｐＨ７緩衝液で洗浄し、更に１０％アセト
ニトリル／ｐＨ７リン酸緩衝液により、薬物のみを溶出
させた。 実施例６ アミノプロピルシリカゲル３ｇ及びＤＳＳ２ｇを０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）とアセトニトリ
ルの１：１混液１００ｍｌに入れ、一夜撹拌し、ガラス
フィルタ−上に取り、十分に洗浄して、活性化アミノプ
ロピルシリカゲルを得た。別に、オボアルブミンを０．
１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液１００ｍｌに溶解し、前
記の活性化アミノプロピルシリカゲルを加え１６時間反
応させ、オボアルブミンがＣ6 の炭素鎖を介してアミノ
プロピルシリカゲル担体に結合した充填剤を得た。
生体成分を除去し、低分子量物質を精製できるカラムを
得た。 実施例５ 実施例４で得たカラムを用いヒト血漿中のケトプロフェ
ンの分離を行った。カラムに薬物を含んだ血漿を直接注
入し、少量のｐＨ７緩衝液で洗浄し、更に１０％アセト
ニトリル／ｐＨ７リン酸緩衝液により、薬物のみを溶出
させた。 実施例６ アミノプロピルシリカゲル３ｇ及びＤＳＳ２ｇを０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）とアセトニトリ
ルの１：１混液１００ｍｌに入れ、一夜撹拌し、ガラス
フィルタ−上に取り、十分に洗浄して、活性化アミノプ
ロピルシリカゲルを得た。別に、オボアルブミンを０．
１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液１００ｍｌに溶解し、前
記の活性化アミノプロピルシリカゲルを加え１６時間反
応させ、オボアルブミンがＣ6 の炭素鎖を介してアミノ
プロピルシリカゲル担体に結合した充填剤を得た。
【００２５】実施例７
実施例６で得た充填剤をステンレスカラムに充填し、高
速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。
速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。
【００２６】実施例８
アミノプロピルシリカゲル３ｇ及びＤＳＳ２ｇを０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）とアセトニトリ
ルの１：１混液１００ｍｌに入れ、一夜撹拌し、ガラス
フィルタ−上に取り、十分に洗浄して、活性化アミノプ
ロピルシリカゲルを得た。別に、オボムコイドを０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液１００ｍｌに溶解し、前記
の活性化アミノプロピルシリカゲルを加え１６時間反応
させ、オボムコイドがＣ6 の炭素鎖を介してアミノプロ
ピルシリカゲル担体に結合した充填剤を得た。
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）とアセトニトリ
ルの１：１混液１００ｍｌに入れ、一夜撹拌し、ガラス
フィルタ−上に取り、十分に洗浄して、活性化アミノプ
ロピルシリカゲルを得た。別に、オボムコイドを０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液１００ｍｌに溶解し、前記
の活性化アミノプロピルシリカゲルを加え１６時間反応
させ、オボムコイドがＣ6 の炭素鎖を介してアミノプロ
ピルシリカゲル担体に結合した充填剤を得た。
【００２７】実施例９
実施例８で得た担体をステンレスカラムに充填し、高速
液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。
液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。
【００２８】実施例１０
アミノプロピルシリカゲル３ｇ及び1、10- ドデカン二
酸Ｎ，Ｎ’- ジスクシンイミジル２ｇを０．１Ｍ炭酸水
素ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）とアセトニトリルの１：
１混液１００ｍｌに入れ、一夜撹拌し、ガラスフィルタ
−上に取り、十分に洗浄して、活性化アミノプロピルシ
リカゲルを得た。別に、アビジンを０．１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム緩衝液１００ｍｌに溶解し、前記の活性化アミ
ノプロピルシリカゲルを加え、１６時間反応させ、アビ
ジンがＣ10の炭素鎖を介してアミノプロピルシリカゲル
担体に結合した充填剤を得た。
酸Ｎ，Ｎ’- ジスクシンイミジル２ｇを０．１Ｍ炭酸水
素ナトリウム緩衝液（pH6.8 ）とアセトニトリルの１：
１混液１００ｍｌに入れ、一夜撹拌し、ガラスフィルタ
−上に取り、十分に洗浄して、活性化アミノプロピルシ
リカゲルを得た。別に、アビジンを０．１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム緩衝液１００ｍｌに溶解し、前記の活性化アミ
ノプロピルシリカゲルを加え、１６時間反応させ、アビ
ジンがＣ10の炭素鎖を介してアミノプロピルシリカゲル
担体に結合した充填剤を得た。
【００２９】1、10- ドデカン二酸Ｎ，Ｎ’- ジスクシ
ンイミジルの合成は次のようにして行った。1、10- ド
デカン二酸４．５ｇと炭酸Ｎ，Ｎ’- ジスクシンイミジ
ルをアセトニトリル１００ｍｌに溶解し、ピリジン３．
２ｍｌを加えた後、還流下１０時間撹拌した。冷却後、
溶媒を減圧下留去すると結晶が析出した。得られた結晶
を酢酸エチルより再結晶し、目的物４．２ｇを白色の結
晶として得た。
ンイミジルの合成は次のようにして行った。1、10- ド
デカン二酸４．５ｇと炭酸Ｎ，Ｎ’- ジスクシンイミジ
ルをアセトニトリル１００ｍｌに溶解し、ピリジン３．
２ｍｌを加えた後、還流下１０時間撹拌した。冷却後、
溶媒を減圧下留去すると結晶が析出した。得られた結晶
を酢酸エチルより再結晶し、目的物４．２ｇを白色の結
晶として得た。
【００３０】実施例１１
実施例１０で得た充填剤をステンレスカラムに充填し、
高速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。 実施例１２ 実施例１で得た担体２ｇおよびグルタ−ルアルデヒド
０．１ｇを０．０６Ｍりん酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）３
０ｍｌに入れ、３０℃で１５時間撹拌し、グルタ−ル化
されたアビジン（非還元型）が結合した担体を得た。更
に、０．２ｇの水素化法素ナトリウムを加え、４℃で１
２時間撹拌、還元し、グルタ−ル化されたアビジン（還
元型）が結合した充填剤を得た。 実施例１３ 実施例１２で得た担体をステンレスカラムに充填し、高
速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。
高速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。 実施例１２ 実施例１で得た担体２ｇおよびグルタ−ルアルデヒド
０．１ｇを０．０６Ｍりん酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）３
０ｍｌに入れ、３０℃で１５時間撹拌し、グルタ−ル化
されたアビジン（非還元型）が結合した担体を得た。更
に、０．２ｇの水素化法素ナトリウムを加え、４℃で１
２時間撹拌、還元し、グルタ−ル化されたアビジン（還
元型）が結合した充填剤を得た。 実施例１３ 実施例１２で得た担体をステンレスカラムに充填し、高
速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。
【００３１】実施例１４
アミノプロピルシリカゲルをステンレススチ−ルカラム
に常法により充填した。次にＤＳＳ３００ｍｇを溶解し
た０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液：アセトニトリル
（１：２）混合溶液からなる移動相３０ｍｌで４時間還
流し活性化した。移動相を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液で置換し、アビジン５００ｍｇが溶解した同緩衝
液を４時間還流してアビジンがＣ6 の炭素鎖を介してア
ミノプロピルシリカゲルに結合した充填剤が充填された
高速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。
に常法により充填した。次にＤＳＳ３００ｍｇを溶解し
た０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液：アセトニトリル
（１：２）混合溶液からなる移動相３０ｍｌで４時間還
流し活性化した。移動相を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム
緩衝液で置換し、アビジン５００ｍｇが溶解した同緩衝
液を４時間還流してアビジンがＣ6 の炭素鎖を介してア
ミノプロピルシリカゲルに結合した充填剤が充填された
高速液体クロマトグラフィ−用カラムを得た。
【００３２】
【図１】 ヒト血漿中に含まれるケトプロフェン鏡像体
を、本発明にかかる充填剤を充填したカラムに注入した
場合のクロマトグラムを示す。
を、本発明にかかる充填剤を充填したカラムに注入した
場合のクロマトグラムを示す。
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭60−152518（ＪＰ，Ａ)
Ｇｅｎ Ｔａｍａｉ，Ｍａｓａｍｉ
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ａｓａｎｏｒｉ Ｋａｙａｎｏ，Ｊ．Ｃ
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227−233
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 30/48
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】アビジン、またはオボアルブミンのうちか
ら選択された蛋白質が化学結合により炭素鎖の一方に結
合し、さらにその炭素鎖のもう一方が化学結合によりア
ミノアルキル基を有するシリカゲルのアミノ基に結合し
た充填剤。 - 【請求項２】蛋白質が、化学修飾したアビジン、または
オボアルブミンである請求項１記載の充填剤。 - 【請求項３】蛋白質の化学修飾が、グルタ−ル化もしく
はその還元化、ジオ−ル化またはアシル化である請求項
２記載の充填剤。 - 【請求項４】炭素鎖が、直鎖状もしくは分岐状炭素鎖、
シアノ基もしくはアリ−ル基を有する直鎖状もしくは分
岐状炭素鎖、炭素鎖中にアリ−ル基を有する炭素鎖、ま
たは炭素鎖中にジスルフィド結合を有する炭素鎖である
請求項１記載の充填剤。 - 【請求項５】アビジン、またはオボアルブミンのうちか
ら選択された蛋白質がアミド結合により炭素鎖の一方に
結合し、さらにその炭素鎖のもう一方がアミド結合によ
りアミノアルキル基を有するシリカゲルのアミノ基に結
合した充填剤。 - 【請求項６】 アビジン、またはオボアルブミンのうちか
ら選択された蛋白質が化学結合により炭素鎖の一方に結
合し、更にその炭素鎖のもう一方が化学結合によりアミ
ノアルキル基を有するシリカゲルのアミノ基に結合した
充填剤を充填した高速液体クロマトグラフィ−用カラ
ム。 - 【請求項７】 アビジン、またはオボアルブミンのうちか
ら選択された蛋白質が化学結合により炭素鎖の一方に結
合し、更にその炭素鎖のもう一方が化学結合によりアミ
ノアルキル基を有するシリカゲルのアミノ基に結合した
充填剤を充填した精製用カラム。
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- 1992-02-20 DE DE69219384T patent/DE69219384T2/de not_active Expired - Lifetime
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- 1992-02-20 DK DK92102841.1T patent/DK0501309T3/da active
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