JP4435755B2 - 蛋白質に比べて核酸に対する結合力が選択的に高いpH依存性のイオン交換物質、それが固定化されている固体基板、及び前記物質及び固体基板を利用して核酸を分離する方法 - Google Patents
蛋白質に比べて核酸に対する結合力が選択的に高いpH依存性のイオン交換物質、それが固定化されている固体基板、及び前記物質及び固体基板を利用して核酸を分離する方法 Download PDFInfo
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Description
本発明に係る他の目的は、前記物質が固定化されている固体基板を提供することである。
本発明に係るさらに他の目的は、前記本発明に係る物質またはそれが固定化された基板を利用して核酸を分離する方法を提供することである。
Aは、−X(CH2)nYであり、この際、nは、1〜10の整数であり、Xは、活性化エステルと反応しうる官能基であり、Yは、第1級、第2級、第3級アミノ基または窒素含有の芳香族複素環塩基であり、
Bは、−X’(CH2)nY’であり、この際、nは、1〜10の整数であり、X’は、活性化エステルと反応できる官能基であり、Y’は、pKa値が4以下の酸発生基であり、
R3は、炭素数が1〜10のアルキレン基である。
本発明に係るpH依存性のイオン交換物質を構成する構成単位の他の例には、Bは、−X’(CH2)nY’であり、この際、nが1〜10の整数であり、X’は、活性化エステルと反応しうる官能基であり、Y’は、スルホニル、スルフェニル、スルフィニルまたはホスホリル基である。
本発明に係る実施形態におけるpH依存性のイオン交換物質を構成する構成単位は、当該分野において既知の合成方法により合成されうる。例えば、ポリ無水物(例えば、ポリ(エチレン−アルト−マレイン酸無水物)(分子量100,000〜500,000))のうち無水物部分(モイエティ)を加水分解してカルボキシル基を露出させ、前記カルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び1、[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミド(EDC)のような物質と反応させて活性化エステルを形成させる。次いで、前記A(例えば、1−(3−アミノプロピル)イミダゾール)またはB(例えば、タウリン)部分(モイエティ)を、活性化エステルと反応させることによって、本発明に係るpH依存性のイオン交換物質を製造できる。前記ポリ無水物、A(例えば、1−(3−アミノプロピル)イミダゾール)またはB(例えば、タウリン)モイエティは、当業者が容易に合成できるか、または商業的に購入できる。このとき、本発明に係るpH依存性のイオン交換物質の純電荷は、AまたはB部分(モイエティ)を反応中、適切な割合で使用することによって調節できる。
本発明に係る前記pH依存性のイオン交換物質が表面に固定化されている固体基板は、シリカ、融合シリカ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ガラス、特に、スライドガラス及びシリコンウェーハからなる群から選択されうるが、これらの材質の基板に限定されるものではない。
実施例1:本発明に係るpH依存性のイオン交換物質が固定化された基板を利用した核酸の回収
本実施例では、下記化学式MO、M1、M2及びM3からなる群から選択される少なくとも一種の単量体が結合されており、Aを有する単量体及びBを有する単量体が、少なくとも一種含まれており、重合度2〜30,000であるpH依存性のイオン交換物質を基板上で合成し、前記基板を利用して核酸を精製(分離)した:
ただし、
Aは、1−(3−アミノプロピル)イミダゾールであり、
Bは、タウリンであり、
R3は、−CH2CH2−である。
下記反応式のように、前記pH依存性のイオン交換物質が固定化された基板を製造した。
対照群(コントロール)基板として、下記化学式において、R1及びR2は、同じであるか、または異なっていてもよく、それぞれ独立的に−OH基及び−NH(CH2)2NH2からなる群から選択され、この際、mは、2であり、lは、1〜30,000であるpH依存性のイオン交換物質が固定化された基板(対照群1:以下、“CRS1”ともいう)、ならびに、R1及びR2は同じであるか、または異なっていてもよく、それぞれ独立的に、−OH基及び1−(3−アミノプロピル)イミダゾリル基からなる群から選択され、この際、mは、2であり、lは1〜30,000であるpH依存性の下記化学式のイオン交換物質が固定化された基板(対照群2:以下、“CRS2”ともいう)を製造し、第1pHでDNAを結合させた後、第2pHで前記DNA−基板複合体から核酸を回収(分離)した。
実施例1で得られたpH依存性のイオン交換物質が固定化されている基板上に、標準蛋白質であるAlexa−532が標識されたIgG 100nMを含む0.15Mの酢酸ナトリウム溶液(pH3.0)60μlを添加し、蓋を覆って室温で1分間放置した後、0.15Mの酢酸ナトリウム溶液(pH3.0)60μlで洗浄し、蛍光度を測定した。ここで、Alexa−532が標識されたIgGは、ヒトIgG(Sigma社、米国)及びAlexa Fluor−532(MolecularProbe社、米国)をAlexa Fluor 532 Monoclonal AbLabeling Kit(Molecular Probe社、米国)によって反応させて製造した。
Claims (13)
- 前記イミダゾリル基が、1−(3−アミノプロピル)イミダゾールに由来する、請求項1に記載のpH依存性のイオン交換物質。
- 前記スルホ基が、タウリンに由来する、請求項1または2に記載のpH依存性のイオン交換物質。
- 前記イミダゾリル基が、1−(3−アミノプロピル)イミダゾールに由来し、
前記スルホ基が、タウリンに由来し、
前記1−(3−アミノプロピル)イミダゾールおよび前記タウリンが、モル比を基準として、それぞれ、6:4または8:2である、請求項1に記載のpH依存性のイオン交換物質。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載のpH依存性のイオン交換物質が表面に固定化されていることを特徴とする、固体基板。
- 前記固体基板は、マイクロ流体素子内のマイクロチャンネルの形態を有することを特徴とする、請求項5に記載の固体基板。
- 前記イオン交換物質が固定化される固体基板は、シリカ、融合シリカ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スライドガラス及びシリコンウェーハからなる群から選択されることを特徴とする、請求項5または6に記載の固体基板。
- 核酸を含む試料を請求項1〜4のいずれか1項に記載のpH依存性のイオン交換物質と第1pHで接触させる工程と、
核酸が結合された前記イオン交換物質を前記第1pHより高い第2pHを有する溶液にさらしてイオン交換物質から核酸を放出させる工程と、
を含むことを特徴とする、pH依存性のイオン交換物質を利用して核酸を精製する方法。 - 前記第1pHは、2〜3.5であり、前記第2pHは、7〜10であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 核酸を含む試料を請求項5〜7のいずれか1項に記載のpH依存性のイオン交換物質が固定化されている固体基板に第1pHで接触させる工程と、
核酸が結合された前記イオン交換物質を前記第1pHより高い第2pHを有する溶液にさらしてイオン交換物質から核酸を放出させる工程と、
を含むことを特徴とする、pH依存性のイオン交換物質が固定化されている固体基板を利用した核酸の精製方法。 - 前記第1pHは、2〜3.5であり、前記第2pHは、7〜10であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記固体基板は、マイクロ流体素子内のマイクロチャンネルの形態を有することを特徴とする、請求項10または11に記載の方法。
- 前記イオン交換物質が固定化される固体基板は、シリカ、融合シリカ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スライドガラス及びシリコンウェーハからなる群から選択されることを特徴とする、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
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