HU230585B1 - Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók - Google Patents

Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók Download PDF

Info

Publication number
HU230585B1
HU230585B1 HU1200327A HUP1200327A HU230585B1 HU 230585 B1 HU230585 B1 HU 230585B1 HU 1200327 A HU1200327 A HU 1200327A HU P1200327 A HUP1200327 A HU P1200327A HU 230585 B1 HU230585 B1 HU 230585B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
group
branched
atoms
atom
metal ions
Prior art date
Application number
HU1200327A
Other languages
English (en)
Inventor
Poppe László dr.
Zoltán Boros
Vértessy Beáta dr.
Klaudia Kovács
Alexandra Tóth
Hornyánszky Gábor dr.
Nagy József dr.
Erdélyi Balázs dr.
dr. Bódai Viktória Erdélyiné
Sátorhelyi Péter dr.
Original Assignee
Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem
Fermentia Mikrobiológiai Kft.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Fermentia Mikrobiológiai Kft. filed Critical Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem
Priority to HU1200327A priority Critical patent/HU230585B1/hu
Priority to EP13734148.3A priority patent/EP2943501B1/en
Priority to PCT/HU2013/000050 priority patent/WO2013179072A1/en
Publication of HUP1200327A2 publication Critical patent/HUP1200327A2/hu
Publication of HU230585B1 publication Critical patent/HU230585B1/hu

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3265—Non-macromolecular compounds with an organic functional group containing a metal, e.g. a metal affinity ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Description

ismerő hogy a fehér jók elemi fontosságúak a modern biotechnológiában. A genotnok megismerése felgyorsította a gének klönnzását, a. fehérjék szerkezetének és ntnkeiójénak megismerését, A rekombináns féltene előállítási módszerek jeieofos fejlődése megkönnyítette termelésüket: szerkezeinket vágy funkciójukat azonban csak tiszta állapotaikban vizsgálhatjuk. Akár a '‘klasszikus'* (adott funkciójú fehérje izolálása és tisztítása a sajátságok, vjzsgálaiáhoay akár a foeöklassztkns’· (adott szerkezetű fébéfle előállítása és ezután szerepének ás szerkezeiének megismerése) megközelítés hatékony fehérje-tisztítási eljárások gyors kidolgozását igényli.
\ b 1 i en\ t, a > le v ,no 0 s - * w, m , \ e ' e k iflnraoss, R..R \ K ‘ ' > ' \ v e o» ' \ , ' \k \ In tínzymology, 2ÖÖ9;463, Academic Press], ezek közül az egyik általánosan használt a kromafográtía. A krematográfia előnyösen felhasználható a biotechnológia különböző területein történő alkalmazásra, így fehérjék tisztítázára is, mivel segítségével enyhe 'kfoumw.' ot om w en , emek \<\ s , w
A fehérjék elválasztására és tisztítására más kromatográfiás technikák, mini az, ioncserés tű t < b < t \t ο' n x. ' o< »\ t V s e t ö o ' \ol me n \ krotnatográda („hydrophobie miemeilon chromafogtophyA HfC) melleit a femkelát , íh í vn'i'.i „ ’ „ m 5 , v o» , \r ' m ·, ,,m rögzített fémion atíszotpciős kroourtográöa (.ámmoblbsetí metál ion adsotplion clufomatographyy IIMAC) különösen alkalmas, érzékeny és hatékony módszer a legtöbb fehérje és pnbpepiid elválasztására [Block, fiz et ab Methotís in Bnzymology, 2009;403:439-473],
Λ fehérjék rögzített fémion Natúré 197 5 ;2 5 8:599-5 99 ] selteseA s.lektor Aukfo sajao sznipetos , hogy in ϊ,, matograltfeanaK fém. ionnem-s'.
, V K '
Ma(.ö alapja pPoratb, j, amelyek vizes oldatban ' uu'tvfeu md,T. membe.
aIUn Írással rendelkeznek (pl, : Zez'_ Un A Nm és Uo'A hordozóhoz rögzítünk, ekkor ez igy nyert hordozó alkalmas tekerjék ferkefonáiásáza, Pímtosábban, az IMAC olyan hordozókat hasznék amelyek az átmeoettfem Ionokkal belátót képeznek. A kéláfot a kromafográria. során Irganrlként arra használják fel, hogy adott anyagot adszorbeáhon a folyadékból. Az IMAC folyamatban a kötés erősségét elsősorban a kelatkönzö Ügandum, a fémion minősége és a pH befolyásolják [Bloek, Ha et al. Metbods In Enzynrology, 2(iö9;4ő3 439-4731, A kelátképzés miatt a femiönok erősen kötődnek a mátrixhoz, ennek megfelelően az abszorbeált protein vagy pohpepdd a pH csökkentesére! vagy kompéntrv elócióval. etnálható. Általában' az IMAC-ot fehérjék vagy egyen, a mátrixbeh átmenetifémhez valamilyen afoinitást mutató molekulák elválasztására használják. A fehérjék a felszínükön hozzáférhető, a fémkelátokhoz affinitással rendelkező hisztidinen, m v\ m s ϊ pto, mo ct-.\ m \\ mv > <\n \\ \ > ιΛ esetében azonban a kötődés módja nem pontosan Ismert, számos tényező befolyásolhatja mint például a. felszínen megtalálható kordinámőra. képes oldailáneok szárna, minősége, e * x !m ' tf Of o van « s , I > » , <x $ rehe cm e gk n mely fehérje képes kötődni és milyen erősséggel.
gmomru ke átképzőket már használtak Ugandámnak IMAC-bnn, például az immodieeetsavat (IDA), Fehérjék és peptidek rögzítésére használatos és kereskedelmi forgalomban is kopható az irmnodleeetsav agarözhoz kötött különböző femekkel (íkAp Zofo hfofo keléit komplexe, interferon tisztítására használtak fétmkeláló gyantákat [ü'S Pat.4,551.271 (kfoehuh, E,, et al; Hofhnann-ha. Roehejj, amelyek ÍDA-ffigandokaí is tartalmaztak, A gyanta a következő formtUávai Írható le; jagarőz]-Öd3Bfo514(014)4%Nt(lH.jCÖOÁrM?'\ ahol a M jelentése nikkel vagy réz, Az IMAC elvű fehérje elválasztások során a nitrilodrteeetsav (NTA) keiátort tanáéin t ό noetc.- ed ma boulo ok
Hdochuií, kg et ah Bfoteehnefogy, 1988;6:1321-1325 és * x Ad 4,8'? 28 Έ .Ao'mh A
Hoehuli, E; Hofthumn-La Roehet] és NP* vagy Co'' imm-nok alka masam a legekerfediabb, ahol a mátrix pontosabban a kővetkező általános képlettel írható le: [hordozöl-kötőefemWH-íCHrjsí-CidtCOOlíl-bkCHsCOfe-jkbiE^' (x-2 vagy 4).
Az IMAC elvű. fehérje elválasztásokra belátóiként a trlsz(katböximetll)eriléndlarmn (TED) is működőképesnek, bizonyult. [Porath, T; Ohn, B, Bloehemistry, 1983:22:1620 1630]. Újabb eljárások összetettebb, tri- és íeiradeotát hgandomokat, illetve akár azok eiegyét tartalmazó IMAC hordozók előállítását ia leírják [US Fát, 6,623,655 (KApoel, W.
ii,: et al.; Sfema-Ajdrich); US Fát. 7,005,071 (Attdersson, L, X; et al..; Amenharn Béea-eeees):. US fez 7,209,512 (Kappch Ά. K,: gí al; Sígma-Á.idrfeh)j. Az ÍMAU afepu fehérje xaegkOtes ehet, tehát a HXtsz fehérje ex a tOgzdeP fetfeon kefeörh XfeAfehafez az U derén mutatjuk be:
XX h-NH ι-ρο 0' X .5Xfe
NXÍ5A .X)
X X :
Χχ ..-'X •••X.
·· X.-·· xs.-· X
Λ.
XX zrxrgö
T
XX
X X ‘‘5
Zfe
7 O.
X zx
Xí ,-Op
ZZ
Ú \ X X Xe X-···'·· 'fe7 í;
,x~ Z '-•9H '% 0- fe 5. A, G. ··.·'. S. 5 X öiöafíáncai z1. áhf a Λ Bisasg Zhihii: és ;s rPgxksö fea<;s', köZé; kolezshaüs ;«r IM-aC Χ·;Ζ;ΖΧκ
1, Úkktzsr í;sss>í;í:·: HU Oi? {s<gyb«up SH-naxsssv UVrekkV
Szekvencia His tag betrecorea XXkios
R R R R R H R; US Pv. 4,5 S-pVt
R.RH RHRHR. R.: f5t5k-ráSysSí:«
R R R R R R R R R R R;.- jjQÍ>TáSysfe.í«.-S, -6
R R ki Q k! Q R Q R Q R Q (H Qp Vhjí. g.xpí. OrVsi
R. X R N R N R N R X R X (Η X ·:. US PaG.G-R-.G
H G ki G R G R G Η G R Q (H G/Qp. P;»í. k.,:p<. IBR RíBp S:5SS-4Öó
R H Q Η H A R H G (HHXB pj»í. Pkpí. Piwíí restre spsímöo
K D R 1.. i Η ρ; V R K E R A Η A Η X K HA k US p.ü 'R 76,298
dl R / (HXp US Pv SASBA 5
R X' R II R X? IP ΪΗΧΗρΙΙ. US Rr Apyi. ZPO4/OPSS7S1
:'X ;-0v:< D, E, P..',. G, V, S. I., i ás T;
PV AGí ·'-., R, \, B. Q, U, I. í, V. R \ T, V-, V; Rhe; Λ, R.X, B, C, Q, B, G R i, K. M, P; S, T, V, ιΑ .molekuláris biológia kifejlődött módszereinek segítségével a fehérjék ma mar könnyen eíiétbaidok egy vagy több hlszödim iartabnázó feziős: affinitás szakaszokkal (oligohbztidin jel, His-tag) (1, láblázat), így növelhető az affinitásuk a rögzített BnP.nrehore Hgeudokbc. l'nasA keresőre a.· ffil\C ,t. utóbbi Gebén vgue fontosabb szerepet tölt be a fehérjék tisztításában, A iéheríék IMAC é-lvít tisztításának mára k\„ tG\R'Rt? í '? a ASksp.j i o> o tou\ ' u. e,\ >- „»o o<<’'re ι i. szekvenciát -tartalmazó fúziós jelöléssel ellátott rekombináns fehérjék, tisztítása vált [lásd: US Pat. 4,569,794 ffinűth M. C, Pidgcon, CG E!i~LíLÍy)j, A fúziós oLtgöhbztídín szakaszok rögzített fémiont tartalntazö IMAC hordozókon történő kötődésének egy lehetséges -modellje- szerint a fém-ion. kölcsönhatásba lép- a- His-tag egy hisztldi-n oldalláneávat és egy, az előzőtől két amitiosav távolságra (n - ns-ffi megtalálható másikkal. Ezt támasztja alá az a tény, hogy az IMAC hordozókra rögzített fémionok meg tudnak kötni olyan His-tag szekvenciákat, amelyek egyrészt konszekutív módon, másrészt pedig alternáló módon tartalmaznak hiaztidint (1. táblázat). Mivel a konszekutív Hísúogek tk , t! ’ t> ο» v \ X \ re’ Ή oh im tno ' ‘ ,ore ffi, > I i '' ' egreukre tta Ή okikon re, ntret példáét a? η η· I, n - íred. n - ov4, stb.
Az összetettebb-oli.góhisztidin jelölésekre példa [US Lat, 5,.594,115 (Sharmá, S. K,; s v'e ’< ffi \re \ tét n ere 're reo > s v v ' W
X)n jelentése egy fémiotrekeláló pepiid ffiffi - 6, ahol- bánoelyik X lehet Asp, Pro. öld, Alá, öly, Va-I, Ser, Lett, He. vagy Thr)> » cékpoüpeptid, IV hidrogén vagy további arereosav egységek.
Ex a Kmiom-kclálo saláiságoiAK bíró oligohisxtldin jelölés (llls-tag) tesxi lehetővé a taxiós Icbcnék tisztítását [US Unt, 4A67/7Ö4 (Srmth M, C, lódgenn, Cg FIMAlly)], Ax Így jelölt föziős fehérje elválasztható szennyezőitől olyan módom hogy egy 1M.AC hoMoxöhox rögzített fémet tartalmazó oszlopon -engedjük át. A HisAag fúziós fehérje kóláivá a rögzített fémiont a hordozóhoz kötődik, mig a fémionokhoz affinitással nem » ’ o w r,\'\ \s - ww, t ' \''c t kmv meme\ vesse , jellemzően a pH csökkentésével, versengő hgandomokkal. (pl, ínudazol) vagy versengő kelátorokkai (pl. EDTA) a His-tag fúziós tehene lemosható az oszlopról ős a lemosott Oldatból tiszta állapotban kinyerhető,
A. különböző fémionokat megkötő keiátorokat ax IMAC alkalmazások, során legjellemzőbb módon agaróz hordozóhoz kötik (US Pat. 4,551,271 (Kockák, E.. et ah Hotlrnann-La Kochep US Pat. n,623,655 (Kapnék W, Ka et ah; Sigma-Aldrlch); US Pat, 7,1)05.,071 (Anderssom L. Cg et al; A.metsham Bioscienecs); US Pál, 7,709,612 (Képpel W, Kg et ál; Slgtna-Aldrlchlj, A természetes poliszaehand alapé hordozók előnye, hogy megfelelő belátótokkal fenkeionalixálva jellemző módon nagy kapacitású (MAC hmde-oké eredőiem essek, bnrmmié osenAm, Kje csak speesahs kérőimmé*.,' hoo'O uh elit,nőnk pmohalmnen sekké alatt, (bhadelham kn'zmaoa'Uoi vedsu, rngeoecacmmk vsak néhány ciklus emlőig, korlátozottan oldható meg ős nyomásúilősági, mechanikai tulajdonságaik is korlátozottak. Ennek megfelelően mind a mai napig igény van mind a eo m m un <| , s om \ s. 'vkoví h Ιο,,^ι* ált' a,\a ea,a\e veri ára.
Λ találmány célja A a SviKnamS. alapja
A találmány célja, tehát, ax eddig ismertnél nagyobb stabilitású ős szelektívebb IMAC 'eme km nem
A szakirodalom ártanulmányozúsakor figyelmünk a szilikagől'-hordezék félé fordult, Ismert ugyanis, hogy a kromatográfiás elválasztások során előnyösen alkalmaznak szili kagő!-alapú hordozókat ÍEncvcIópediá of Chromaiography tárd Ed,)s CRC Press, 29991, A félsxincn módosított sxihkagéi alapú fázisok előnyös tulajdonsága, hogy mechanikailag erősek ős nagyhatékonyságú elválasztásokat tesznek lehetővé [Majom,
HTb UCGC 1997:15( 11 ):1908-10 IS], További előnyös sajátságuk, hogy száraz állanotban bosszú Ideig tárolhatőak, oldószerekkel érintkezve nem duzzadnák és nagyobb nyomásokon is alkalmazhatóak alakváltozás nélkül. Ezen előnyös tulajdonságok miatt többféle szdikegéi alapú 1MAC hordozót is .leírtak, [Ánspaoh, F. B. Journal of Chromatőgraphy A 1994:072(1-2): 35-49 vagy US Pat, 4,835,269 (Kaboveo, Jg Fórseh, B.; Ueskosloveoska akadémia)],
Ismert az Is, hogy minlotrieeetsav (MTA) kelátor rtartalmű sziláénál módosított szilikagéi alapé (MAC hordozók fémionokkal komplexáhrt alkalmasak voltak His-tag fehérjék megkötésére és elválasztására [US Pál, 7,112,552 (blmpsou, 0 Tg et áh; Promegs Corp); US Fal, 7,304,015 (Simpson. D Jg et ab: Frornegn Corp); US Pat, 7,304,019 (Slmpson, D Jg et alg Promega Uorp); US Fai, 7,354,750 (Simpson, D .h; et ab; Promegs Corp'p WO a' m ' v m e'po f' ' Pem' te ’ \ m' en non a n g' i felsorolt megoldások osak a belátott tartalmazó résszel módosították a szervetlen hordozó, jellemzően porozna szilikagéi iéiazrnét.
eníos kiemelnünk bogs mosni a a a ' U tábla \d pokla! o a\ mem o'.tenk, a UJoio pq'Ud általában aífemálö, kot aminosav távoiságrá (n * nőd) megtalálható His egységeket tartalmaz. Ebből következik, hogy ha a femeket rögzítő kelátor egységek a hordozó felszínén szakái vezeti módon, egymástól adott távolságra helyezkednek el, akkor többszörös keláeiö » és Igy a His-tag fehérje erősebb és/vagy specifikusabb kötődése valósulhat meg. Egy olyan eljárás, amelyben mezopömsos szlllkagél felszínét parammoetenurtuomtems okm es temMnu'etóx.\?üan különböze mán. u keverékével módosították, maid az ámmoesöpótmkhoz tluoreszkáiö csoportokat kötöttek megmutatta, hogy a hgand'kötö szilán és a llgandot nem kötő szilán arányának változtatásával a nhbagel CE me s. abaón '<ii{ hgsmkseruOxgel e\ nneUaggal modosuham (Enne' P; et ab Lnngmuir, 2öó8;24( 16):9030-9037),
Ugyanakkor ismert fény az Is, hogy a szdlkagél alapit úgynevezett fordítód fázisú hordozók esetén a fázis pBmfahilhása korlátozott, jellemzően 2~8 pH érték közötti. A. szihkagélhez kötött fázis a savas körülményekre kevésbé érzékeny, osak pH::::2 alatt válik mdröllzisre érzékennyé jUaghánó Tr,, Ng et al. Journal of Chromatography 1988:443; 155-1?2j, m|g pfl-k télért a ludrovid Ionok megtámadjak és feloldják a \ i( csen . tat <ü o\e , λ'. U'm».. »t I »tn of
Uhronnaogmnby. A IPP5;ö9í:3 19Amennyiben a felszín módosítása során szilából csoportok maradnak szabadon, bázikus csoportokat tartalmazó anyagok kötődhetnek a felszínhez,, ami a szelektivitás romlásához vezet [Nawroekk 1. Journal ot Chromatography, A 1997;??9:29--711. A felszín szobádon maradó részelnek organoszilánokkai történő módosítása, az úgynevezett Andcspptng” nagy stabilitású, pbfedlA értékig ellenálló hordozókat eredményeztek [Neue» Ü.D.; et ah, American Laboratory 1999:31(22):36-39: Cheng, Y, F.t atal. LCGC 2000; 18(11):1162-1172}.
A fentieket végiggondolva azt ismertük fel - és ez találmányunk alapja hogy ellentétben az eddig előállítod LMAC hordozókkal, ahol csak a ligand-kőtő csoportok kialakítása volt a fő szempont, a fenti két ólőny Ötvözhető az olyan IMAC hordozók eksühtasoah adun a femkelalo hgandnnmk kmosete alkalmas csoportok mellett a fe Aom más, kóládéra nem képes, inért csoportokkal módosítjuk. Ezen a módon olyan (MAC > m e sv mű s o, ' \e> e m \ - meportok ino * ό !· ' ugyanakkor a felszín további részének inért csoportokkal történő módosítása csökkenti az. aspecrdkns kötődést és növeli a hordozó stabilitását.
Az IMAC alapú iehérj©megkötés és: elválasztások során eddig liheg a Ni2' vagy UcA fémionokat használták (lásd: US hat. 4,877,83(: (Döbeli, lk: Hoehuli, E; Hofémann-La ámenéi IMock. 11 , >‘t d Meféerl·' m 1 ?οά\ΆΑ gpt.a n Umdfeu mh.an esetben további fémionok alkalmazását is említik (lásd például· US Fát. 6,623,651; (Kappei, et ah; SigíAa-Aldrich}: ahol a fémionban a fém Nk Hg, Ga, Cm fen, Co, Cd, Mg, M«, Ti, ín, 2n, Te, feh, Pd, Re, Pe, Au, Pb és Bi lehet, de előnyösen Fe, Cu, Go, An és Ni; vagy US Pét, 7,709,612 (K.appek et al: Stgma-Aldrieh): ahol a fémionban a fém (la és Fe tem* \ »>\ s v m, ' o\ ' j f c m Vtovuv Γόο?\ο' '
ViPet mn ,j ,em ( í. Fa V *a U* \b.mc \ , v? .A Pmemuoes'm< > \ 1 \ kcG.oí alapú IMAC hordozok alkalmazhatóságának leírásakor az elvi leírásban Pe-'*» Cn2', Go2F Mi2', ZsY Ceafe Mg2', CaA Ga2F CA ínA Lem AzA ScA A. YIFF nPF t.Á, AgF AU* és Cu ionokat nevesltenek és bár tó-igénypontban fémiont általában említenek (ΜγΑ ahol m:: l-ö), azonban, az ahgénypontban fémként csak a Ni, Cu, Co, Pe, Ztt és Ga használatát nevesítik (US Pat. 7,112,552 (Simpson, D 1.; et ab; Promega Corp): US Fát., Ffé-kdl ASnups<m PA , emd Emmegut ouo, t'\ Pat 2Ά An «simp^m fél mai.
Promega Corp)],
Ki kell emelnünk, hogy 1MAC alapú féherjemegkötes és oiválesztások során a legelterjedtebben alkalmazott fémionok használata során komoly hátrány, hogy a NF* és CrF* íonúk nagyobb mennyiségben karcinogén és toxikus hatásúak. Á ttlkkobaeetát például az (EC) No. 1272/2008 lEU-CHS/CLPI szabvány szethtt rákot okozhat (karcinogén hatású lehet); lenyelve ártalmas; bőrrel érintkezve tálérzékenységet okozhat í szeneiéi Lizáié hatásé lehet), valamint akut és krónikus vízi tmdcitásű. Hasonló
Ο \ ς ( I l <. > tj' \ \ \ v ' O\ szerint; beiclegezvc rákot okozhat (karcinogén hatású lehetr; a tögamzéképességei vagy nomzúképességet (ieriilitást) károsnhada: maradandó egészségkárosodást okozhat; belélegezve és bérrel érintkezve ráfér. ekenységeí okozhat (szénáiéi lizálé hatású lehet); valamint nagyon mérgező a vízi szervezetekre és a vízi környezetben hosszén tartó k á rosodást okozhat.
Kísérleteink során az alábbi sémával leírható reakciókat alkalmaztuk;
2, ábra
A szubsztltueasek (RE R.2 és a többiek) jelentését Z· kivételével (amely alkoxicsoport vagy halogén) leírásunk bevezető részében dethnáltuk.
Találmányi felismerésünk, tehát, abban áll, hogy a férni reakciósok alkalmazásával, a felszínre kötött, fémionok megkötésére alkalmas ligandmnok távolságának szabályzásával és a szilárd felszín további hányadának inért csoportokkal történő védésével olyan új llvlAC .hordozókat nyerhetünk, melyek fémionokkal alkotott komplexei az új 1M.A.C hordozók megnövekedett Szelektivitása és stabilitása -révén különösen alkalmasak megfelelő aféimtásssl rendelkező fehérjék szelektív megkötésére és el választására: ügy -találtuk, hogy az IMáC alapú fehérje-megkötésben eddig nem vizsgáit kmtamda» Ionok fblbaszn sa\e különös előnyökkel jár, mivel a lantareda ionok magasabb knotdlnáelős képessége a szokásosnál nagyobb kapacitású és/vagy szelektivitásé 1MAC hordozok előállítását teszi lehetővé. Az új lanlanida-ion alapé 1MAC hordozók további előnyös vonása, hogy a fehérje termékben szennyezőként óhatatlanul megjelenő lantanidaúonok toxíeitása a szokásos fémionokhoz képest jóval mérsékeltebb, továbbá megfelelő lantanida ión-komplexeken- a fehérje megkötés és/vagy ei-éeló érzékenyen ayomonkövethető a komplex optikai tulajdonságainak, változásával.
Á korábban ritka földfemeknek nevezett lantalnda fémek [La, Ce, Pr, Nd, Prn, Sm, Ea, Oá, Th, Dyy Ho, Et, Tm, Yb, l,u: melyek nevükét a sorozat első eleméről a lantánrói (La) kapták] további előnye, hogy nevükkel ellentétben á földkéregben egyáltalán nem ritkák.
átlagos -előfordulási gyakoriságuk a merne* kivételével összemérhető az olyan életfentossfe kobalt [Palasz, A; Czekáj, P, Aeta Blochim lántanldák eiektropozitív fémek, stabil vegyül <' e e, ! oo mo eam ' proménam (Pr) e - x < m >' ,, < szelén vagy a e Ό o e \ o A « ' 107-01 14], A οΛ \Oikí ·> ' viuk általában -fe.
csak -Ce, Tb és z -v-4, míg m* iőa számmal stabil.
vegyületeket, Vegyüfeíeikben koordinációs szántok hatnál nagyobb, általában 8-0, A lamanltlák a bfeszférában rohan totóiénak efe es bivlvgiaibg aktív vágyálmok részéként nem Ismertek, Más nem létfontosságú elemekhez viszonyítva a nem radioaktív lantanidák foxielíáss. alaesonyabb [Pa; asz, A: Czekaj, P. Aeta Bloobimiea Polonica, 2010;47(4):1107-1114] és hasonlóan alacsony ökológiai hatásokkal [Tat, Pa et ab, Cbemospbore, 7010:80(9): 1:0.3 1-1035} rendelkeznek, A lantanidák -vegyőletei gyakran rendelkeznek különleges mágneses, katalitikus vagy optikai sajátságokkal, ezért iparilag széles körben alkairnazöttak és viszonylag efesők.
Az a módszer, amely EDTA-alapd kóláié ligandummal feiüietmódosított szilika részecskék Tb-komplézeit alkalmazza dipikolinsav (DPÁ) lummeszeens detektálására jWeter, W, T: et al, Journal öf American Chemical Soeiely, 7007:120:9852-9353: Taylor lg. k , c A ,'<'·) <t \t ic>i(ls, g 1 c s e5 ‘1 ! m ί mn lm >s a megfelelő Ugandámmal módosított hordozó latoanidákkai alkotott komplexei alkalmasak. az oldatból komplexképzessel más molekulákat megkötni,. Pontos kiemelni, hogy annak vllenére, hogy I MAC-hordozók egyes lantanida-louokkai alkotod « i ' > n ek re \<\ \? o x te \ ka u \\o\ . ό e \ ·. \\ m e , t felvetették (OS Pat. ?,i 12,552 (Símpson, D J.t et ab; Promega Corp); US Fan 7,304/)15 (Simpsou, D J,; et al; Fromega Com)], de az irodalom nem közöl olyan példát vagy konkrét adatot, ahol IMAC-hordözők egyes lántanida ionokkal alkotott komplexeit •fehérjék megkötésére tény legesen alkalmazták volna.
Megállapítható, tehát, hogy a fémionokat komplexáhti képes megfelelő Ugandnmok ' '\rnek t eV c ο ο V v xue< < <, m e 0 o, xtt tartalmazó változatai különösen előnyős módón alkalmazhatóak lekérjek megkötésére és eh na·. w^tí,», rnnl .. k.atau>0 '<> k a '.rekavamn a'.kahn.umt \« ' mnetmat jóval kevésbé toxíkesak, igy nyomnyi jelenlétük a tisztított föbérlókben a szokásos módszerekkel nyerteknél jóval kisebb kockázatot jelent, valamint a komplexek optikai talaldonságainak előnyös változása különösen alkalmas a fehérje megkötés és/vagy eláelő érzékeny nyomon követésére.
Megállapítható az Is. hogy olyan IMAC hordozók előállításával, ahol a fémkeiáló Ugandütnok kötésére alkalmas csoportok mellett a. felszínt más, kelaelóra nem képes inért csoportúkkal módosítjuk, olyan IMAC hordozok nyerhetöek, ahol a keláciőta képes csoportok távolsága szabályozható, ugyanakkor a felszín további részének inért csoportokkal történő módosítása csökkenti az «specifikus kötődést ás növeli a hordozó , jv\ \ Ό. 1„V? m.xov^ vU/U <mn ueo ·,\o * '. d i'ww t
IMAC hordozók és a lantanioa-ion alapú IMA.C hordozó alkalmazásainak előnyei kihasználhatóak külön--külön vagy együttesen..
A találmány részletes leírása
A találmány tárgya, tehát, fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas, az alábbi (ííj általános szerkezedet jellemezhető hordozók lantanida fémionokkal (M”U alkotott kompi ezek
HORDOZÓ
Μ1(ΚόΑ,-ΑΑΧΜΙ·0[Νΐαΐ12ΑΟΟΗ)υΡρΟΗ3ΐ:!Μΐ€Ι·υ€(Χ)Η)Αχ (11) • rSHR·--R \h-.
ahol (E jelentőse 1-8 szcnakanszámá, egyenes vagy eiágazö láncú alkn csoport; vagy 2 A szénatemszámú, egyenes vagy elágazó láncú aikenil vagy alkiníl csoport.; vagy 6-8 szénatomszámú arü, aralkil vagy cikl.oalk.il csoport; vagy alkotó csoport,
IV jelentőse 1-8 szénatomszámú, egyenes vagy elágazó láncú aikll csoport; vagy 2*8 szénatemszátpú, egyenes vagy elágazó láncú alketoí vagy ábúnll csoport; vagy 6-8 szénatomszámú aril, aralkil vagy cikloalkll csoport; vagy aikoxl csoport, lejelentése olyan .nem reaktív csoport., amely 2-30 egymással kovalens kapcsolatban álló vetevg t ve; u ioné'' v l<n tlao k< ''οο^^,ν <όο'1 alvooAmeeev elágazó vagy gyúrás szerkezetei tartalmaz,
A jelentése olyan atom vagy atomcsoport, amely nem-kötő elektronpárt tartalmaz, ,\, V O,
L jelentése a Sí-atomot és az A részeket összekötő 2-22 egymással kovalens kapcsolatban álló szén, oxigén, kén vagy nitrogén atom által alkotott egyenes, elágazó vagy gyúrüs v eve v J ' . almazó egység, x jelentése egy szám és (1,05 ,>x> 0,90, m jelentése egy egész szám és m ::: 6,1. vagy 2,
M jelentése lantanida lem, a La, Ce, Nd, F.m, Snt, Ett, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, ¥b? La vcgyjelűek közöl és n jelentése egy egész szám és n::: 2, 3 vagy 4.
A I' ; n ' ' mh <v i » te n öeb η η n s , cm » \i e χ n r a h ot E \ felhasználása olyan oligopeptidek vagy fehérjék megkötésére, melyek legalább 3 hisztidint magukba foglaló, 5-12 aminosav hosszúságú affinitás szakaszokat tartalmaznak.
.A találmány a lantanida fémionokkal komplexált hordozók felhasználására is vonatkozik olyan oligopeptidek vagy fehérjék megkötésére, melyek legalább 3 hlszt.id.ml magukba t k ' \nn;o ' hov a g ' r kn Ή ulm t\ mar min; nem az oligopeptidek vagy fehérjék kötésállapot változását optikai változással követjük,
A találmány egy előnyös változata érteimében: a lantanida fémionokkal komplexéit
Vv < k ee m vmo po »>ov ' v -- m o>>\ 1 , rlmt > t » \ m ? a v v Ja erei ' et'vvm't ; v x , n ' m o m < n v aen\* 1 Ví'it't közötti, vagy olyan szálas hordozót, melynek átmérőié lök -- 20(10 mm a melyoek Iái lapos íéiüleie 10 - 2000 nk g': és amelyek anyaga porózus vagy szálas öves, alomioittm'oxid, díárndmxld illetve egyéb tiszta vagy keverék fémoxid vagy reaktiv esoportokat tartalmazó természetes vagy szintetikus polimer.
A találmányt az alábbi példák segítségével mutatlak be részletemen, anélkül, hogy találmányunk oltalmi köret a megadott példákra korlátoznánk:
A iélűletmödositást áz irodalomban szilíkágél egykompónenső ótgauösziiáookkal történő \ cm, \a a e o. nwrt 1 s Λη ΑΧ'*' 'oA % 'a ' v · o\ v domama végeztük. Ezeknek megiélelően gziiikagéh (10 gt szemeseméreu 4ÍEÖ3 gm; Erjlagos télolet népi adtanl, ' atmmpn'pdutatén'\isr0an ml '1 'nana, \(o g) tartalmú metanolhoz (ö5%; 100 rnl), majd a szuszpeaziöt lob órán keresztül szobahőmérsékleten rázaUuk. A terméket leszűrtök és metanollal mostok (1A1ÖÖ rnl), szárítottuk, szobahőmérsékleten tároltak.
El ont analízis: C: 1JÖSAN: 1,1234 H: 1,43%
2. példa % ! o< gá xum a ’ ' \ n a odo-nn <0 ' < n 'x'j\ 'A aminoetil«mnmrtpr<Íp'd'tnnaeto\lrzllna 12,0 mik Elemanalízis: <'; 4,02% N: 2,40% II: 1,83% oolda
Az 1, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szitán komponens 3423minoeiilarnmotpiopii?neÍÍidirnetosiszilán <2,0 rnl),
Elemanalízis: €: 3,22% N; 1,7454 H: 1,71%
4. példa
Az 1. példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilán komponens 3aminopropiltrimetoxiszllán / feniiirimeioxiszilán 3/1 arányé keveréke (2,0 ml), Elemanalízis; C; 0,37% N; 0,57% 14: 1,48% $, példa
Az E példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilán kmnpo.ne.na 3-(2aminnetdamlnolpröpthtimetoxiszdán / íénthrknelOXÍszUán 3/1 arányé 'keveréke (2,0 ml). Elem analízis; C: 6,26% N: 0,95% H: :,5%¾
Az 1. példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilán komponens 2-(2amtnoetilamh'máptopdrnedldimétnxlszilán / íéniimimetoxisziián 2/1 arányú keveréke (221 ml).
Elemanaíizis: C: SA6% N: 0,75% H; 1,48%:
7. példa
Az I, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilán komponens 2aíólnopropillrhóeíöxiszlián / metiltrimetoxiszilán 2/1 arányé keveréké (2,0 mi). Elemanaíizis: C; 1,56% M: 0,4956 12; 1,27%
S, példa
Az 1, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilán komponens 2-(2se'nőén a fi\''p oo hu nea<\is.! an mén o m de ' ava χοόόΙο. > óm;
, ,} < ' : \ o t í x
9. példa
Az 1, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilán komponens 2-(2aminoetdaminoipropilmetildímetoxiszlián / medlaímetoxlszilán 3/í arányú keveréke (2,0 ml),
Elemanaíizis: C: 2,5194%; 0,77% IP 1,44%
10, példa
EDTA-dlanhidridet (200 mg; 1,17 mmol) oldottunk inért körülmények között (argon atmoszféra) vízmentes El,N-dímetiiférmamidban t'DMF; 5,5 mi; 71,2 mmol; 5,2 g), maid hozzáadnánk AhN-dhzopropdehlanhnt íDiEA; 6 n/n% DME-ra; 750 p.k 4,31 mmol; 557 mg) és az 1, példa szerint előállított amin-Emkelős csoportot tartalmazó szilikagél'-aiapu hmdozot %,%> ek % ehgxt %%%'n I mán at hm ejtettük, m,ed devtdkdt nM (21 ni ' Od elvna-eo* ,e 1 It; vámomé t>he \on ni <><;m,o adtaid he. ez, Evabla t <n , gt) A;-os kevertetés titán az Hegyeket leszűrtük. majd a szaron mostak DMF-dal k%5 ml), %
desztillált vízzel (2 *5 ml), leírton n,álrturp-b.ídfogérpkarbonát oldattal (2-5 míg desztillált vízzel (2x2,5 ml), majd vízmentes «tanoda! (2-% ml). A terméket vákuum-exszikkáínrEau. iőszíőrtpenéoxid teleti szárítottuk és tároltuk.
Elemanalizís: C; 6,66% N: 2,08% % 1,221%
11.. példa
A ' ρ l<1' n m n s < I ív. -> I k> ' ' v .rt \ e m előállított arnin funkciós csoportot tartalmazó szílikagél-alapú hordozó (1.00 g). Elemanaiízis: 62 Kk0ő% N: 3,56% Eh 2%?%
12, példa ,6 10.. példa szerinti leírás azzal módosítva, hogy a szilika komponens a 3. példa szerint előállított amin funkciós csoportot tattal mázó szllikagél-alapű hordozó (I ,00 gf Elemanaiízis: €;. 3,48% Ni 2,746-¾ H: 2,20%
1,3. példa
A 1% példa szerinti lénia azzal módosítva, hogy a szilika komponens a 4. példa szermi » ej 1 u> lm w , , \ ' > j v \ d \ dq\, < , m >
Elemanaiízis: <2 8,59% 22 1,12% Π: 1,705¾
A 10. példa szerinti leírás azzal módosítva, hogy a szilika komponens az 5. példa szerint előállítón amin fdnkeiős csoportot tartalmazó szí lík apói-alapéi hordozó (1,00 gr Elemanaiízis: C: 9,6654%: 1,47% ki: 1,90%
A 166 példa szerinti leírás azzal módosítva, hogy a szilika komponens a 6. példa szerint cio.dlhon amm funkció.'csoportot mrtalm.a,% sxirtkaeekdapu k.orduze i l.ov g) Elemanaiízis; C: 8,10% M; 1.45% 11; 1,80% lő, példa
A 19. példa szerinti leírás azzal módnshvn, hogy a szikká komponens a 7, példa szerint előállítóit amin. hmkelős csoportot tartalmazó szí kksgéha lapu hordozó (1 ,90 g), Elemanaiizis: C: 4,91 %N; 1,14% ki; .1,68%
7, példa
A 1.0. példa szerinti leírás azzal módosítva, hogy a szliika komponens a 8. példa szerint előállítod aminíimkelős csoportot tartalmazó szíltkagél-alapű hordozó (.1,90 g). Elemanaiizis: C: 6,63%N; 1,90% Hl 1,94%
18, példa
A 10 pokla semcm k't'ds aznd mocosaAz, bo$A <t íh\a kcmpeínmo a polca -.énei előállított amin funkciós csoportot tartaknaző szílikagél-alapú hordozó 11,90 g). Elemanaiizis: C: 6,33% N; 1(72% 11: 1,91 %
19, példa
A 19. példában bemutatott módon előállított, EDTA anhklrlddei -kapcsolt szlhkagél-alapd hordozót (E00 g) nikkel-klorid oldatban (NiCls 199 tnM; 16 ml) sznszpendákonk, majd $ pere fasaas után a- elegseí suatsk > Un wt íhkagU-alapa IMAt normása e. után HEPES-'pnflérrcl (2-(4-(2-hidroziednptperazín-i-líletánszultruísav; 29 mM; píT:::7,5: 16 ml), desztillált vízzel (20 ml), bmdazel oldattal (509 mM: pIT-:7,S: 9 ml), maid dssAinált vízzel (20 ml) utóink V dkesmun Nme tatom m\ga kalapé bcUwvt szobahőmérsékleten 20%-os etanol alatt tároltak,
Lálíg-AÁS: Ni; 2,99%
20, példa
A H oe'd i s.eima lerts ,>t η\\ί<'.Ά.ι. hóm a. Ut \C netdmo a 11 pAdaban herrmlatoii módon előállított, EDTA auhidriddel kapcsok szikkagél-alapó hordozó 11,90
g) voh,
Eáng-AÁS: NE 2,61%
A 19, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy az 1MÁ.C hordozó a 12. példábao bemutatott módón előállított; ED'ÍA anhidriddcl kapcsolt szdikágékalapú hordozó (MM)
g) volt.
Láng-AA S; \ > ' ? 1 %
22. példa
A 19, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy az IMAC hordozó a 13. példában berouiaem ntodon eloalb-tou, HU \ ar-hidnddd lappod ζ.οΗΙ-,ηΝόηΝρο hordom C,oo
g) volt.
Láng-AAS; Né 1,20%
23. példa
A 19, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy az IMAC hordozó a 14, példában bemutatott módon előállított, EDTA anhidríddeí kapcsolt szili kagél-alaph hordozó (1,00
g) volt.
Lána-AAS; Né LM%
24, példa
A 19, példa szerion karos, azzal modosiuu, hogj az Iákét.) hordozó a 13. példában t on > o ' t ed® ·, J - ο , η N x mb dt de·.' ' ae< -' t h ' g e' d i» xo < > ón
g) volt,
Láng~AAS: Ni: 1,4053
25, példa
A 19, példa szerinti leírás, azzal módosítva,· hogy az IMAC hordozó a 16. példában bemutatott módon előállítod, EDTA aahidríddel kapcsolt szlltkagékalapú hordozó (1,00
2ő, példa
A. 19. példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy az 1MAC hordozó a 17, példában \'k uoi η-..,; ' ' AMv ' ' ' \ '' leérne a; volt,
Láng-'AAS: Ni; l,ö8%
27. példa
A. 19, példa szériád leírás azzal módositve, hogy az 1MAC hordozó a lg. példában bemutatott módon előállított, ED'IA anhidrlddel kapcsok szílikagébalapú hordozó (1,00 g) volt.
kdng-ÁAS: Ni; 1.,79%
28. példa í ' , m.AA<> Háoseaa ;t.h ' 'wi\d\\;\ m , \st a Ν',·,ί?ν™.'ύΠ' enzimet (530 amiupsav; 57,9 ki)a; pl 5,94) kódoló génszakaszt [The Drosophila Concostium. Natúré 2007;450<Ji67); 203-218] és karbemeilim rezisztenciát hordozó pET“19b plazmáddal transzformáltuok (e vektorral termeltetéskor a íéhétie TAterrnináiisa Hixmcimkéi. hordoz). A transzformáns sejieket 0,1 S? mg/ml karbenicdlint tartalmazó LS agarőz lemezek (10 g Tripton; 5 g élesztők! vonat; 10 g NaCl; 1:8,75 g mikroniológial agar / 1 h pH 7,5) segítségévei szelektáltak. A plazmídot tartalmazó sejtekkel 5 ml térfogam tenyészetet készítettünk (200 rpm, 37ftC, lő óm.), majd ezt az inokolmnot 500 ml EB tápoldatba. oltottak, Az i,B táptalajon ő/AAorr növesztett, rázatott sejteket (200 rprn) Oláson ÖJ'-ős Optikai denzhás elérésekor 0,0 mM tPTG-vel (izopropil->foÜN N tlogaiaktopiranozid; indukáltuk. Az índukálószer hozzáadását követően a íehérletermeiés zSANon rázatással történt (4 óra, 200 rpm). Ezután a sejteket ieeentrifagámk (360(1 rpm. 20 perc, 4*C), majt a aejtpeiletet 50 ml 4AAos lízis pufíerhcn szpendáituk (50 m.M TR1SHíd; pH 7,5; 300 mM 'NaCh 0,5 mM 15DTA; 5 sM d-merkaptoetanol; 1 mM PMSE ííernimeiánszult'oniltlnprid]; 5 mM 8A ibenzil-adenin); 0,1 mgórd lizozim, 0.1 mg/ml IBNAse I; 0,01 mg/ml BNAse A). A hdszaszpendáit sejteket ezután jéghütés közben szöüikálással tártuk fel (Bandeltn Sonopuls HD 2070 készülék, 10 <10 rnp, 40% amplitúdó, ö eiklns/pere}. A sejtíörpteiék elválasztása az afBnhásanyag tesztelésére szánt t i ' > ,e η o s ο f < 0 ti pm v, , '
29. példa
A 19. példában bemutatott módon előállított Ön-tartalmó affinitás anyagot 1202) mg) desztillált vízben sznszpendáttuk (1 ml), majd 15 sere állás után niraszuszpendáltuk, A mintát íéééntdfugáltuk (5000 rpm5 25ÖC, 10 perc) és a vizet dekamáltnk· A nedves affinitás anyaghoz a 28. példában, bemtUatobmódén előállított dUTPáz enzim tblülászdjái adtuk (100 ah ?,g mg összes tehéne/ml lelütOsző), a mintát íélsznszpendáltuk, maid lecentrlfugáimk (5000 rpm, 2S9C, 10 perc) és a télüinszót deksntáltuk (lásd: 3. ábra, :íÁi.eső'’), A mintái Eow bah paffbrrei mostuk ihb; 2*1 ml; 50 mM HETES [2-14-(2bldroxietd)píperazia-t-il]ctánsznlfcnssvh 3-Ö mM KG; pM:ií:7,5), lccentnb.tgái.tuk (5000 rpm, 23*C, 10 pete), a lélillászót dekaniálínk (lásd: 3, ábra, „LS”). A mintái ezután egymást követben növekvő koncentrációjú EDTA-oidatnkkal mostuk (100 μΐ, 5 mM, ρΡΜ,Ο; 1.00 ni, 20 mM, ρΗ-δ,Ο; 100 μΐ, 100 mM, ptffiMö), Minden mosás után a iblszuszpendált mintát cenffitbgábók (5000 rpm, 25A.2 10 pere) és dekaatálink (lásd: 3, ábra, ,,5mM ΕΠΤΑ”; „20mM ΕΠΤΆ*’; ,JO0mM ΕΠΤΑ”)· Végül az IMAC bordozét desztillált μζ/λΊ ffil mh mostuk es 50'*>-os etanol akár mrietml. .A comb fugák femlus/okhuz eső ub ícsteknklatot Uő pb 25hmM fro'-UG pb n,k, 0·% olffi [nárdnmdödecdszultatj; 10% OTT [dinolreitől]; 50% glicerin; 02)552 btómibnoi-kék testék) adtunk, majd ebből az eiegyböi 95ö€-os hőkezelést (5 pere) kővetően 12,5 gl-t plpetíázmnk a. ffittaió gél adntataAö zsebeibe, A géi-elektrotbrézlst 12%-os akrdamid pcl U seeo/táf -ckluothmm puau a kn, míg gmo Ed $ ΜΌχ Vau
PRöTEAM® Teira eeil fuUatőkád; PewerPae Enivarsal tápegység; 200 V tesztiltség),
30. példa
A .29, példában bemutatott eljárás, azzal módosítva, begy a ön-tartalmú affinitás anyagot a
20. példában berntdatoít módon aduénak vlő,
31.. példa
A. 29, példában bemutatna eljárás, azzal módosítva, hogy a. Ni-ámalmú affinitás anyagot a
21. példában bemutatott módon állítottuk elé,
32, példa
A 29, példában bernntamu eljárás, azzal módosítva, hogy a öffitartabnú affinitás anyagot a.
22. példában bemutatott módon állítottuk elő.
33, példa
A. 29, példában bemutatott eljárás, azzal módositvo, hogy » Ni-tartelnsú affinitás anyagot a 23, példában bemutatott módon áliiietttdí. old.
A 29, póidábsu bemutatott eljárás, azzal módosítva, hogy a NEtattaimú affinitás anyagot a
24. példában bemutatott módon állitottuk elé.
35, példa
A 29, példában bemutatott eljárás, azzal módosítva, hogy a Ed-tártalmd affinitás anyagot a
25. példában bemutatott módon, albumuk elő;
36< példa
A 29. példában bemutatott eljárás, azzal rnóhositvgs hogy a Ni-tartalmá affinitás anyagot a
26. példában bemutatott módon állítottuk elő.
A 29, példában bemutatott eljárás, azzal módosítva, hogy a Ni-tartahnu affinitás anyagot a
27. példában bemutatott módon állítottuk elő,
38, példa
A 19, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy az affinitás anyag a 10. példában bemutatott módon előállított EDTA kelálo ágenssel kapcsolt szili kagól-alapú hordozó tld-’O gt voh, amelybe a hmt ntsdattenti'mt hm tanon irattal u a(\Offi: ffib oAk la ndá vitttík be.
39, példa
A ÍR példa szermti leírás, azzal módosítva, hogy ez affinitás anyag a 12. példában bemutatott módon, előállított EDTA kelálo ágenssel kapcsolt sziiikágei-alapú hordozó 0 >,n ffi ' ' ,K'\ t ttunde , ' om on tnt nőit a \D ' uffi Mm vittük be.
40. példa
A 19. példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy az affinitás anyag a 16. példában hemdtatbíi módon előállítón EDTA Laláié ágenssel kapósait áííiiíkágób-alapű· hordozó (1,00 g) vofk amelybe a lámáddá. fémiont lan tán- míráttai (La(NÖs);g 100 mM; ló ml) szülik be,.
41. példa
Ax 19. példa szerinh leírás, azzal módosítva, hogy az affinitás anyag a 18. példában bemutatott módon előállított EDTA kóláié .ágenssel kapcsolt szilíkagéí-alepű hordozó (1,01) g) volt, amelybe a lantanida fémiont iantán-niIrattal ffiafNChffi 100 mM; 1.6mi) vittük be.
42. példa
A 29. példában bemutatott eljárás, azzal módosítva, hogy a Lad'-tartalmú affinitás anyagot a 38, példában bemalatoh módon·állítottuk elé, (3··?, ábra, ebé sáv baltól).
43. példa
A 29, példában bemutatott eljárás, azzal módosítva, hogy a Iffiffiahalmú affinhás anyagot a 39. példában bemutatott módon állítottuk elő. (3-7, ábra, második sáv balról).
44. példa.
A 29. példában bemutatott eljárás, azzal módosítva, hogy a kXffiartalmú affinitás anyagot a 4Ó., példában bemutatott módon állítottuk elő, (.3--7, ábra, harmadik sáv balról),
45. példa
A 29, példában bemutatott eljárás azzal módosítva, hogy a La3 Mamimé affinitás anyagól a 41. példában bemutatott módon állítottuk elő. (3-7. ábra, negyedik sáv balról).
4é, példa
Szilika szolból líelraíetoxi-szilán fTE(3S):etaard:desztliláll vlxdlCl 1:2:2:03)1 mólarányé keveréke 8OÁ3 hőmérsékleten 30 percig kezelve] elektrospinning módszert ismert módon felhasználva (Choi, 8. S>; et al, Journal of Materials Science Lehers, 2003)22:891--893] 12 kV feszültség alkalmazásával 500-1200 nm átmérőjű szül ka naneszábkbót álló 0,5 - 1 mm rétegvastagságú laza szövedéket hoztunk léire.
47, példa
A 4, példa szerinti leírás, azzal módosává, hogy a szilárd hordozd 100 mg. szilika·· nanoszál szövedék volt fennek megfelelően a 4. példához képest századrésznyi oldószert és szilán reagenst alkalmazva).48, példa
Az 5, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó 100 rop szilikananoszál szövedék volt (ennek megfelelően az 5- példához képest századrésznél oldószert és szilán reagenst alkalmazva).
A ő. példa szerinti leírás, azzal módosítva, hegy a szilárd hordozó löd mg szilikananoszál szövedék volt (ennek megfelelően a h. példához képest századrésznyi, oldószert és szilán reagenst alkalmazva).
SCI, példa
A 7, példa, szerinti leírás, azzal módosává, hogy a szilárd hordozó 100 mg szilikananoszál szövedék volt fennek megfelelően a 7, példához képest századrésznyi oldószórt és szilán reagenst alkalmazva).
A 8. példa szerinti féltés azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó 100 mg szilika-nanoszái szövedék volt (ennek megfelelően a 8, példához kepest századrésznél oldószert és szilán reagenst alkalmazva).
57. példa
A 0, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó 100 rng szilikanatmszál szövedék volt (ennek megfelelően a 9. példához képest századrésznyi tdööszep. és szilán reagenst albúmnzva),
A Ki, példa szerinti feirás, azzal módosítva, hogy a szilárd komponens a 47, példában bemutatott módon előállított amin funkciós csoportot tartalmazó szili ka-nanoszál alapú hordozó (KM) mg) voh termek megfelelően a Ki. példához képest dzedrésznyi oldószert és EDTÁ~dianhldrlnet alkalmazva),
A 10. példa széfem), leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd komponens a 48. példában bemutatott módon előállított amin ifetkclós csoportot tartalmazó szili ka-nanoszál alapú hordozó (Ka) mg) volt (ennek megfelelően a lö. példához képest tizedrésznyí oldószert és 1 Pl Vd.mttmh'OeiaK.mna \ o
55, példa
A. 10. példa szerinti lettás, azzal, módosítva, hogy a szilárd komponens a. 49, példában bemutatott módon előállított amin funkciós csoportot tartalmazó sziukn-nanoszál alapú hordozó (100 mg) volt (ennek megfelelően a 10, példához képest hzedrésznyi oldószert es EDTAfeianhídódet alkalmazva).
56, példa
A 10. példa szerinti leírás* azzal módosítva, hogy a szilárd komponens az 50. példában bemutatott módon elöállftoú amin funkciós csoportot tartalmazó szhikamanoszái alapú hordozó OOö mg) volt (ennek megfelelően a 10. példához képest tizedrésznyí oldószert és EDT A ·d;anhIdódét alka| mazva)
57, példa
A Itt példa menün künn, ,o al medovme, becs a a Tant kmnpooem. a* Ή példában bemutatott módon előállított amin funkciós csoportot tartalmazó szhikamanoszái alapú hordozó (.100 mg) volt (ennekmegfelelően a 10, példához képest tizedrésznyí oldószert és
A 10, példa szerinti loirás, azzal módosítva, hogy a szilárd komponens az 52. példában bemutatott módon előállítod amin bsnkelős csoportot iartáhnaző sztlikamanoszál alapú hordozó (löű mg) volt (ennek megfelelően a H), példához kénest tizedrésznyl oldószert és EDTÁ-dlaniúdrldet alkalmazva),
A 19, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó az 53. példában bemutatod módon előállítón E13TA íhneionahzáh nanoszdikamzál alapú hordozó (100 mg) volt (ennek rnegthlelóen. a .19, példához feépest tizedrésznyl mosőoidatokat alkalmazva).
hó, példa
A. 19. példa szerbül leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó az 54, példában bem utalod módon előállított EDTA htnkeionahzált nanoszihka-'Szál alapú hordozó (190 mg) vök (ennek megiélelően & 19. példához képest tizedrésznyl mosőoidatokat alkalmazva).
őt, példa
A 19, példa szerinti- leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd, hordozó az SS< példában bemutatok módon előállítod EDTA tunkeionaiizált uanosznlka-szái alapú hordozó (Hk) mg) volt (ennek megfelelően a 19. példához képest tizedrésznyl mosőoidatokat alkalmazva).
62. példa
A 19, példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó az 56, példában bemutatott módon elődükön EDTA Íunkeionalizak nanoszdlka-szal alapú hordozó (114) mg) volt (ennek mogtélelően a 19. példához képest tizedrésznyl mosőoidatokat alkalmazva),
63, példa
A 19. példa szerbül leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó az 57. példában bemutatott módon előállítok EDTA Emóciónál izák nanoszilika-szál alapú hordozó (lód ,ηvi mosőoldatokat mg) volt (ennek megfelelően a 19, példához képest dzedels. niímimazs as 64. példa
A 19. példád szerinti leifás. azzal módosítva, hogy a szilárd- hordozó az 54. példában Km m ' ' on Uoo 1 ott Ο' \ , ' o ml d ’ \ ' - d hot e .¾ 1 ' mg) volt lennek megfelelően a 19. példához képest tizedrésznyl mosóoIdátokat alkalmazva).
A 38. példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó az 53= példában bemutatott módon előállított EDTA huikeionalizák nznoszinka-szál alapú hordozó 1160 mg) volt (ennek megfelelően a .18. példához képest tizedrésznyl mosőoldatokat alkalmazva).
66. példa
A 38, példa, szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó az 54. példában Kmun,o,m nmdon doallnott hlőf k mohomnak, áh Ka'ml alapé Imnío, e Jőo mg) volt lennek megíéleiően a 38. példához képest tizedrészayi mosóoldatokat alkalmazva).
67. példa
A 58, peldít s-mőnti knras, az, el modo/ua, hogy a s/dnd honlnzo az 55 p·..dóban Uemm.oa r,\,m oMa le t Ά\ ,.λο.ί I .hm ápit!ea<- < , m) mg) so . imghe!\ ' 'V mkl.'io K > {»A -> n ra v't<,, ok,.
alkalmazva),
68, példa
A 5S pokla .szerinti léimé, azzal módosőva, hogy a szilárd lasdozo az 56 példában bennnatou módón Koalhmn 1 Π1 v nmkomndi.-ah ntne< lKaza· alapú bontom /.00 mg) volt lennek megfelelőén a 38. példához képest bzeőrésznyi mosőoldatokat alkalmazva).
'Á\
A. 38. példa szerinti leírás. azzal módosítva, hogy a szilárd hordozó az 57, példában bemutatott módon eloállítött EDTA thokcmnahzálr nanosziiika-szál alapú hordozó (100 mg) >? χο?\ y de s. e A , ps x u\ n -.hm ' ' o- >A , \ alkalmazva),
70, példa
A 38. példa szerinti leírás, azzal módosítva, hogy a szilárd. hordozó az 58. példában bemutatott módon előállított EDTA hmkeiomtlizált nanoszihka-szál alapú hordozó (100 mg) volt (ormot; moglelólőeb a 38. példához képest tlzedrészrsyl mosóoldatokat alkalmazva).

Claims (4)

1. Fehérjék megkötésére és elváiszztására alkalmas, a. (lü általános szerkezettel jellemezhető hordozók tentanida fémionokkal (ΝΓ'; ) alkotott kotnplexei.
HORDOZÓ
-tSli'h.h4..-A-éX}(?l-l4N(é;H2COOH)CkbCH>k,NíCkhCOOHg}x (Π) M01<féWjm ahol
IV jelenlése l-h szénaíornszárná, egyenes vagy elágazó láncú alksl csoport; vagy 2-á szénatomszám á, egyenes vagy elágazó láncú alken.il vagy alkutd csoport: vagy G-k szénatomszámú aril, araikiI vagy mkféalkli csoport; vagy alkoxi csoport.
R? jelentése l-S szénntemszámá, egyenes vagy elágazó láncú alkil csoport; vagy 2-á szén atomszámé., egyenes vagy elágazó láncú alkeni! vagy alkinü csoport; vagy ö-d szénaiornszárnó érik amikiI vagy cikioalki! csoport; vagy alkóv! csoport,
K? jelentése olyan nem reaktív csoport, amely 2-30 egymással kovalens kapcsolatban álló szén, oxigén, kén, nitrogén, fészkm Onot, klór, króm vagy jód atom. által alkotott egyenes, elágazó vagy gyűrűs szerkezetet tartalmaz,
A jelentőse olyan atom vagy atomcsoport, amely nem-kötő elektronpart tartalmaz, előnyösen Nhk 5, <h
L jelentése a Si-atemot és az A részeket összekötő 2-22 egymással kovalens kapcsolatban álló szén, oxigén, kén vagy nitrogén atom által alkotod egyenes, elágazó vagy gyűrűs szerkezeteket tartalmazó egység, \ Mentese <g> s.mm es Aoe űotk ár jelentése egy egész szám és mO, .1 vagy 2,
Mi jelentése ianPmlda fém, a La, €e, Nd, Pm, Sm, En, Gtd, Th, Dy, Ifo, Er, Tm, Yb, Lu. seemeleex W e\ ο Mente e eg\ epe,-' <.av e-- a 2, ' \ ,m,?
2. Az 1. igénypont szerinti, lanisnida fémionokkal komplexált hordozók felhasználása oKer ehgepepodek féhepek emgketevne mebM leytkénl· - he,t,d,m maguk n foglaló, 5-12 aminosav hosszúságé affinitás szakaszokat tartalmaznak.
3, Az 1. igénypont szerinti, Isahanida fémionokká! komplexált. hordozok lélhásználáad olyan oligopeptldek vagy fehérjék megkötésére, melyek legalább 3 hisztidint magukba foglaló, 5-12 amínosav hosszúságú aímútás szakaszokat tartalmaznak, olyan-módon, hogy az oligopeptióek vagy fehérjék kötésállapot változását optikai úton kövepük.
4. Az 1, igénypont szetwtk laniánidaIvmionökkal komplexált hordozók, azzal jellemezve, ltom o.'oi' decahmmhez emnsoe mg> eake hoakvo? Jkalmazunk dom^sen óban pórusos hordozót, melynek szemesemérete 1 pm - 2 mm közötti, pörosmerete 4 - 200 nm közötti, vagy olyan szálas hordozót, melynek átmérője 1Ö0 -2000 am, amelynek fajlagos felúleie 10 -- 200() nk:g's és amelyek anyaga porózus vagy szálas üveg, alnminiom-oxid, ötán-diodd illetve egyéb tiszta vagy keverek fémoxid vagy reaktív csoportokat tartalmazó természetes vagy szmtetikns polimer.
HU1200327A 2012-05-30 2012-05-30 Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók HU230585B1 (hu)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU1200327A HU230585B1 (hu) 2012-05-30 2012-05-30 Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók
EP13734148.3A EP2943501B1 (en) 2012-05-30 2013-05-30 Compositions for binding and separating of proteins
PCT/HU2013/000050 WO2013179072A1 (en) 2012-05-30 2013-05-30 Compositions for binding and separating of proteins

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU1200327A HU230585B1 (hu) 2012-05-30 2012-05-30 Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP1200327A2 HUP1200327A2 (en) 2013-12-30
HU230585B1 true HU230585B1 (hu) 2017-01-30

Family

ID=89990756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1200327A HU230585B1 (hu) 2012-05-30 2012-05-30 Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2943501B1 (hu)
HU (1) HU230585B1 (hu)
WO (1) WO2013179072A1 (hu)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116351399A (zh) * 2022-12-30 2023-06-30 厦门色谱分析仪器有限公司 一种键合型纤维素衍生物手性液相色谱柱及其制备方法和应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US662365A (en) 1900-06-14 1900-11-20 Clarence C Marder Printer's rule.
CA1231306A (en) 1983-03-03 1988-01-12 Erich Hochuli Purification of interferon
US4569794A (en) 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US4835269A (en) 1985-11-11 1989-05-30 Ceskoslovenska Akademie Ved Silane reagents containing a complexon group
CA1304886C (en) 1986-07-10 1992-07-07 Heinz Dobeli Metal chelate resins
US5594115A (en) 1990-04-09 1997-01-14 Pharmacia & Upjohn Company Process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process
US6623655B1 (en) 2000-04-24 2003-09-23 Sigma-Aldrich Co. Metal chelating compositions
EP1585970A4 (en) 2002-10-18 2008-08-06 Promega Corp METHOD FOR SEPARATING MOLEK LEN
SE526214C2 (sv) 2003-02-28 2005-07-26 Amersham Biosciences Ab Ett sätt att generera metallkelaterande affinitetsligander
CN101808731B (zh) * 2007-08-06 2013-10-23 马普科技促进协会 用于固定金属离子色谱法(imac)的螯合基团的固定

Also Published As

Publication number Publication date
EP2943501A1 (en) 2015-11-18
WO2013179072A8 (en) 2016-03-31
EP2943501B1 (en) 2019-06-26
HUP1200327A2 (en) 2013-12-30
WO2013179072A1 (en) 2013-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3946772B2 (ja) 組み換えタンパク質の精製法
JP7544704B2 (ja) 固相キレート材、その製造方法およびタンパク質の精製におけるその使用
US20170369448A1 (en) Compounds for affinity chromatography and for extending the half-life of a therapeutic agent
KR102590042B1 (ko) 항체 약물 결합체에 사용되는 약물-링커 mc-mmaf의 제조 방법 및 이의 중간체
WO2017046625A1 (en) New chelators for affinity purification of recombinant proteins
CN106146325A (zh) 一种y型多缩乙二醇衍生物及其制备方法
HU230585B1 (hu) Fehérjék megkötésére és elválasztására alkalmas lantanida fémionokkal komplexált hordozók
Daimon et al. Media-dependent morphology of supramolecular aggregates of β-cyclodextrin-grafted chitosan and insulin through multivalent interactions
CN102643420B (zh) 一种异端基双官能团聚烷基醚类化合物及其用途
CN107892710B (zh) 一种易于回收循环使用的负载型铂配合物氧化剂及其制备方法和应用
JP4448949B2 (ja) 導電性ペプチドナノファイバー及びその製造方法
JPWO2007060860A1 (ja) ピロールイミダゾールポリアミドの固相自動合成
Li et al. Peptidic molecular brushes with enhanced chirality
JP4435755B2 (ja) 蛋白質に比べて核酸に対する結合力が選択的に高いｐＨ依存性のイオン交換物質、それが固定化されている固体基板、及び前記物質及び固体基板を利用して核酸を分離する方法
WO1992006107A1 (en) Process for purifying synthetic peptide, and linker and linker-combining solid-phase carrier used in said process
JP2000510839A (ja) 触媒イミダゾール（例えばヒスチジン）機能を有する触媒を使用した安定化変遷複合体を用いたアシル移行
CN109180708B (zh) 一种醋酸根桥联的手性双核铜配合物及其制备方法
JP2022537331A (ja) 金属錯体試薬を介するＨｉｓタグ付タンパク質などの標的分子への標識および／または担体の部位特異的、速度論的に不活性なコンジュゲーション
CN104650170B (zh) 荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法
JP4448947B2 (ja) ナノファイバー形成能を有するペプチド、及びペプチドナノファイバー
Luo et al. Syntheses of imidazolium‐bridged cyclodextrin dimers and their catalytic properties in the hydrolytic cleavage of p‐nitrophenyl alkanoates
JP6395461B2 (ja) 造影剤の製造方法
Zhu et al. Address-crossing digital information processing on a self-aggregatable cyclodextrin derivative based nanosystem
JPH01319502A (ja) シクロデキストリン誘導体及びその製造方法
JP4179103B2 (ja) ペプチド繊維及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees