KR101060896B1 - 금속 킬레이트 친화성 리간드의 형성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 카르보닐, 인접 황 및 친핵체를 포함하는 환식 스캐폴드를 제공하는 단계; 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드 아암을 상기 친핵체의 유도체화에 의해 각 스캐폴드 상에 제공하는 단계; 더 많은 금속 킬레이트 친화성 리간드 아암(들)을 스캐폴드에 추가하는 시약을 첨가하여 스캐폴드를 개환 반응시키는 단계; 및 필요시에 그렇게 제공된 리간드 아암(들)의 관능기를 탈보호하는 단계를 포함하는, 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드의 형성 방법에 관한 것이다. 방법의 가장 바람직한 실시태양에서, 개환 반응 및 탈보호 단계는 단일 단계로 수행된다.
스캐폴드, 금속 킬레이트 친화성 리간드, 개환 반응, 관능기, 탈보호, 분리 매질

Description

금속 킬레이트 친화성 리간드의 형성 방법{A Method of Generating Metal Chelating Affinity Ligands}
본 발명은 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드의 형성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 리간드를 포함하는 분리 매질의 형성 방법, 및 그러한 리간드 및 매질을 포함한다.
임의의 화학 또는 생물공학 산업에서, 복합 혼합물로부터 생성물을 분리하고 정제하는 것은 생산 라인에서 필요한 중요한 단계이다. 오늘날, 이러한 목표를 이루는 다양한 방법이 산업 분야에 존재하며, 그 중 하나가 크로마토그래피법이다. 크로마토그래피는 복합 혼합물을 높은 정밀도로 분리할 수 있으므로 생명공학 분야에서의 각종 용도에 아주 적합하며, 수행되는 조건이 일반적으로 엄격하지 않으므로 단백질과 같은 더 민감한 생성물에 적합하다.
특히 민감한 분리 기술이며 대부분의 단백질 유형에 적용가능한 하나의 크로마토그래피 방법은 고정화 금속 이온 흡착 크로마토그래피 (IMAC)로 알려지기도 한 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (MCAC)이다. 이 기술은 이온 교환 크로마토그래피 (IEX) 및(또는) 소수 상호작용 크로마토그래피 (HIC)와 같은 다른 크로마토그래피 단계와 함께 정제 방법에 통용된다.
더욱 상세하게는, IMAC는 전이 금속 이온과 킬레이트를 형성할 수 있는 기를 포함하는 기질을 이용하며, 킬레이트는 다시 크로마토그래피에서 리간드로서 사용되어 액체로부터 화합물을 흡착한다. IMAC에서의 결합 강도는 금속 이온 종, 완충액의 pH 및 사용된 리간드의 특성에 의해 주로 영향받는다. 금속 이온이 기질에 강하게 결합되므로, 흡착된 단백질은 pH 저하 또는 경쟁적 용리에 의해 용리될 수 있다.
일반적으로, IMAC는 기질의 전이 금속 이온에 대한 친화력을 나타내는 단백질 또는 다른 분자의 분리에 유용하다. 예를 들면, 단백질은 모두 킬레이트화 금속에 대해 친화력을 나타내는 접근가능한 히스티딘, 시스테인 및 트립토판 잔기의 존재시에 기질에 결합할 것이다.
분자 생물학 기술의 출현으로, 단백질은 현재 금속 킬레이트화 리간드에 대한 그의 친화력을 증가시키기 위해 하나 이상의 히스티딘 잔기로 쉽게 개조되거나 표지되며, 따라서 금속 킬레이트 크로마토그래피는 더욱 최근에 단백질의 정제에 더욱 중요한 역할을 나타내었다.
이미노디아세트산 (IDA)과 같은 단순 킬레이터는 IMAC용 리간드로서 제안되었다. 아가로스 지지체에 결합되고 이후에 각종 금속, 예를 들면 Cu2+, Zn2+ 및 Ni2+로 하전된 IDA는 단백질 및 펩티드의 포획에 사용되어 왔으며 상용 수지로서 이용가능하다. 더욱 상세하게는, USP 4,551,271호 (Hochuli, Hoffmann-La Roche Inc.에게 양도됨)는 인터페론의 정제에서 IDA 리간드를 포함하는 금속 킬레이트 수지를 개시한다. 수지는 다음 화학식으로 정의될 수 있다:
[아가로스]-O-(CH2)-CHOH-CH2-N(CH2COO-)2Me2+
상기 식에서, Me는 Ni 또는 Cu이다.
인터페론이 미리 부분적으로 정제된 경우 이 수지에 의해 최상의 결과를 얻을 수 있다. 설명에 따른 수지는 아가로스를 에피클로로히드린 또는 에피브로모히드린으로 처리하고, 결과 에폭시드를 이미노아세트산 이나트륨 염과 반응시키고 생성물을 구리 (II) 또는 아연 용액으로 세척하여 구리 또는 아연 염으로 전환함으로써 공지된 방식으로 제조될 수 있다.
더욱 최근에는, EP 87109892.7호 (F. Hoffmann-La Roche AG) 및 그의 동등한 USP 4,877,830호 (Doebeli 등, Hoffmann-La Roche Inc.에게 양도됨)는 6개의 배위 자리를 갖는 금속과 함께 사용하기 위한 니트릴로트리아세트산 (NTA)으로서 알려진 네자리 킬레이터를 개시하였다. 더욱 상세하게는, 기질은 화학식 [담체 기질]-스페이서-NH-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2COO-)2Ni2+ (x=2-4)에 의해 설명될 수 있다. 개시된 기질은 화학식 R-HN-(CH2)x-CH(NH2)-COOH (여기서, R은 아미노 보호기이고, x는 2, 3 또는 4임)의 아미노산 화합물을 알칼리 매질에서 브로모아세트산과 반응시키고, 이후에 중간 정제 단계 후에 보호기를 절단하고 이 기를 활성화 기질과 반응시켜 제조한다. 따라서, 그 제조 방법은 아미노산을 알킬화하고 탈보호하는 별개의 단계들을 포함하며, 그 단계들은 방법을 시간과 비용이 많이 들게 한다. 또한, 알킬 화 화학은 덜 효율적이고, 탈보호 후에 생성물은 중화 및 절단으로부터의 잔여 생성물에 관해 잘 정의되지 않는다. 이 다음에, 재료는 아미드 결합을 형성함으로써 카르복실 관능기를 갖고 있는 고상 지지체에 결합된다. 그러나, 이 절차는 얻어진 매질이 고정화된 목적하는 킬레이트 리간드 뿐만 아니라 일부 미반응된 카르복실기를 제공하여 불균질 매질을 생산하게 되므로 단점을 나타낼 수 있다. 또한, 모노-N-보호된 아미노산 화합물은 값비싼 출발 물질이므로 전체 방법을 더욱 비용이 많이 들게 한다.
마지막으로, WO 01/81365호 (Sigma-Aldrich Co.)는 설명에 따라서 금속 이온과 비교적 안정한 킬레이트를 형성할 수 있고 폴리히스티딘 표지된 단백질에 대해 개선된 선택성을 나타내는 금속 킬레이트 조성물을 개시한다. 상기 WO 01/81365호에 따르면, 킬레이터와 수지 사이의 결합은 선택성에 대한 중요한 파라메터이며, 결합은 중성 에테르, 티오에테르, 셀레노에테르 또는 아미드이다. 개시된 조성물은 제공된 실시예에 따른 세파로스TM와 같은 불용성 담체에 결합된다. 크로마토그래피 매질은 2가지 다른 방식으로, 예를 들면 최종적으로 크로마토그래피 매질에 사용되는 예비-활성화 고상 지지체 상에서의 직접 고상 반응에 의해 또는 최종적으로 고상 지지체에 결합되는 중간 생성물 N,N,N',N'-테트라키스(카르복시메틸)-L-시스틴의 별개의 용액 합성에 의해 생산된다.
고상 합성은 세척으로 이어지는, 장기간의 반응 시간 (18시간) 동안 알칼리 조건하에서 이전에 에피클로르히드린 활성화된 세파로스TM 겔에 L-시스테인을 첨가 함으로써 수행된다. 그후에, 다시 장기간의 반응 시간 (72시간) 동안 알칼리 조건하에서 브로모아세트산을 첨가하고, 다시 세척과, 최종적으로 겔 상에 존재하는 나머지 자유 아미노기를 아세트산 무수물로 캡핑하는 것으로 이어진다. 이러한 방식의 고상 합성은 불량한 반응 조절 및 잠재적인 부반응을 제공하며, 따라서 덜 균질한 생성물을 생산하게 된다.
중간 생성물의 용액상 합성에 따른 또다른 경로는 알칼리 보레이트 완충액에서 다량 (40배)의 글리옥실산을 L-시스틴에 첨가하며 시작한다. 중간 생성물은 그후에 반응 혼합물의 pH 조작 및 전도율 조정 후에 이온 교환 크로마토그래피로 정제되어 N,N,N',N'-테트라키스(카르복시메틸)-L-시스틴을 제공하게 된다.
N,N,N',N'-테트라키스(카르복시메틸)-L-시스틴은 고상 지지체에 커플링하기 전에 알칼리 조건하에서 트리스(카르복시에틸)포스핀을 사용하여 N,N-비스(카르복시메틸)-L-시스테인으로 환원되어야 한다. 이 재료는 최종적으로 예비활성화 고상 지지체에 커플링하는데 사용되어 크로마토그래피 매질을 형성하게 된다. 이 합성 방법은 정교하게 이루어지며 다량의 시약에 의존하여 목적 생성물을 형성하며, 그 목적 생성물은 최종적으로 특정 크로마토그래피 조건하에서 정제되고, 이어서 추가의 합성 단계로서 환원되고, 따라서 대규모 생산에 사용하기에 덜 적합하게 된다.
따라서, IMAC 리간드의 개선된 합성 방법 및 기재 기질에 대한 그의 고정화 방법이 여전히 필요하다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 기재 기질에 대한 이후의 커플링을 위한 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드의 개선된 형성 방법이며, 그 방법은 비용 효율적이고 쉽게 이용가능한 출발 물질 및 시약을 이용하며 고수율을 제공한다. 이는 청구항 1에 정의된 바와 같이 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 IMAC에 사용하기 위한 기재 기질 상에 고정화되는 리간드를 주의깊게 선택할 수 있게 하는 것이다. 이는 커플링 화학이 잘 정의되고 조절하기가 쉬운, 기재 기질에 커플링된 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드를 포함하는 분리 매질의 형성 방법에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 균질 생성물을 형성하게 하는 그러한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 동일한 종류이거나 상이할 수 있는 2개 이상의 관능기를 도입하게 하는, 상기 논의된 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 기재 기질로의 커플링에 대한 개선된 취급 및 선행 기술 리간드에 비해 개선된 커플링 효율을 제공하는, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피용 리간드를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 사용시에 낮은 금속 이온 누설(leakage)을 나타내는 크로크로마토그래피 매질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 특정 용도에 리간드를 최적화하는데 사용될 수 있는, 동일한 스캐폴드를 기초로 한 다양한 금속 킬레이트 친화성 리간드의 형성 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 하나 이상의 첨부된 청구항에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명의 추가의 목적, 잇점 및 실시태양은 이어지는 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 여러자리 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 리간드를 포함하는 분리 매질을 생산하는 일반적인 경로의 개략도를 제공한다.
도 2(a) 및 (b)는 본 발명에 따라서 제조되는 IMAC 분리 매질을 이용한, (His)6-테일을 가진 말토오스 결합 단백질 (MBP-His)의 정제를 예시한다. 더욱 상세하게는, 도 2(a)는 크로마토그램이며, 도 2(b)는 상기 크로마토그램의 구배 부분의 확대이다. 도 2에서, A280 ㎚에서의 곡선은 A로 표시되고, 용리 완충액의 백분율 (%)은 B로 표시되고 전도율은 C로 표시된다.
도 3은 MBP-His의 IMAC 정제로부터의 분획의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 분획의 번호 매김은 도 2 크로마토그램에서와 같다.
도 4는 시험 크로마토그램을 나타내며, 여기서 UV 372 ㎚ = A, 전도율 = B, 주입 = C이다. 이러한 원형의 니켈-결합능은 16 μmol Ni/㎖이고 금속 누설은 4%로 확인되었다.
도 5는 실시예 5에 설명된 바와 같이 본 발명에 따른 분리 매질 상에서 수행된 니켈 결합능 시험의 결과를 나타낸다.
정의
용어 "분리 매질"은 본원에서 예를 들면, 크로마토그래피 컬럼의 충진제로서 유용한 재료에 대해 사용되며, 더욱 상세하게는 기재 기질에 커플링된 하나 이상의 리간드로 이루어진다. 따라서, 기재 기질은 담체로서 작용하는 반면, 리간드는 크로마토그래피에서 표적 물질과 상호작용하는 관능기를 제공한다.
용어 "스페이서"는 리간드를 기재 기질로부터 떼어놓는 화학 구조물에 대해 사용된다.
용어 "리간드"는 본원에서 표적 물질을 결합할 수 있는 화학 구조물을 의미한다. 그러한 표적 물질은 크로마토그래피에 의해 단리 또는 제거하고자 하는 화합물, 또는 다르게는 분석 표적 물질일 수 있다.
용어 "여러자리 금속 킬레이트" 리간드는 금속에 동시에 배위하는, 즉 금속을 동시에 킬레이트할 수 있는 2개 이상의 공여 원자를 가진 리간드를 의미한다. 따라서, 여러자리 리간드는 2개 이상의 공여 원자를 가지며 배위권에서 2개 이상의 자리를 차지한다.
따라서, 용어 "금속 킬레이트 관능기"는 공여 원자를 제공하는 기를 의미한다. 일반적으로, 관능기들은 서로 떨어져 있으며 그러므로 용어 "리간드 아암"은 각 관능기에 대해 사용된다.
용어 "겔"은 겔의 형태인 분리 매질에 대해 사용된다.
따라서, 본 발명은 제1 면에서
(a) 하기 화학식 I에 의해 정의되는 하나 이상의 스캐폴드를 제공하는 단계
Figure 112005047409913-pct00001
(상기 식에서, X1, X2 및 X3은 서로 독립적으로 sp2- 또는 sp3-혼성화 탄소 원자 또는 헤테로원자이고, X4는 친핵체이고, m은 0-2의 정수임);
(b) 임의로 금속 킬레이트 관능기가 보호된 형태인, 하나 이상의 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드 아암을, 스캐폴드의 환식 구조를 유지하면서 상기 스캐폴드의 친핵성 X4 기의 유도체화에 의해 각 스캐폴드 상에 제공하는 단계;
(c) 하나 이상의 금속 킬레이트 친화성 리간드 아암을 스캐폴드에 추가하는 시약을 첨가하여 유도체화된 스캐폴드의 카르보닐과 황 사이의 결합에서 개환 반응시키는 단계; 및 필요시에
(d) 단계 (b)에 제공된 리간드 아암(들)의 관능기를 탈보호하는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드의 형성 방법에 관한 것이다.
단계 (a)의 스캐폴드는 고체로서, 또는 바람직하게는 용매 중에 제공될 수 있다. 가장 유리한 실시태양에서, 화학식 I에서, X1, X2 및 X3은 탄소 원자이다. 다른 실시태양에서, X1, X2 및 X3 중 하나 이상은 산소, 황, 질소 및(또는) 실리카로 이루어진 군에서 선택되는 헤테로원자이며, 단 상기 헤테로원자는 리간드의 이후의 사용에 방해되지 않는다.
화학식 I에서, X4는 유도체화를 가능하게 하는 임의의 적합한 친핵성 기이다. 따라서, 예시적인 실시태양에서, X4는 -OH, -SH 또는 -NH2와 같은 기로부터 선택된다. 유리한 실시태양에서, X4는 -NH2이다.
상기한 바와 같이, m은 0-2의 임의의 정수, 즉 0, 1 또는 2일 수 있다. 방법 단계들로부터 알 수 있는 바와 같이, m의 값은 리간드 아암과, 분리 매질로 전개될 때의 기재 기질에 대한 그의 부착 지점 사이의 원자의 수를 결정할 것이다.
유리한 실시태양에서, 화학식 I에서, m은 1이고 스캐폴드는 호모시스테인 티오락톤이다. 이 분야의 숙련자가 이해하는 바와 같이, 호모시스테인 티오락톤은 순수한 또는 라세미 형태로 사용될 수 있다. 호모시스테인 티오락톤은 예를 들면, 알드리치, 카탈로그 번호 H1, 580-2 및 CAS 번호 6038-19-3으로부터 상업적으로 입수가능하다.
단계 (b)에서, 유도체화는 친전자성이고 따라서 화학식 I의 X4와 반응할 수 있는 제1 부분 및 금속 킬레이트 관능기를 포함하는 제2 부분으로 이루어진 적당한 유도체화제를 첨가함으로써 수행된다.
유도체화제의 제1 부분, 즉 친전자성 부분은 C=C; C-Y (여기서, Y는 예를 들 면, Br, I, Cl과 같은 할로겐, 또는 메실레이트 또는 토실레이트 기를 나타냄); 또는 산 또는 활성 산, 예를 들면 WC=O (여기서, W는 예를 들면, N-히드로숙신이미드, 펜타플루오로페놀, 파라-니트로페놀 또는 이소프로필 클로로포르메이트로부터 형성됨)에 의해 예시될 수 있다.
유리한 실시태양에서, 유도체화는 각각이 상이하거나 동일한 금속 킬레이트 관능기 (본원에서 L1 및 L2로 표시함)를 포함하는 2종의 유도체화제를 첨가함으로써 제공된다. 이 실시태양에서, 유도체화제의 친전자성 부분은 바람직하게는 유도체화를 촉진시키기 위해 동일한 특성을 갖는다. 대안적 실시태양에서, 2개 이상의 상이한 또는 동일한 금속 킬레이트 관능기는 X4의 유도체화에 의해, 바람직하게는 이 분야의 숙련자에 의해 실현되는 바와 같은 2가지 이상의 다른 단계를 이용하여 도입된다. 따라서, 다중 관능기는 동일한 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드에 쉽게 제공된다.
본 방법에 사용된 유도체화제(들)는 금속 킬레이트 관능기를 보호된 형태 (공여 원자가 스캐폴드의 유도체화 중에 반응에 이용될 수 없음), 또는 비-보호된 형태로 포함할 수 있다. 관능기가 보호된 실시태양에서, 상기 보호기는 이후의 단계에서 제거되기가 쉬워야 한다. 따라서, 보호기는 알킬기와 같이 산 불안정성이거나, tert-부틸기와 같이 염기 불안정성이다. 한 실시태양에서, 보호기는 CH2CH3 기이다. 각종 금속 킬레이트 관능기는 이 분야에 공지되어 있으며, 원리적으로는 임의의 전자-공여 기일 수 있다. 더욱 상세하게는, 본 방법에 사용된 금속 킬레이 트 관능기는 방향족 화합물, 헤테로시클릭 유도체, 예를 들면 피리딘, 티오펜, 푸란 및 이미다졸, 산, 에스테르, 케톤, 아미드, 술폰, 술폰아미드, 니트릴, 탄소-탄소 이중 및 삼중 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예시적 실시태양에서, 유도체화제는 할로겐화 카르복실산 에스테르, 예를 들면 할로겐화 카르복실산 알킬 에스테르이다. 상기한 바와 같이, 더욱 특정의 실시태양에서, X4는 NH2이다. NH2 기를 할로겐을 갖고 있는 기 또는 다른 이탈기와 반응시키는 방법은 이 분야에 잘 알려져 있으며 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)와 같은 용매에서 주위 온도로 편리하게 수행된다. 한 실시태양에서, 2개의 금속 킬레이트 친화성 리간드 아암을 유도체화에 의해 각 스캐폴드 상에 제공하기 위해, 유도체화제는 스캐폴드에 대해 2:1의 몰비로 사용된다. 숙련자는 반응을 쉽게 모니터하고 얻어진 유도체화를 LC-MS와 같은 통상의 방법에 의해 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 WO 01/81365호보다 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드로의 덜 복잡한 합성 경로를 제공한다. 유리한 화학으로 인해, 본 방법은 또한 더욱 균질한 생성물을 형성하게 한다. 본 방법에 따라서 얻어진 수율은 90% 정도로 높을 수 있으며, 출발 물질은 현재 적당한 비용으로 쉽게 이용가능하다.
단계 (c)에서, 개환 반응은 하나 이상의 금속 킬레이트 친화성 리간드 아암을 스캐폴드에 추가하는 시약을 첨가함으로써 유도체화된 스캐폴드의 카르보닐과 황 사이의 결합에서 제공된다. 따라서, 환식 구조는 하나 이상의 추가의 금속 킬레이트 리간드 아암을 제공하기 위해 개환된다.
개환 반응은 또한 그의 친핵 특성으로 인해 편리한 커플링 화학을 제공하는, 친티오 기 형태의 기재 기질로의 이후의 커플링에 이용가능한 취급성을 갖게 할 것이다. 유리한 실시태양에서, 개환 반응은 NaOH와 같은 알칼리 수산화물의 첨가에 의한 가수분해이며, 이 경우에 스캐폴드의 카르보닐은 카르복실기로 변형된다. 그러나, 이 분야의 숙련자가 이해하는 바와 같이, 개환 반응이 다른 시약으로 수행된다면, 하나 이상의 다른 금속 킬레이트 관능기가 도입될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 개환 반응은 아미노분해 반응이며, 이 경우에 질소는 하나 이상의 금속 킬레이트 관능기를 갖고 있다. 이 실시태양에서, 시약은 하기 화학식 II로 정의된다:
Figure 112005047409913-pct00002
(상기 식에서, L3 및 L4는 동일하거나 상이할 수 있는 금속 킬레이트 관능기를 포함한다). 또한, 한 실시태양에서, 상기 리간드 아암 L3 및 L4는 유도체화에 의해 단계 (b)에서 제공된 것과 동일하다.
따라서, 상기한 바와 같이 금속 킬레이트 관능기 L1 및 L2가 유도체화 단계 중에 보호된 실시태양에서는, 바람직하게는 탈보호 단계가 수행된다. 한 실시태양에서, 상기 탈보호는 단계 (c) 이후에 별개의 단계로서 수행되며, 상기한 바와 같이 염기 또는 산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다. 관능기의 보호/탈보호에 유용 한 화학은 이 분야에 잘 알려져 있으며, 이 분야의 숙련자는 그러한 단계를 쉽게 수행할 수 있다.
본 방법의 특히 유리한 실시태양에서, 탈보호는 개환 반응과 동일한 단계로, 즉 본질적으로 동시에 수행된다. 따라서, 이 실시태양의 큰 잇점은 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드가 두 단계 만을 포함하는 단순한 절차를 이용하여 형성될 수 있다는 점이다. 결과적으로, 이 실시태양은 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드의 합성을 위한 선행 기술 방법보다 덜 복잡한 방법을 제공한다. 유도체화제가 염기 불안정성 기를 포함하는 한 실시태양에서, 이 단계는 수산화 나트륨의 첨가에 의해 제공된다. 가수분해는 예를 들면, 1-2시간 동안 주위 온도에서 유리하게 수행된다. 사실상, 본 발명자는 모든 출발 물질이 90분 내에 전환될 수 있긴 하지만, 추가의 48시간은 임의의 부산물을 발생시키지 않는다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명에 따른 가수분해는 안정하고, 균질하고 잘 정의된 생성물을 형성한다. 유도체화제가 산 불안정성 기를 포함하는 대안적 실시태양에서, 단계 (c)에서, 이 단계는 HCl과 같은 산의 첨가에 의해 제공된다.
특정 실시태양에서, 본 방법에서 단계 (a) 및 (b)는 이미 유도체화된 스캐폴드를 제공하도록 이전에 수행되었다. 따라서, 본 발명은 또한 스캐폴드의 카르복시메틸화가 이전에 수행된 방법을 포함한다.
유리한 실시태양에서, 그렇게 얻어진 생성물은 분리 매질을 생산하기 위해 그의 황을 통해 기재 기질에 커플링된다.(고정화 방법, 특히 황을 통한 커플링의 전반적인 검토, 예를 들면 Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al 1992, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC: Chapter 3, and 특히 3.4.1.2 참조). 그러한 분리 매질은 분석 목적 등을 위한 표적 물질의 분리에 유용하다. 본 방법에 이용된 기재 기질은 의도된 용도에 적합한 임의의 물질일 수 있다.
따라서, 분리 매질이 고정화 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피에 사용되는 것으로 의도되는 경우에, 기재 기질은 통상적으로 비드 또는 모노리스 형태이며 천연 중합체, 예를 들면 아가로스 또는 덱스트란, 또는 합성 중합체, 예를 들면 디비닐벤젠 또는 스티렌으로부터 제조된다. 기재 기질은 예를 들면, 겔 형태일 수 있다. 천연 중합체에 관해서 보면, 그의 적당한 다공성 중합체 비드는 역 현탁 겔화 (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)), 또는 회전 디스크 기술 (예를 들면, WO 88/07414 (Prometic Biosciences Inc.))과 같은 표준 방법에 따라 이 분야의 숙련자에 의해 쉽게 수행된다. 다르게는, 천연 중합체 비드는 아머샴 바이오사이언스 AB (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)와 같은 상업적 공급원으로부터 구입된다. 그러한 유용한 천연 중합체 비드의 예시적인 상품명으로는 예를 들면, 세파로스TM 또는 세파덱스TM로서 공지된 종류가 있다.
합성 중합체에 관해서 보면, 기재 기질은 가교결합된 합성 중합체, 예를 들면 스티렌 또는 스티렌 유도체, 디비닐벤젠, 아크릴아미드, 아크릴레이트 에스테르, 메타크릴레이트 에스테르, 비닐 에스테르, 비닐 아미드 등으로 이루어진다. 그러한 중합체는 표준 방법에 따라서 쉽게 생산된다 [예를 들면, "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988) 참조]. 다르게는, 소스 (Source)TM (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)와 같은 상용 제품은 본 발명에 따라서 표면 개질될 수 있다.
다른 실시태양에서, 기재 기질은 예를 들면, 멤브레인, 필터, 하나 이상의 칩, 표면, 모관 등일 수 있다.
한 실시태양에서, 기재 기질의 반응성 기는 알릴 기, 즉 탄소-탄소 이중 결합이다. 한 실시태양에서는, 이미 알릴기를 나타내는 상용 기재 기질이 사용된다. 다른 실시태양에서, 알릴기는 공지된 방법에 따라서 제공된다. 따라서, 예시적 실시태양에서 본 발명의 기재 기질은 적당한 온도 및 반응 시간에서 알릴 관능기를 갖고 있는 에폭시드에 의한 처리에 의해 알릴화되었다. 그러한 통용되는 알릴 관능성 에폭시드의 일례는 알릴 글리시딜 에테르 (AGE)이다. 따라서, 특정 실시태양에서, 단계 (d)에서, 리간드의 황 기는 알릴 글리시딜 에테르 (AGE)의 활성화 알릴기를 통해 기재 기질에 커플링된다. 이 실시태양에서, 최종 생성물에서 황 기는 에테르 기 및 히드록시 기를 포함하는 스페이서에 의해 기재 기질에 부착될 것이며, 분리 매질은 기재 기질-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-S-리간드로서 정의될 수 있다.
다른 실시태양에서, 에폭시드의 개환 또는 이중 결합으로의 라디칼 첨가와 같은, 티올 함유 리간드의 다른 공지된 커플링 기술이 이용된다.
특정 실시태양에서, 상기 알릴 기는 브롬화에 의해 활성화되거나, 또는 다르게는 커플링은 자유 라디칼 반응이다. 사용된 자유 라디칼은 임의의 적합한 상용 개시제, UV 등일 수 있다.
본 발명의 제2 면은 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드 또는 기재 기질에 커플링된 하나 이상, 바람직하게는 다수의 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드를 포함하는, 상기한 방법에 의해 형성된 분리 매질이다. 특정 실시태양에서, 금속 킬레이트 친화성 리간드는 세자리이다. 그후에, 그러한 분리 매질은 Cu(II), Zn(II), Ni(II), Ca(II), Co(II), Mg(II), Fe(III), Al(III), Ga(III), Sc(III) 등과 같은 적당한 금속 이온으로 하전될 수 있으며, 상기 "배경 기술" 단락에 개략된 바와 같은 IMAC의 공지된 원리에 따라 이용될 수 있다. 가장 바람직한 실시태양에서, Ni2+가 사용된다.
유리한 실시태양에서, 본 발명의 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드는 하기 화학식으로 정의되는 세자리 리간드이다.
<화학식>
-S-(CH2)n-CH(COOH)-N(CH2COO-)2
특정 실시태양에서, 기재 기질에 커플링된 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드를 포함하는 본 발명의 분리 매질은 하기 화학식으로 정의된다.
<화학식>
기재 기질-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2S-(CH2)n-CH(COOH)-N(CH2COO-)2Ni2+
여기서, n은 2-4의 정수이다. 한 실시태양에서, n=2이다. 이러한 상황에서, 기재 기질이 예를 들어, 입자 형태이면, 다수의 리간드가 상기한 바와 같이 각 입자에 커플링될 것임을 이해하여야 한다.
본 발명의 제3 면은 여러자리 금속 킬레이트 리간드의 제조에서, 바람직하게는 상기한 방법에서 출발 물질로서의 호모시스테인 티오락톤의 용도이다. 본 발명은 또한 여러자리 금속 킬레이트 리간드 제조에서의 호모시스테인 티오락톤과 같은 카르복시메틸화 스캐폴드의 용도를 포함한다. 가장 유리한 실시태양에서, 상기 용도는 위에 정의된 바와 같다. 상기한 바와 같이, 호모시스테인 티오락톤은 상업적으로 입수가능하다.
본 발명의 또다른 면은 금속 킬레이트 친화성 리간드, 또는 기재 기질에 커플링된 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드를 포함하는 분리 매질의 제조에 사용하기 위한, 바람직하게는 서면의 사용 설명서와 함께 고체 상태의 상기 스캐폴드를 포함하는, 상기 화학식 I에 의해 정의된 스캐폴드를 포함하는 키트이다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 방법을 수행하기에 적합한 액체 및(또는) 시약과 함께, 부분적으로 또는 완전히 유도체화된 스캐폴드와 같은 임의의 다른 형태의 스캐폴드를 포함한다. 특정 실시태양에서, 키트는 탈보호의 경우를 제외하고는, 사용 설명서와 함께 본 발명에 따라서 반응된 스캐폴드를 포함하며, 탈보호의 경우에는 염기 또는 산과 같은, 탈보호에 적합한 시약을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 매질로 충전된 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 컬럼은 예를 들면, 대규모 생산 또는 실험실 규모용의 또는 분석 목적에 적합한 임의의 크기를 가질 수 있다. 컬럼은 또한 분리 매질 및 임의로 제2 종류의 키트에 들어가는 액체와 배합되며, 그것은 또한 본 발명에 의해 이루어진다. 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 키트는 금속 이온, 예를 들면 Ni2+ 이온을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 분리 매질을 제공하고, 상기 매질을 적당한 금속 이온으로 하전시켜 킬레이트를 형성하고 상기 매질을 액체와 접촉시켜 그위에 표적 물질을 흡착시키는 것을 포함하는, 액체로부터 표적 물질을 분리하는 방법에 관한 것이다. 유리한 실시태양에서, 그 방법은 또한 분리 매질로부터 표적 화합물을 탈착시키는 액체를 첨가하여 분리 매질로부터 표적 물질을 용리시키는 단계를 더 포함한다. 한 실시태양에서, 용리는 pH 구배를 감소시키는 액체를 사용하거나 또는 이미다졸 농도를 증가시키는 구배를 적용함으로써 얻어진다. 상기 논의된 표적 물질을 분리하기 위한 크로마토그래피의 일반적인 원리는 이 분야에 공지되어 있으며 (예를 들면, Protein Purification-Principles, High resolution methods and Applications (J-C Jansson and L. Ryden l989 VCH Publishers)), 이 분야의 숙련자는 본 발명의 방법을 이용하는데 필요한 파라메터를 쉽게 이용할 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 스크리닝 및 최적화 목적을 위한 하나 이상의 다양한 금속 킬레이트 친화성 리간드를 형성하는 절차에 관한 것이다. 따라서, 이 절차에서 한자리를 갖고 있는 하나의 아암은 일정하게 유지될 수 있으며 다른 아암은 최 적 성능 면에서 선택된다. 숙련자는 예를 들면, 최적 형태를 확인하기 위해 상기 논의된 L1, L2, L3 및 L4 중의 하나 이상을 변화시킬 수 있으며, 이후에 일단 최적 형태가 확인되면 다른 것(들)을 변화시키면서 그것을 일정하게 유지함을 이해할 것이다. 따라서, 최적화 절차는 최적의 선택된 리간드를 포함하는 분리 매질을 제조하기 위한 수단을 제공한다.
도면의 상세한 설명
도 1은 본 발명에 따른 여러자리 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 리간드를 포함하는 분리 매질을 생산하는 일반적인 경로의 개략도를 제공한다. 제1 단계는 본 발명의 단계 (b), 즉 유도체화에 해당하며, 제2 단계는 유도체화된 스캐폴드를 개환시키는 가수분해이며, 마지막 단계는 그렇게 생산된 리간드를 기재 기질에 고정화, 즉 커플링하는 것이다. 상기한 바로부터 알 수 있는 바와 같이, 제2 단계는 유리하게는 개환 및 탈보호의 조합이다. 도 1에서, R은 수소이거나 또는 산 또는 염기 불안정성 보호기를 나타낸다.
도 2(a) 및 (b)는 본 발명에 따른 IMAC 분리 매질을 이용한, (His)6-테일을 가진 말토오스 결합 단백질 (MBP-His)의 정제를 예시한다. 더욱 상세하게는, 도 2(a)는 크로마토그램이며, 도 2(b)는 상기 크로마토그램의 구배 부분의 확대이다. 도 2에서, A280 ㎚에서의 곡선은 A로 표시되고, 용리 완충액의 백분율 (%)은 B로 표시되고 전도율은 C로 표시된다.
도 3은 MBP-His의 IMAC 정제로부터의 분획의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 분 획의 번호 매김은 도 2 크로마토그램에서와 같다.
도 4는 시험 크로마토그램을 나타내며, 여기서 UV 372 ㎚ = A, 전도율 = B, 주입 = C이다. 하기 실시예 5에 설명된 바와 같이, 이러한 원형의 니켈-결합능은 16 μmol Ni/㎖이고 금속 누설은 4%로 확인되었다.
도 5는 실시예 5에 설명된 바와 같이 본 발명에 따른 분리 매질 상에서 수행된 니켈 결합능 시험의 결과를 나타낸다. 더욱 상세하게는, X 축은 리간드 밀도를 나타내고, Y 축은 니켈 결합능을 나타낸다. 니켈 결합능이 리간드 밀도와 선형 비례 증가하고 기울기가 1에 가까운 것을 분명하게 알 수 있다.
실험 부분
다음 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며 첨부된 청구항에 의해 한정되는 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 본 출원에서 아래에 또는 그 밖에 제공된 모든 참조 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
실험
1H-NMR, 13C-NMR, CH-상관관계, APT 및 코지 스펙트럼을 기준물로서 TMS를 사용하여 브루커 300 MHz로 σ 스케일 (ppm)로 기록하였다. 모든 스펙트럼은 달리 명시하지 않으면 CDCl3으로 기록하였다. TLC는 머크 (Merck) 프리코트 실리카겔 F254 판을 사용하여 수행하였다. 닌하이드린 또는 Mo/Ce 혼합물을 사용하여 TLC 판 상의 점적을 가시화하였다. LC-MS 데이타는 휴렛 팩카드 1100 MSD 전기분사를 이 용하여 기록하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 정제는 머크 G-60 실리카겔을 이용하여 수행하였다.
실시예 1: N,N-비스(에틸-카르복시메틸 에스테르)+/-호모시스테인 티오락톤을 제공하기 위한 스캐폴드의 카르복시메틸화
250 ㎖ 둥근 바닥 건조 플라스크에서, D/L 호모시스테인 티오락톤 (4.5 g, 29.22 mmol)을 100 ㎖ DMF에 용해시켰다. 여기에 브로모-아세트산 에틸 에스테르 (9.76 g, 58.44 mmol, 6.48 ㎖), KI (4.850 g, 29.22 mmol) 및 NaHCO3 (14.727 g, 175 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반시켰다. 반응에 이어서 TLC (톨루엔:에틸 아세테이트 3:1) 및 LC-MS 데이타 분석을 실시하였다. 반응을 3.5시간 후에 완결하였다.
목적 생성물은 Rf=0.35 (톨루엔:에틸 아세테이트 3:1)를 가졌다. 용매를 증발시키고, 결과 고체를 CHCl3에 재용해시키고 H2O x 2로 추출하였다. 유기상을 최종적으로 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 증발시켰다. 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (톨루엔:에틸 아세테이트 3:1) 상에서 정제하였다. 수율: 7.636 g (26.422 mmol), 90%.
Figure 112005047409913-pct00003
실시예 2: N,N-비스(카르복시메틸)+/-호모시스테인을 제공하기 위한 가수분해 및 안정성 시험
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 N,N-비스(에틸 카르복시메틸 에스테르)+/-호모시스테인 티오락톤 (50 ㎎, 0.173 mmol)을 1 ㎖의 1M NaOH에 용해시켰다. 100 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에서, 반응 혼합물을 100분 동안 주위 온도에서 교반시켰다. LC-MS에 따라서 출발 물질이 보이지 않을 때까지 반응이 완결되도록 하였다.
안정성 시험: 완전한 가수분해 후에, 상기 반응 혼합물을 H2O을 사용하여 5 ㎖로 희석하였다. pH를 12.5로 조정하고 반응 혼합물을 교반시키며 50 ℃에서 가열하였다. 50 ㎕ 시료를 4시간 동안 1시간 간격으로 혼합물로부터 회수하였다. 그후에, 각 50 ㎕ 시료를 LC-MS 분석을 위해 1 ㎖ MeOH와 혼합하였다. 이 단계 후에, 반응 혼합물을 밤새 정치시키고 마지막으로 50 ㎕ 시료를 상기한 바와 같이 LC-MS 분석을 위해 회수하였다. 실험 중에 분해는 관찰되지 않았다. 조 생성물을 동결 건조하였다.
Figure 112005047409913-pct00004
실시예 3: AGE를 사용한, 실시예 2로부터 얻어진 생성물의 알릴화 아가로스로의 커플링
10 ㎖ 세파로스TM HP-알릴 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)(44 μmol/㎖ 겔)을 1 g NaOAc와 함께 20 ㎖ 증류수에서 교반시켰다. 지속적인 황색이 형성될 때까지 Br2 포화 수용액을 첨가하였다. 그후에, 황색이 사라질 때까지 포름산 나트륨을 첨가하였다. 그후에, 겔을 증류수로 세척하였다. N,N-비스(에틸 카르복시메틸 에스테르)+/-호모시스테인 티오락톤 (102 ㎎)을 2 ㎖ 1M NaOH에서 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 5 ㎖ 증류수 및 3 ㎖ 1M NaHCO3를 첨가하고, 2M NaOH를 사용하여 pH를 11.0까지 조정하였다.
그후에, 리간드 용액을 캡핑된 바이알 내의 드레인 겔에 첨가하였다. 바이알을 50 ℃에서 16시간 동안 진탕시키고, 겔을 유리 필터 깔대기 상에서 증류수로 세척하였다.
실시예 4: 본 발명에 따라 형성된 IMAC 분리 매질을 이용한, (His) 6 -테일을 가진 말토오스 결합 단백질 (MBP-His)의 정제 및 금속 누설 시험
재료 및 방법
MBP-His에 의한 추출
C-말단 헥사His-테일 말토오스 결합 단백질, MBP-His, 이론적 Mr 및 pI는 43 781 및 5.4였다.
MBP-His을 발현하는 이. 콜리 클론의 발효 및 세포 균질화는 표준 절차에 따라서 수행하였다. 이 추출물 내의 MBP-His의 농도는 약 1.9 ㎎/㎖로 평가되었다.
IMAC A-완충액:
1 리터의 경우: (물로 1000 ㎖까지 만든 1개의 PBS 정제는 10 mM Na-포스페이트, 140 mM NaCl 및 3 mM KCl, pH 7.4를 제공하도록 규정된다.) 2개의 PBS 정제를 물에 용해시키고, NaCl을 5M 원액으로부터 첨가하여 별도로 720 mM를 제공하고 (따라서, 최종적으로 140+140+720 mM = 1M), pH를 NaOH로 7.4로 조정하고 최종 부피를 1000 ㎖로 만들었다 (완충액은 또한 6 mM KCl을 함유한다).
용리 완충액 (IMAC B-완충액):
IMAC A-완충액과 동일한 방식으로 제조하였지만, 최종 pH 및 부피로 조정하기 전에 이미다졸을 500 mM까지 첨가하였다 (이미다졸-HCl의 2.0M 원액 (pH 7.4)으로부터).
Ni 2+ -술페이트 용액: 수중 100 mM. 필터 0.2 ㎛. pH = 4.6.
ExcelGelTM (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)의 설명서에 따른 시료 완충액 및 운전 조건.
겔: ExcelGelTM SDS, 구배 8-18%
시료 프렙: 시료를 2x 시료 완충액 (다량의 표적 단백질에 의한 정제를 위해) 또는 1 부피 시료 + 1/3 부피 4x 시료 완충액 (소량의 표적 단백질에 의한 정제를 위해)과 1+1 혼합하였다. (4x 시료 완충액 = 100 mM 트리스-HAc pH 7.5, 2% SDS). 95 ℃에서 3-5분 동안 가열.
시료 적용: IEF 시료 적용 단편 (5x10 ㎜ 필터지 단편, #80-1129-46 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 사용하였다. 30-32까지의 여과지 단 편을 짧은 쪽을 운전 방향을 향하도록 위치시켰다. 20 ㎕ 시료 혼합물을 각 단편에 적용하였다. 단편을 전체 전기영동 중에 겔 상에 두었다.
전기영동: 15 ℃ (순환 냉각조), 멀티포어TM II (MultiphorTM II)(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 장치에서. EPS 3500 전원 공급 장치. 제한 셋팅: 600 V, 50 mA, 30 W.
염색: 30% MeOH, 10% HAc에 용해된 0.1% 쿠마시블루 R 350 내에서 염색. 25% EtOH, 8% HAc에서 탈염색.
크로마토그래피: 매질을 HR 5/5 컬럼 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에 5 ㎝ = 1.0 ㎖ 층의 층 높이까지 충전시켰다. 매질을 사용하기 전에 Ni-술페이트 용액을 컬럼 (5 컬럼 부피) 상에 펌핑하고, 이어서 물을 펌핑하고 결합 완충액 (=5 mM 이미다졸 첨가된 IMAC A-완충액)으로 평형화하여 Ni2+로 하전시켰다. 용리 완충액을 적용하고, 다시 결합 완충액으로 평형화하여 단기 블랭크 운전을 수행하였다.
MBP-His, 1.0 M NaCl, 5 mM 이미다졸 및 1 mM PMSF (새로 첨가됨)를 가진 이. 콜리 추출물을 원심분리하고 0.45 ㎛ 여과하여 청징화하였다. 그후에, 필요한 부피를 IMAC 시작 직전에 0.2 ㎛ 필터를 통해 수퍼루프TM (SuperloopTM)(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에 도입하였다. 그후에, 3 ㎖를 컬럼에 적용하였다. 결합 완충액으로 광범위하게 세척한 후에, AKTATM 익스플로러 10 시스템 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 이용하여 20 ㎖ 선형 구배를 전개하였다 (40% 용리 완충액 = 200 mM 이미다졸까지). 마지막으로, 100% 용리 완충액 (500 mM 이미다졸)을 가진 5 ㎖ 푸쉬를 가하였다. 모든 단계는 1.0 ㎖/분으로 이루어졌다.
실시예 5: pH 4.0에서의 니켈 결합능 및 금속-누설의 확인
니켈 결합능
본 발명에 따른 분리 매질의 니켈 (Ni2+) 결합능을 UV/Vis DAD 검출기가 장치된 AKTATM 익스플로러 10 시스템 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 이용하여 크로마토그래피법으로 확인하였다. 시험을 N,N-비스(카르복시메틸)+/-호모시스테인을 이전의 설명에 따라서 커플링된 겔 상에서 수행하고 1 ㎖ HR5/5 컬럼에 충전시켰다 (도 4). 이 결과를 원소 분석 (질소 분석, 각 리간드는 하나의 질소 원자를 함유함)에 의해 확인된 겔 상에 존재하는 리간드 밀도와 비교하였다. 니켈 결합능과 리간드 밀도 사이의 상호관계는 매우 양호한 것으로 간주되었으며, 즉 하나의 리간드는 하나의 금속 이온을 갖고 있다. 일반적인 결과는 도 5에 나타내었다.
방법 설명
NiSO4 용액을 주입하여 Ni2+ 이온으로 겔을 부하하였다. 물 및 인산염 완충액 (20 mM PO4, 500 mM NaCl, pH 7.4)으로 세척하여 과량의 금속을 제거하였다. 겔 에 결합된 니켈 이온을, 매우 강한 킬레이터이며 겔로부터 금속 이온을 효율적으로 스트리핑하는 EDTA로 용리시켰다. 용리된 녹색 Ni-EDTA 착물의 피크 면적은 372 ㎚으로 측정되었다. Ni-EDTA의 농도가 다른 용액으로부터 선형 보정 곡선을 작성하고 정량화에 사용하였다. 니켈 결합능 (도 4, 피크 1)은 μmol Ni/㎖ 충전 겔로서 제공되었다.
금속 누설
리간드-니켈 착물의 안정성을 시험하기 위해 금속 누설 시험을 수행하였다. 그후에, 니켈-부하된 겔을 겔 상의 Ni-함량을 확인하기 전에 아세테이트 완충액, pH 4.0으로 세척하였다 (도 4).
금속 누설은 본 발명에 따라서 제조된 모든 시험 겔에 대해 매우 낮은 것으로 간주되었다; 누설은 일반적으로 4%였다.
방법 설명
니켈 이온의 누설은 니켈-결합능과 유사하게 시험하였다. 그러나, 니켈 이온을 EDTA로 용리시키기 전에, 겔을 10 컬럼 부피의 아세테이트 완충액, 100 mM, pH 4.0으로 세척하였다. 누설은 결합능 %로서 표시하였으며 다음 식: (면적피크2-면적피크1)/면적피크1에 따라 pH 4 (도 4, 피크 2)로 세척한 후에 용리된 양과 니켈 결합능 사이의 차로서 확인되었다.

Claims (27)

  1. (a) 하기 화학식 I에 의해 정의되는 하나 이상의 스캐폴드를 제공하는 단계
    <화학식 I>
    Figure 112011007750319-pct00005
    (상기 식에서, X1, X2 및 X3은 서로 독립적으로 sp2- 또는 sp3-혼성화 탄소 원자이고, X4는 친핵체이고, m은 1 또는 2의 정수임);
    (b) 상기 스캐폴드의 환식 구조를 유지하면서 스캐폴드의 친핵성 X4 기를 유도체화하여, 금속 킬레이트 관능기가 보호 또는 비보호된 형태인, 하나 이상의 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드 아암을 각 스캐폴드 상에 제공하는 단계;
    (c) 하나 이상의 금속 킬레이트 친화성 리간드 아암을 스캐폴드에 추가하는 시약을 첨가하여, 유도체화된 스캐폴드의 카르보닐과 황 사이의 결합에서 개환 반응시키는 단계; 및 단계 (b)에서 금속 킬레이트 관능기가 보호된 경우,
    (d) 단계 (b)에서 제공된 리간드 아암(들)의 관능기를 탈보호하는 단계
    를 포함하는, 하나 이상의 여러자리 금속 킬레이트 친화성 리간드의 형성 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 화학식 I에서, X4가 -NH2인 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 화학식 I에서, m이 1이고 스캐폴드가 호모시스테인 티오락톤인 방법.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 단계 (b)에서, 친전자성이고 따라서 화학식 I의 X4와 반응할 수 있는 한 부분 및 금속 킬레이트 친화성 리간드인 한 부분으로 이루어진 1종 이상의 유도체화제를 첨가함으로써 유도체화하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 2개의 상이하거나 동일한 금속 킬레이트 관능기를 포함하는 2종의 유도체화제를 첨가함으로써 유도체화하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 1종의 유도체화제가 할로겐화된 보호된 에스테르인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 1종의 유도체화제가 브로모-아세트산 에틸 에스테르인 방법.
  9. 제1항 또는 제3항에 있어서, 단계 (c)에서, 개환 반응이 염기를 첨가함으로써 제공되는 가수분해인 방법.
  10. 제1항 또는 제3항에 있어서, 금속 킬레이트 관능기가 단계 (b)에서 보호되며, 이후에 단계 (c) 및 단계 (d)가 본질적으로 동시에 수행되는 방법.
  11. 제1항 또는 제3항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 보다 사전에 수행하여 미리 유도체화된 스캐폴드를 제공하는 방법.
  12. 제1항 또는 제3항에 있어서, 단계 (d)로부터 얻어진 생성물이, 분리 매질을 제조하기 위해 그의 티올기를 통해 기재 기질에 커플링되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 티올기가 기재 기질의 알릴기에 커플링되는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 기재 기질을 알릴화하여 반응성 기를 제공하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 리간드의 티올기가 알릴 글리시딜 에테르 (AGE)의 알릴기를 통해 기재 기질에 커플링되는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 기재 기질의 반응성 기를 활성화하는 단계를 더 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 활성화가 브롬화에 의해 수행되는 방법.
  18. 삭제
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