KR100647306B1 - 아미노기와 카르복실기를 포함하고 제1 ｐＨ에서 양전하를띠는 물질을 이용하여 핵산을 분리하는 방법 - Google Patents

아미노기와 카르복실기를 포함하고 제1 ｐＨ에서 양전하를띠는 물질을 이용하여 핵산을 분리하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제1 pH에서, 시료를 아미노기와 카르복실기를 포함하고 상기 제1 pH에서 양전하를 띠는 이관능기 물질과 접촉시켜 핵산을 상기 물질에 결합시키는 단계; 및 상기 제1 pH 보다 높은 pH에서 상기 핵산을 방출시키는 단계를 포함하는, 핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.
핵산, pH

Description

아미노기와 카르복실기를 포함하고 제1 ｐＨ에서 양전하를 띠는 물질을 이용하여 핵산을 분리하는 방법{Method for isolating a nucleic acid using a material positively charged at the first pH and comprising an amino group and a carboxyl group}
도 1은 각각 pH 3, 7 및 10에서 결합된 DNA의 양을 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 pH 변화에 따라 방출되는 DNA의 양을 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 pH 3과 pH 7에서 박테리아 게놈과 반응된 기판을 EtBr로 염색한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 아미노기와 카르복실기를 포함하고 상기 제1 pH에서 양전하를 띠는 물질을 이용하여 핵산을 분리하는 방법에 관한 것이다.
종래 pH 의존성 이온 교환 마트릭스를 이용한 핵산의 분리 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허공개 제2001/0018513호에는 이온화가능한 기를 가지고 있는 물질로서 이온화가능한 기는 제1 pH에서 양전하를 띠고 있어 핵산과 결합할 수 있고, 상기 제1 pH보다 높은 제2 pH에서는 상기 핵산을 방출시키는 물질을 이용하는 핵산의 분리방법이 개시되어 있다. 이온화가능한 기를 가지고 있는 물질의 예로는, N-2-아세트아미도-2-아미노에탄술폰산 (ACES), N-2-아세트아미도-2-이미도디아세트산 (ADA), N-트리히드록시메틸-메틸-2-아미노에탄술폰산 (TES) 및 트리히드록시메틸아미노에탄(Tris) 등이 포함된다. 또한, 미국특허 제6,310,199호에는 실리카 자성 입자와 방향족 탄화수소 고리, 상기 방향족 탄화수소 고리에 공유적으로 부착되어 있는 스페이서, 및 제1 말단에서 상기 실리카 자성 입자에 부착되어 있고 제2 말단에서 상기 스페이서에 부착되어 있는 링커 알킬 사슬을 포함하는 링커를 포함하는 복수 개의 제1 이온 교환 리간드를 포함하는 pH 의존성 이온 교환 마트릭스을 이용하여 핵산을 분리하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 상기한 종래 기술에 의하더라도 이온화가능한 기를 가지고 있는 물질과 핵산의 결합 속도가 크고 pH를 상승시켰을 경우 핵산을 방출하는 효율이 높은 물질은 여전히 요구되고 있었다. 이에 본 발명자들은 핵산과 보다 빠른 속도로 결합하여 신속하게 핵산을 흡착할 수 있고, pH를 상승시켰을 경우 핵산을 방출하는 효율이 현저하게 높은 물질을 탐색하던 중 카르복실기와 아미노기를 모두 포함하는 이관능기 물질을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 목적은 핵산과의 결합 속도가 빠르고 pH를 상승시켰을 때 핵산의 방출 효율이 높은 물질을 이용하여 핵산을 신속하고 높은 효율로 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 핵산을 포함하는 시료를, 아미노기와 카르복실기를 포함하고 있고 제1 pH에서 양전하를 띠는 이관능기 물질과 제1 pH에서 접촉시켜 핵산을 상기 물질에 결합시키는 단계; 및
상기 제1 pH 보다 높은 제2 pH에서 상기 핵산을 방출시키는 단계를 포함하고,
상기 물질은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다:
Figure 112006040592606-pat00021
(식 1),
식 중 n은 1 내지10의 정수이고, A는 피로멜릭틱(pyromellitic) 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실릭 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐) 에테르 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술폰 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,5,6-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-헥사플루오로프로판 이무수물, 시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 메틸시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 및 1,2,3,4-테트라카르복시부탄 이무수물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 테트라카르복실산 무수물과 아미노 기의 반응에 의하여 생성되는 화합물 중 -NH(CH2)nNH2을 제외한 부분을 나타내는 기이고,
Figure 112004060930095-pat00002
(식 2)
식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 1 내지 10의 정수인 -NH2(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, R3은 탄소수 1 내지 10의 알킬기이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다.
본 발명에 있어서, 제1 pH에서, 시료를 아미노기와 카르복실기를 포함하고 상기 제1 pH에서 양전하를 띠는 이관능기 물질과 접촉시켜 핵산을 상기 물질에 결합시키는 단계를 포함한다. 상기 시료는 핵산을 포함하는 것으로서 예를 들면, 혈액 및 세포를 포함하는 용액과 같은 생물학적 시료 또는 PCR 산물을 포함하는 용액과 같은 화학적 핵산 용액이 포함된다.
본 발명에 있어서, 시료 중의 핵산이 결합되는 물질은 아미노기와 카르복실기를 포함하는 물질로서 제1 pH에서 양전하를 띠는 이관능기 물질이다. 이런한 물질은 화합물 자체 또는 그러한 관능기가 고체 기판 상에 고정화되어 있는 고체 물 질일 수 있다. 고체 기판은 실리콘, 유리, 및 플라스틱 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 물질은 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 것이다.
Figure 112004060930095-pat00003
(식 3),
식 중 n은 1 내지 10의 정수이고,
Figure 112004060930095-pat00004
(식 4)
식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, m은1 내지 10의 정수이고, l은 1 내지 내지 30,000의 정수이다.
화학식 1과 2의 화합물은 각각 아미노기와 카르복실기를 갖는 화합물이다. 화학식 1의 화합물은 제1 pH에서 양전하와 음전하가 약 2:1의 비율로 포함되어 있어 +1 양전하를 갖는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 화학식 2의 화합물은 -OH 기 또는 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기가 약 2:1의 비율로 포함되 어 있는 화학식 4의 화합물이다. 화학식 4의 화합물의 일 예는, -NH(CH2)nNH2가 에틸렌디아민 기인 화합물이다.
본 발명에 있어서, 화학식 1의 화합물은 1,2,4,5-벤젠 테트라카르복실산 무수물과 같은 테트라카르복실산 무수물과 에틸렌디아민을 포함한 n이 1 내지 10의 정수인 NH2(CH2)nNH2를 화학 반응시킴으로써 얻어질 수 있다. 또한, 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 5의 화합물을 n이 1 내지 10의 정수인 NH2(CH2)nNH2 과 화학 반응시킴으로써 얻어질 수 있다. 그 결과 얻어지는 화학식 2의 화합물 중 -OH 기와 -NH(CH2)nNH2 기의 비율은 반응물 중의 NH2(CH2)nNH2 의 농도를 조절함으로써 조정할 수 있다.
Figure 112004060930095-pat00005
(식 5)
식 중 R3은 탄소수 1 내지 10의 알킬기이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다. 상기 화학식 5의 바람직한 일 예는 하기 화학식 6의 화합물이다.
Figure 112004060930095-pat00006
(식 6)
식 중 m은 1 내지 10의 정수이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다.
화학식 5의 화합물은 폴리무수물 중합체이다. 상기 중합체는 원심분리와 같 은 분리 과정에 의하여 용액으로부터 용이하게 분리될 수 있다. 따라서, 핵산을 상기 중합체로부터 얻어지는 화학식 2의 중합체에 결합시키고 얻어지는 핵산-중합체를 용액으로부터 분리하고, 분리된 핵산-중합체를 제2 pH에서 용출함으로써 핵산을 용이하게 상기 중합체로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 물질은 고체 기판 상에 하기 화학식 7 또는 8로 표시되는 기가 고정화되어 있는 고상 물질이다.
Figure 112006040592606-pat00022
(식 7),
식 중 n은 1 내지 10의 정수이고, A는 피로멜릭틱(pyromellitic) 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실릭 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐) 에테르 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술폰 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,5,6-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-헥사플루오로프로판 이무수물, 시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 메틸시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 및 1,2,3,4-테트라카르복시부탄 이무수물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 테트라카르복실산 무수물과 NH2(CH2)nNH2 중의 아미노 기의 반응에 의하여 생성되는 화합물 중 -NH(CH2)nNH2을 제외한 부분을 나타내는 기이고,
Figure 112004060930095-pat00008
(식 8)
식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, R3은 탄소 1 내지 10의 알킬기이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다.
상기 식 7 및 8의 일 예는 각각 하기 식 9 및 10의 화합물일 수 있다:
Figure 112004060930095-pat00009
(식 9),
식 중 n은 1 내지 10의 정수이고,
Figure 112004060930095-pat00010
(식 10)
식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, m은 1 내지 10의 정수이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다.
화학식 10의 기는 제1 pH에서 양전하와 음전하가 약 2:1로 비율로 포함되어 있는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 화학식 10의 기는 -OH 기와 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기가 약 2:1의 비율로 포함되어 있는 것이다. 화학식 10의 기의 일 예는, -NH(CH2)nNH2가 에틸렌디아민인 것이다.
본 발명의 상기 구체예에서, 상기 고체 기판은 실리콘, 유리, 및 플라스틱 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 고체 기판은 화학식 9 또는 10으로 표시되는 기를 고정화하기 위하여 활성화되어 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 아미노기와 같은 활성기가 코팅되어 있는 기판일 수 있다.
본 발명에 있어서, 고체 기판 상에 화학식 9 또는 10의 가 고정화되는 고상 물질은 당업계에 알려진 임의의 고정화 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, NH2(CH2)nNH2와 같은 아미노기로 코팅되어 있는 고체 기판 (예를 들면, 실리콘, 유리 또는 플라스틱 물질)에 1,2,4,5-벤젠 테트라카르복실산 무수물을 화학 반응시켜 기판 상에 고정화한 다음, n이1 내지 10의 정수인 NH2(CH2)nNH2인 화합물 (예, 에틸렌디아민)을 화학 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 또한, 화학식 10의 관능기가 고정화되어 있는 고체 물질은 예를 들면, 식 5의 폴리무수물을 아미노기가 코팅되어 있는 기판 상에 화학 반응시킴으로써 고정화한 한 다음, n이 1 내지 10의 정수인 NH2(CH2)nNH2인 화합물 (예, 에틸렌디아민)을 화학 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 pH는 화학식 1 내지 2의 화합물 또는 화학식 3 내지 4의 기 내의 카르복실기의 pKa 값보다 낮은 pH가 바람직하다. 구체적으로 상기 제1 pH는 2 내지 3.5일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 얻어진 물질-핵산로부터 상기 제1 pH보다 높은 제2 pH에서 핵산을 분리하는 단계를 포함한다. 핵산을 분리시키는 단계는 상기 핵산-이관능기 물질의 복합체를 혼합물로부터 분리하고 상기 제1 pH보다 높은 제2 pH를 갖는 용액 중에서 용출하는 단계를 포함한다.
제2 pH는 상기 제1 pH보다 높은 것이면 어느 것이 가능하나, 바람직하게는 pH 5 내지 10이다. 상기 핵산-물질 복합체를 용출하는데 사용되는 용액은 물 및 버퍼 등일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서는 n이 2인 화학식 3의 기가 고정화되어 있는 기판을 제조하고, pH에 따른 DNA의 결합양을 측정하였다.
먼저, 아미노기로 코팅된 유리 (Corning GAPS glass, 코닝사)를 N-메틸-2-피 롤리돈 (NMP) 중의 100 mM 1,2,4,5-벤젠 테트라카르복실산 무수물에 1 시간 동안 침지한 다음, 아세톤으로 세척하고, 진공하에서 건조하였다. 얻어진 1,2,4,5-벤젠 테트라카르복실산 무수물이 공유결합된 유리 기판을 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중의 100 mM 에틸렌디아민 중에 1 시간 동안 침지한 다음, 에탄올로 세척하였다.
얻어진 n이 2인 화학식 3의 기가 코팅된 유리 기판 상에 여러 pH (각각, 3, 7 및 10)에서, 5′말단이 Cy3로 표지된 서열번호 1의 DNA와 반응시켰다. 반응은 상기 DNA 1μM 을 포함하는 용액을 기판 상에 첨가하고 두껑을 덮고 실온에서 30 분 동안 방치함으로써 수행되었다. 이때 사용되는 버퍼 용액은 pH 3, 7 및 10에 대하여 각각 0.15 M 소듐 아세테이트, Tris 버퍼, 및 소듐 카르보네이트 버퍼였다. 결과는 pH 3, 7 및 10에 대하여 각각 0.15 M 소듐 아세테이트, Tris 버퍼, 및 소듐 카르보네이트 버퍼로 세척한 다음, 532nm (PMT 300)에서 Axon scanner (GenePix 사, 미국)를 사용하여 측정하였다. 도 1은 각각 pH 3, 7 및 10에서 결합된 DNA의 양을 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 대조군은 n이 2인 화학식 3의 관능기가 코팅되지 않은 상태의 유리 기판 즉, 아미노기로 코팅된 유리 (Corning GAPS glass, 코닝사) 기판을 사용하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, pH 3에서는 DNA가 많이 기판 상에 결합하나, pH 7 및 10에서는 그 결합량이 현저하게 줄어드는 것을 알 수 있다. 이는 용액의 pH가 증가함에 따라 표면의 전하가 +에서 -로 변환되었다는 것을 나타내는 것이다. 도 1에서 관찰된 형광강도를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1.
pH 3 5 10
기판 본 발명의 기판 4159 32 32
대조군 6927 1648 358
실시예 2
본 실시예에서는 실시예 1에서 제조된 n이 2인 화학식 3의 기가 고정화되어 있는 기판에 DNA를 pH 3에서 결합시킨 다음, 각각 pH 3, 5 및 7에서 상기 핵산-기판 복합체로부터 방출되는 DNA의 양을 측정하였다.
얻어진 n이 2인 화학식 3의 기가 코팅된 유리 기판 상에 여러 pH (3,5,7)에서, 5′말단이 Cy3로 표지된 서열번호 1의 DNA와 반응시켰다. 반응은 상기 DNA 1 μM을 포함하는 용액을 기판 상에 첨가하고 두껑을 덮고 실온에서 30 분 동안 방치함으로써 수행되었다. 이때 버퍼 용액은 0.15 M 소듐 아세테이트를 사용하였고, 반응 후 0.15 M 소듐 아세테이트로 세척한 다음, 532nm (PMT 380)에서 Axon scanner (GenePix 사, 미국)를 사용하여 측정하였다. 도 2는 pH 변화에 따라 방출되는 DNA의 양을 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 대조군은 n이 2인 화학식 3의 기가 코팅되지 않은 상태의 유리 기판 즉, 아미노기로 코팅된 유리 (Corning GAPS glass, 코닝사) 기판을 사용하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 세척 용액을 pH 3에서 순차적으로 pH를 상승시켰을 경우 본 발명의 경우 pH 7에서 80 %의 DNA가 회수된 반면 대조군은 65 % 만이 회수됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 기판의 DNA 방출 효과 즉, 회수 효과가 현저하여 DNA 분리 효율이 현저하게 높다는 것을 알 수 있다. 도 2에서 관찰된 형광강도를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2.
pH 3 5 7
기판 본 발명의 기판 15147 3588 2991
대조군 37041 16458 12602
실시예 3 : 화학식 4의 기가 고정화된 기판을 이용한 핵산의 회수
본 실시예에서는 하기 화학식 4의 기가 고정화된 기판을 제조하고, 제1 pH에서 DNA를 결합시킨 다음, 제2 pH에서 상기 DNA-기판 복합체로부터 핵산을 회수하였다.
본 실시예에서 사용된 하기 화학식 4의 기는
Figure 112004060930095-pat00011
(식 4)
식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 2인 -NH(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, m은 2이고, l은 1 내지 30,000이고, R1 과 R2의 아미노기와 카르복실기의 비율은 NH2(CH2)2NH2가 도입되는 반응 조건에 의하여 조절되었다.
기판 상에 상기 화학식 4의 관능기의 고정화는 다음과 같이 수행되었다. 먼저, 아미노기로 코팅된 유리 (Corning GAPS glass, 코닝사) 기판을 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중의 200 mM (반복 단위 기준) 폴리무수물 (Poly(ethylene-alt-maleic anhydride)) (분자량 Mw 100,000-500,0000)에 실온에서 1 시간 동안 침지한 다음, 아세톤으로 세척하고, 진공하에서 건조하였다. 얻어진 상기 폴리무수물이 결합된 유리 기판을 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중의 농도를 달리하는 에틸렌디아민 중에 실온에서 1 시간 동안 침지한 다음, 에탄올로 세척하고 건조하였다. 상기 에틸렌디아민의 농도는 각각 500 mM (실험군 1), 450 mM 및 물 50 mM (에틸렌디아민/H2O 몰비=9:1) (실험군 2), 400 mM 및 물 100 mM (에틸렌디아민/H2O 몰비=8:2) (실험군 3), 350 mM 및 물 150 mM (에틸렌디아민/H2O 몰비=6:4) (실험군 4), 150 mM 및 물 350 mM (에틸렌디아민/H2O 몰비=4:6) (실험군 5)이었다.
얻어진 m이 2이고, R1과 R2의 -OH과 에틸렌디아민 기가 여러 비율로 도입된 화학식 4의 기가 코팅된 2 장의 유리 기판 상에 pH 3에서, 5′말단이 Cy3로 표지된 서열번호 1의 DNA와 반응시켰다. 반응은 상기 DNA 1 μM을 포함하는 0.15 M 소듐 아세테이트 용액을 기판 상에 첨가하고 두껑을 덮고 실온에서 5 분 동안 방치함으로써 수행되었다. 반응 후 0.15 M 소듐 아세테이트로 각각 pH 3 및 pH 7에서 세척한 다음, 532nm (PMT 350)에서 Axon scanner (GenePix 사, 미국)를 사용하여 형광강도를 측정하였다. 형광강도 측정결과를 하기 표 3에 나타내었다. 대조군은 화학식 4의 관능기가 코팅되지 않은 상태의 유리 기판 즉, 아미노기로 코팅된 유리 (Corning GAPS glass, 코닝사) 기판을 사용하였다.
표 3.
기판 형광강도 회수율 (%)
pH 3 pH 7
대조군 28871 7899 72
실험군 1 42694 12369 71
실험군 2 42453 10028 76
실험군 3 43620 10762 75
실험군 4 43123 11143 74
실험군 5 43398 6357 85
표 3에 나타낸 바와 같이, DNA의 회수율은 실험군 5 즉, 에틸렌디아민/H2O의 몰비율이 4:6인 경우가 가장 높았다.
실시예 4 : 화학식 4의 기가 고정화된 기판을 이용한 핵산의 회수
본 실시예에서는 실시예 3에서 실험군 5 즉, 에틸렌디아민/H2O의 몰비율이 4:6로 하여 반응시켜 얻어지는 화학식 3의 관능기가 코팅된 기판을 이용하여 여러 반응 시간 동안 반응시킨 후 핵산을 분리하였다.
실험군 5의 유리 기판 상에 pH 3에서, 5′말단이 Cy3로 표지된 서열번호 1의 DNA와 반응시간을 달리하여 반응시켰다. 반응은 상기 DNA 1 μM을 포함하는 0.15 M 소듐 아세테이트 용액을 기판 상에 첨가하고 두껑을 덮고 실온에서 각각 1, 5, 10, 및 30 분 동안 방치함으로써 수행되었다. 반응 후 0.15 M 소듐 아세테이트로 각각 pH 3 및 pH 7에서 세척한 다음, 532nm (PMT 350)에서 Axon scanner (GenePix 사, 미국)를 사용하여 형광강도를 측정하였다. 형광강도 측정결과를 하기 표 4에 나타내었다. 대조군1은 화학식 4의 관능기가 코팅되지 않은 상태의 유리 기판 즉, 아미노기로 코팅된 유리 (Corning GAPS glass, 코닝사) 기판을 동일한 방법으로 사용하였다. 대조군2는 상기 DNA 1 μM을 포함하는 Qiagen (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen 사) 결합 버퍼를 피라냐 (H2O2:H2SO4=1:3) 용액 중의 아미노기로 코팅된 유리 (Corning GAPS glass, 코닝사) 기판에 첨가하고 두껑을 덮고 실온에서 30 분 동안 방치함으로써 반응시켰다. 반응 후 Qiagen 세척 버퍼로 pH 3 및 7에서 각각 세척한 다음, 532nm (PMT 350)에서 Axon scanner (GenePix 사, 미국)를 사용하여 형광강도를 측정하였다.
표 4.
기판 반응시간 (분) 형광 강도 회수율(%)
pH 3 pH 7
실험군 5 1 39305 1844 95
5 38684 5398 86
10 36810 5111 87
30 44083 5495 87
대조군1 1 26372 7332 67
5 23307 8611 63
10 24798 8273 67
30 26886 12300 54
대조군2 30 27189 7083 74
표 4에 나타낸 바와 같이, 실험군 5의 기판을 이용하는 경우 DNA 95%가 반응 1 분 이내에 회수될 수 있었다. 이는 대조군 1 및 2에 비하여 현저하게 우수한 회수율을 나타내는 장점이 있는 것이다.
실시예 5 : EtBr 염색을 통한 결합된 핵산의 확인
본 실시예에서는 실시예 3에서 실험군 5 즉, 에틸렌디아민/H2O의 몰비율이 4:6로 하여 반응시켜 얻어지는 화학식 4의 기가 코팅된 기판에 박테리아 게놈 DNA를 반응시킨 후 결합되어 있는 핵산을 EtBr 염색을 통하여 확인하였다.
실험군 5의 유리 기판 상에 각각 pH 3 및 7에서, 5′말단이 Cy3로 표지된 박테리아 게놈 DNA (E.coli, Qiagen DNA Miniprep kit 를 사용하여 추출)을 20 분 동안 반응시켰다. 반응은 상기 DNA 10ng/㎕를 포함하는 0.15 M 소듐 아세테이트 용액 을 기판 상에 첨가하고 두껑을 덮고 실온에서 20 분 동안 방치함으로써 수행되었다. 반응 후 각각 pH3과 7의 0.15 M 소듐 아세테이트로 세척한 다음, EtBr을 포함하는 용액 중에 첨가하여 핵산을 EtBr로 염색하고 오토라디오그래피를 이용하여 확인하였다. 동일한 기가 포함되고, DNA 처리를 하지 않은 시료를 대조군으로 사용하였다. 도 3은 pH 3과 pH 7에서 박테리아 게놈과 반응된 기판을 EtBr로 염색한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 길이가 긴 DNA를 정제하는 것이 가능함을 알 수 있었다.
본 발명의 핵산 분리 방법에 의하면, 보다 빠르고 높은 효율로 핵산을 분리할 수 있다.
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Claims (15)

  1. 핵산을 포함하는 시료를, 아미노기와 카르복실기를 포함하고 있고 제1 pH에서 양전하를 띠는 이관능기 물질과 제1 pH에서 접촉시켜 핵산을 상기 물질에 결합시키는 단계; 및
    상기 제1 pH 보다 높은 pH에서 상기 핵산을 방출시키는 단계를 포함하고,
    상기 물질은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 분리하는 방법:
    Figure 112006040592606-pat00023
    (식 1),
    식 중 n은 1 내지10의 정수이고, A는 피로멜릭틱(pyromellitic) 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실릭 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐) 에테르 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술폰 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,5,6-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-헥사플루오로프로판 이무수물, 시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 메틸시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 및 1,2,3,4-테트라카르복시부탄 이무수물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 테트라카르복실산 무수물과 n이 1 내지 10의 정수인 NH2(CH2)nNH2의 아미노 기의 반응에 의하여 생성되는 화합물 중 -NH(CH2)nNH2을 제외한 부분을 나타내는 기이고,
    Figure 112006040592606-pat00013
    (식 2)
    식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, R3는 탄소수 1 내지 10의 알킬기이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 물질은 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 것인 방법:
    Figure 112006065791446-pat00014
    (식 3),
    식 중 n은 1 내지 10의 정수이고,
    Figure 112006065791446-pat00015
    (식 4)
    식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, m은 1 내지 10의 정수이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산을 방출시키는 단계는 상기 핵산-이관능기 물질의 복합체를 혼합물로부터 분리하고 상기 제1 pH보다 높은 pH를 갖는 용 액 중에서 용출하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 pH는 2 내지 3.5이고, 상기 제2 pH는 5 내지 10인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 화학식 4의 화합물은 -OH 기와 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기가 2:1의 비율로 포함되어 있는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 물질은 고체 기판 상에 하기 화학식 9 또는 10으로 표시되는 기가 고정화되어 있는 고상 물질인 방법:
    Figure 112006065791446-pat00016
    (식 9),
    식 중 n은 1 내지 10의 정수이고,
    Figure 112006065791446-pat00017
    (식 10)
    식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, m은 1 내지 10의 정수이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 고체 기판은 실리콘, 유리, 및 플라스틱 물질로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 핵산을 방출시키는 단계는 상기 핵산-이관능기 물질의 복합체를 혼합물로부터 분리하고 상기 제1 pH보다 높은 pH를 갖는 용액 중에서 용출하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 제1 pH는 2 내지 3.5이고, 상기 제2 pH는 5 내지 10인 방법.
  10. 제6항 있어서, 화학식 10의 화합물은 -OH 기와 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기가 2:1의 비율로 포함되어 있는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 물질은 고체 기판 상에 하기 화학식 7 또는 8로 표시되는 기가 고정화되어 있는 고상 물질인 방법:
    Figure 112006065791446-pat00024
    (식 7),
    식 중 n은 1 내지 10의 정수이고, A는 피로멜릭틱(pyromellitic) 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실릭 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐) 에테르 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술폰 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,5,6-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-헥사플루오로프로판 이무수물, 시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 메틸시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 및 1,2,3,4-테트라카르복시부탄 이무수물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 테트라카르복실산 무수물과 NH2(CH2)nNH2 중의 아미노 기의 반응에 의하여 생성되는 화합물 중 -NH(CH2)nNH2을 제외한 부분을 나타내는 기이고,
    Figure 112006065791446-pat00025
    (식 8)
    식 중 R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기로부터 선택되고, R3은 탄소 1 내지 10의 알킬기이고, l은 1 내지 30,000의 정수이다.
  12. 제10항에 있어서, 상기 고체 기판은 실리콘, 유리, 및 플라스틱 물질로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 핵산을 방출시키는 단계는 상기 핵산-이관능기 물질의 복합체를 혼합물로부터 분리하고 상기 제1 pH 보다 높은 pH를 갖는 용액 중에서 용출하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 제1 pH는 2 내지 3.5이고, 상기 제2 pH는 5 내지 10인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 화학식 8의 화합물은 -OH 기와 n이 1 내지 10의 정수인 -NH(CH2)nNH2 기가 2:1의 비율로 포함되어 있는 것인 방법.
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