KR100829574B1 - 마이크로어레이용 기판, 그 마이크로어레이용 기판을이용하여 생분자를 분석하는 방법, 및 그 마이크로어레이용기판을 포함하는 랩온어칩 - Google Patents

마이크로어레이용 기판, 그 마이크로어레이용 기판을이용하여 생분자를 분석하는 방법, 및 그 마이크로어레이용기판을 포함하는 랩온어칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고체 기판상에 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 기가 고정화되어 있는 마이크로어레이용 기판, 상기 기판을 이용하여 생물분자를 분석하는 방법, 및 상기 기판을 포함하는 랩온 어칩에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112006080483542-pat00001
[화학식 2]
Figure 112006080483542-pat00002
상기 식에서, n, [ ] 부분의 기, R1 및 R2, R3 및 l은 각각 명세서에서 정의된 바와 같다.

Description

마이크로어레이용 기판, 그 마이크로어레이용 기판을 이용하여 생분자를 분석하는 방법, 및 그 마이크로어레이용 기판을 포함하는 랩온어칩{Microarray substrate, method of analyzing biomolecule using the microarray substrate, and lab-on-a-chip including the microarray substrate}
도 1은 pH의 변화에 따른 본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판과 DNA의 결합 여부를 나타낸 것이다.
도 2는 칩상에서 PCR을 수행하기 이전 및 이후의 기판상에서의 프로브 DNA와 표적 DNA의 결합관계를 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 프로브를 고정화시킨 대조군 마이크로어레이 및 본 발명에 따른 마이크로어레이(CRS 1 및 2) 각각을 표적 DNA와 혼성화시킨 후 관찰된 형광강도 데이터를 나타낸 것이다.
도 5a는 프로브를 고정화시킨 대조군 마이크로어레이 및 본 발명에 따른 마이크로어레이(CRS 2)를 pH 3 용액에 침지시킨 다음 표적 DNA와의 혼성화 반응을 수행한 다음 형광강도를 측정한 것이고, 도 5b는 대조군 마이크로어레이 및 본 발명에 따른 마이크로어레이(CRS 2)를 각각 pH3 용액에 침지시키지 않고, 표적 DNA와의 혼성화 반응을 수행한 다음 형광강도를 측정한 것이다.
도 6은 양성 대조군으로 용액상 PCR 반응 수행한 결과와 본 발명에 따른 CRS 비드를 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과를 비교한 것이다.
본 발명은 ｐＨ 의존성 전하 가역성 마이크로어레이용 기판, 상기 기판을 이용하여 생물분자를 분석하는 방법, 및 상기 기판을 포함하는 마이크로어레이 및 랩온 어칩(Lab-on-a-Chip; LOC) 시스템에 관한 것이다.
마이크로어레이는 특정 분자가 기판 상의 일정한 면적에 고밀도로 고정화되어 있는 것을 말한다.　 이러한 마이크로어레이에는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 마이크로어레이 등이 포함된다.　 "폴리뉴클레오티드 마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드가 각각 일정한 영역에 높은 밀도로 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다.　 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 전체가 참고로 본 명세서에 통합되어 있는 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있다.
고체 기판상에 폴리뉴클레오티드의 고정화 방식은 기판 상에서 직접적으로 합성하는 방식과, 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 일정한 위치에 고정화시키는 방법 (스팟팅 법)이 알려져 있다.　 이러한 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조방법은 예를 들면, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이 및 그의 제조방법에 관한 상기 문헌은 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어진다. 고체 기판상에 생물 질을 고정시키기 위해 스팟팅 방법이 널리 사용되고 있다.　 그러나, 스팟팅 방법은 생물분자를 공유적으로 고체 기판상에 고정화하는 데 사용되었다.　 예를 들면, 기판 상의 표면을 아미노 기와 같은 친핵성 관능기를 도입함으로써 활성화시키고, 이를 우수한 이탈기 (good leaving group)로 활성화된 폴리뉴클레오티드와 같은 생물분자와 커플링 반응시킨 다음, 반응하지 않은 반응물을 제거함으로써 생물분자를 고체 기판상에 고정화하는 과정이 널리 이용되어 왔다.
한편, pH 의존성 이온 교환물질은 핵산의 분리에 이용되어 왔다.　 예를 들면, 미국특허공개 제2001/0018513호에는 이온화가능한 기를 가지고 있는 물질로서 이온화가능한 기는 제1 pH에서 양전하를 띠고 있어 핵산과 결합할 수 있고, 상기 제1 pH보다 높은 제2 pH에서는 상기 핵산을 방출시키는 물질을 이용하는 핵산의 분리방법이 개시되어 있다. 이온화가능한 기를 가지고 있는 물질의 예로는, N-2-아세트아미도-2-아미노에탄술폰산(ACES), N-2-아세트아미도-2-이미도디아세트산(ADA),　 N-트리히드록시메틸-메틸-2-아미노에탄술폰산(TES) 및 트리히드록시메틸아미노에탄 등이 포함된다.　 또한, 미국특허 제6,310,199호에는 실리카 자성 입자 및, 방향족 탄화수소 고리, 상기 방향족 탄화수소 고리에 공유적으로 부착되어 있는 스페이서, 및 제1 말단에서 상기 실리카 자성 입자에 부착되어 있고 제2 말단에서 상기 스페이서에 부착되어 있는 링커 알킬 사슬을 포함하는 링커를 포함하는 복수 개의 제1 이온 교환 리간드를 포함하는 pH 의존성 이온 교환물질을 이용하여 핵산을 분리하는 방법이 개시되어 있다.
이에 본 발명자들은 핵산의 분리에 이용되던 pH 의존성 이온 교환물질을 마 이크로어레이용 기판에 적용하여 우수한 효과를 달성하는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 기판상에 프로브 생물분자의 고정화가 향상되며, 또한 기판상에 단백질과 표적 생물분자가 비특이적으로 결합하는 것을 감소시켜 줄 뿐만 아니라 줄 뿐만 아니라, 세포의 파괴(cell lysis) 과정, PCR 반응, 프로브와 표적 생물분자와의 혼성화 반응을 동시에 수행할 수 있는 마이크로어레이용 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로어레이용 기판을 이용하여 생물분자를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로어레이용 기판을 포함하는 랩온 어칩 시스템을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 고체 기판상에 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 기가 고정화되어 있는 마이크로어레이용 기판을 제공한다:
Figure 112006080483542-pat00003
상기 식에서,
n은 1 내지 10의 정수이고,
[ ] 부분의 기는 피로멜리틱(pyromellitic) 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실릭 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐) 에테르 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술폰 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,5,6-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-헥사플루오로프로판 이무수물, 시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 메틸시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 및 1,2,3,4-테트라카르복시부탄 이무수물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 테트라카르복실산 무수물이 양쪽에 인접한 각각의 -NH(CH2)nNH2 및 -NH(CH2)nNH-를 생성시키는 각각의 아민과의 공유결합에 의해 생성된 모이어티이며,
상기 [ ] 부분의 R10은 상기 테트라카르복실산 무수물의 종류에 따라 결정된다;
Figure 112006080483542-pat00004
상기 식에서,
R1 및 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 또는 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수)이고,
R3은 C1-10 알킬기이고,
l은 1 내지 30,000의 정수이다.
상기 본 발명의 다른 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 i) 고체 기판상에 상기 화학식 1 또는 2의 기를 고정함으로써, 마이크로어레이용 기판을 제조하는 단계; ii) 제1 pH에서, 상기 마이크로어레이용 기판에 프로브 생물 분자를 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 단계; iii) 제1 pH에서, 상기 마이크로어레이의 프로브 영역 이외의 영역에 목적 생물분자를 결합(attach)시키는 단계; iv) 제2 pH에서, 상기 결합된 목적 생물분자를 용출(elution)시킨 후 증폭하는 단계; 및 iv) 제2 pH에서, 단계 ii)에서 제조된 마이크로어레이상의 프로브 생물분자와 목적 생물분자의 혼성화 반응을 수행하는 단계를 포함하는 생물분자의 분석 방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112006080483542-pat00005
[화학식 2]
Figure 112006080483542-pat00006
상기 식에서,
n, [ ] 부분의 기, R1, R2, R3, R10, 및 l 는 각각 상기에서 정의된 바와 같다.
상기 본 발명의 또 다른 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 상기 마이크로이용 기판을 포함하는 랩온어칩을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 고체 기판상에 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 기가 고정화되어 있는 마이크로어레이용 기판을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112006080483542-pat00007
상기 식에서,
n은 1 내지 10의 정수이고,
[ ] 부분의 기는 피로멜리틱(pyromellitic) 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실릭 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐) 에테르 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술폰 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,5,6-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-헥사플루오로프로판 이무수물, 시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 메틸시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 및 1,2,3,4-테트라카르복시부탄 이무수물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 테트라카르복실산 무수물이 양쪽에 인접한 각각의 -NH(CH2)nNH2 및 -NH(CH2)nNH-를 생성시키는 각각의 아민과의 공유결합에 의해 생성된 모이어티이며,
상기 [ ] 부분의 R10은 상기 테트라카르복실산 무수물의 종류에 따라 결정된다;
[화학식 2]
Figure 112006080483542-pat00008
상기 식에서,
R1 및 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 또는 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수)이고,
R3은 C1-10 알킬기이고,
l은 1 내지 30,000의 정수이다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 기는 아미노기 및 카르복실기를 포함하는 물질로서 제1 pH서 양전하를 띠고 제2 pH에서 음전하를 띠는 이관능기 물질이다.　 이러한 물질은 화합물 자체 또는 그러한 관능기가 고체 기판 상에 고정화되어 있는 고체 물질일 수 있다.　 고체 기판은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄과 같은 플라스틱 물질, 유리, 실리콘 웨이퍼 및 이들의 개질된 기판으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 제1 pH는 화학식 1 및 2로 표시되는 기중 카르복실기의 pKa 값보다 낮은 pH가 바람직하다.　 구체적으로 상기 제1 pH는 2 내지 3.5일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.　 상기 제2 pH는 상기 제1 pH보다 높은 것이면 어느 것이 가능하나, 바람직하게는 pH 5 내지 10이다.
상기 화학식 1로 표시되는 기가 고정화되어 있는 기판과 화학식 2로 표시되는 기가 고정화되어 있는 기판은 프로브 고정화 효율, 표적 생물분자 및 단백질의 비특이적 결합 방지 등의 효과가 유사하며, 세포의 파괴(cell lysis) 과정, PCR 반응, 프로브와 표적 핵산의 혼성화 과정을 모두 기판 상에서 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 화학식 1 로 표시되는 기는 하기 화학식 3으로 표시되는 기, 화학식 2로 표시되는 기는 하기 화학식 4로 표시되는 기가 바람직하다:
Figure 112006080483542-pat00009
상기 식에서,
n은 1 내지 10의 정수이고;
Figure 112006080483542-pat00010
상기 식에서,
R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수임)이고,
m은 1 내지 10의 정수이고,
l은 1 내지 30,000의 정수이다.
화학식 1 및 2로 표시되는 기는 각각 아미노기와 카르복실기를 갖는다.
화학식 1로 표시되는 기는 제1 pH에서 양전하와 음전하가 약 2:1의 비율로 포함되어 있어 +1 양전하를 갖는 것이 바람직하고, 또한 n이 2인 화학식 3의 기가 바람직하다.
한편, 화학식 2로 표시되는 기는 R1 또는 R2에 해당하는 -OH 기와 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수임)가 약 2:1의 비율로 포함되어 있는 것이 바람직하고, 또한 m은 2이고, l은 1 내지 30,000인 화학식 4로 표시되는 기가 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이용 기판을 이용하여 생물분자의 분석방법에 관한 것이다.
먼저, 고체 기판상에 하기 화학식 1 또는 2의 기를 고정하여 마이크로어레이용 기판을 제조한다.　
[화학식 1]
Figure 112006080483542-pat00011
[화학식 2]
Figure 112006080483542-pat00012
상기 식에서,
n, [ ] 부분의 기, R1, R2, R3, R10, 및 l 는 각각 상기에서 정의된 바와 같다.
상기 고정화되는 기판은 당업계에 알려진 임의의 고정화 방법에 의하여 제조될 수 있다.　 예를 들면, 상기 화학식 1의 화합물의 관능기가 고정화된 기판은, NH2(CH2)nNH2와 같은 아미노기로 코팅되어 있는 고체 기판 (예를 들면, 실리콘, 유리 또는 플라스틱 물질)에 1,2,4,5-벤젠 테트라카르복실산 무수물을 화학 반응시켜 기판 상에 고정화한 다음, n이 1 내지 10의 정수인 NH2(CH2)nNH2인 화합물 (예, 에틸렌 디아민)을 화학 반응시킴으로써 제조될 수 있다.　 또한, 화학식 2의 화합물의 관능기가 고정화되어 있는 고체 물질의 경우는, 예를 들면 화학식 5의 기를 아미노기가 코팅되어 있는 기판 상에 화학 반응시킴으로써 고정화한 한 다음, n이 1 내지 10의 정수인 NH2(CH2)nNH2인 화합물 (예, 에틸렌디아민)을 화학 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
Figure 112006080483542-pat00013
상기 식에서,
R3은 C1-10 알킬기이고,
l은 1 내지 30,000의 정수이다.
상기 화학식 5의 바람직한 일 예는 하기 화학식 6의 기이다.
Figure 112006080483542-pat00014
상기 식에서,
m은 1 내지 10의 정수이고,
l은 1 내지 30,000의 정수이다.
상기 화학식 5의 기는 폴리무수물 중합체의 기이다. 상기 중합체는 원심분리와 같은 분리 과정에 의하여 용액으로부터 용이하게 분리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 화학식 1의 기는 화학식 3의 기인 것이 바람직하고, 화학식 3의 기 중에서 n이 2인 것이 가장 바람직하다.
[화학식 3]
Figure 112006080483542-pat00015
상기 식에서, n은 1 내지 10의 정수이다.
또한, 화학식 2의 기는 화학식 4의 기인 것이 바람직하다.
[화학식 4]
Figure 112006080483542-pat00016
상기 식에서, R1, R2, m, 및 l 는 각각 상기에서 정의된 바와 같다.
특히 화학식 4의 기중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -OH 기 또는 -NH(CH2)2NH2 기로부터 선택되고, m은 2이고, l은 1 내지 30,000인 기; 또는 R1 또는 R2에 해당하 는 -OH 기와 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수임) 가 2:1의 비율로 포함된 기가 더욱 바람직하다.
고체 기판상에 하기 화학식 1 또는 2의 화합물을 고정하여 마이크로어레이용 기판을 제조한 다음, 제1 pH에서 상기 기판에 프로브 생물 분자를 고정화하여 마이크로어레이를 제조한다.　 이때, 생물분자는 핵산인 것이 바람직하다.　 제1 pH는 화학식 1 내지 2의 화합물중 카르복실기의 pKa 값보다 낮은 pH가 바람직하다.　 구체적으로 상기 제1 pH는 2 내지 3.5일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
종래기술에 따르면, 프로브 핵산을 기판상에 고정화한 후 표적 핵산 등이 기판상에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위해 후처리 공정을 수행하는 것이 일반적이었다.　 예를 들면, 기판상에 남아있는 아민 기에 표적 DNA가 비특이적으로 결합하는 것을 막기 위해 프로브 DNA를 기판에 고정화한 후 기판을 무수 숙신산로 처리하는 등의 후처리 공정을 수행한다.
그러나, 본 발명에서는 기판상에 프로브를 고정한 후 기판상에 남아있는 아민 기를 보호하는 후처리 공정을 수행하지 않아도 표적 핵산이 기판상에 비특이적으로 결합하는 일이 현격하게 줄어들어 후처리 공정이 불필요하다.
그 다음 단계는 기판 상에 프로브 생물분자를 고정한 상기 제 1 pH에서 상기 마이크로어레이의 프로브 영역 이외의 영역에 목적 생물 분자를 결합시킨다. 이러한 단계에서는, 상기 기판 상에 고정된 화학식 1 또는 2로 표시되는 기는 제 1 pH에서 목적 생물분자를 상기 프로브와 마찬가지로 결합할 수 있는 능력이 있기 때문 에, 목적 생물 분자를 상기 마이크로어레이의 프로브 영역 이외의 영역에 결합할 수 있다. 예를 들어, 세포 중의 유전자를 목적 생물 분자로서 사용할 경우, 제 1 pH에서 세포의 파괴를 수행하고, 파괴된 세포에서 나온 목적 생물분자를 상기 마이크로어레이의 프로브 영역 이외의 영역에 결합시킬 수 있다. 목적 생물분자를 기판에 결합시킨 다음에는 목적 생물 분자 이외의 세포 파괴물(lysate)를 제거하기 위해 기판을 세척하는 것이 바람직하다.
그 다음 단계는 제 2 pH에서 상기 결합된 목적 생물 분자를 용출시킨 후 증폭시킨다. 목적 생물분자가 핵산인 경우, 본 발명에 따른 기판에 단백질의 비특이적 결합이 현저히 감소되기 때문에, PCR 반응후 핵산의 정제과정을 거치지 않고 바로 PCR 반응 생성물을 표적 핵산 시료로 직접 적용할 수 있다.　 따라서, 본 발명에 따른 기판을 이용하게 되면 기판 상에서 세포의 파괴(cell lysis) 과정, PCR 반응, 프로브와 표적 핵산의 혼성화 과정을 모두 기판상에서 수행할 수 있다.
목적 생물분자를 증폭시킨 다음, 제2 pH에서, 상기에서 제조된 마이크로어레이상의 프로브 생물분자와 목적 생물분자의 혼성화 반응을 수행한다.
상기 제2 pH는 상기 제1 pH보다 높은 것이면 어느 것이 가능하나, 바람직하게는 pH 5 내지 10이다. 상기 핵산-물질 복합체를 용출하는데 사용되는 용액은 물 및 버퍼 등일 수 있다.
프로브 및 목적 생물분자의 혼성화 반응을 수행한 후, 형광강도 데이터 등으로 생물분자의 분석한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이용 기판을 포함하는 랩온어칩에 관한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.
실시예 1 : 본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판의 제조
(1) 본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판의 제조
본 실시예에서는 n이 2인 화학식 3으로 표시된 기가 고정화되어 있는 기판을 제조하였다.　
먼저, 감마-아미노프로필트리에톡시실란(GAPS)로 코팅된 실리콘 웨이퍼 기판(LG siltron, 한국)을 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중의 100 mM 1,2,4,5-벤젠 테트라카르복실산 무수물에 1 시간 동안 침지한 다음, 아세톤으로 세척하고, 진공하에서 건조하였다.　 얻어진 1,2,4,5-벤젠 테트라카르복실산 무수물이 공유결합된 실리콘 웨이퍼를 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 중의 100 mM 에틸렌디아민 중에 1시간 동안 침지한 다음, 에탄올로 세척하여 건조함으로써 본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판을 제조하였다(이하, "시험 기판"이라고 칭한다).
(2) 대조군 기판의 준비
이하, 실시예에서는 대조군 기판으로서 감마-아미노프로필트리에톡시실란(GAPS)로 코팅된 실리콘 웨이퍼 기판을 사용하였다.
실시예 2 : 기판상에 프로브 DNA 를 고정화함으로써 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조
(1) 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조(프로브 고정화 후의 후처리 포 함)
상기 실시예 1에서 제조된 시험 기판상에 5'말단이 관능기화된 DNA를 이용하여 DNA가 상기 기판상에 스팟의 그룹으로 배열된 DNA 마이크로어레이를 제조하였다.
먼저 스팟팅 용액을 제조하였는데, 용액의 조성은 포름아마이드(formamide) 50%, 인산완충용액(100 mM, pH 3)중의 폴리에틸렌글리콜(분자량 10,000) 용액 25% , 및 5' 말단이 아민기(NH2)로 관능기화된 서열번호: 1의 폴리뉴클레오티드 프로브 용액 25%로 이루어졌으며, DNA 최종 농도가 20μM이 되도록 하였다.
이렇게 얻어진 스팟팅 용액을 상기 유리 기판 상에 카르티션 (Cartesian) 사 Pix5500 스팟터를 이용하여 스팟 당 500 pl 씩 스폿팅하고, 70℃의 온도, 40% 습도에서 1시간 동안 항온 항습기 내에서 고정화 반응을 수행하였다. 반응이 종결된 후, 상기 실리콘 웨이퍼 기판을 증류수로 세척하였다.　
그런 다음, 기판에 남아있는 아민기를 무수 숙신산 (차단제)로 보호한 뒤 에탄올로 세척하는 후처리 공정을 수행하였다.　
후처리 공정을 수행한 후 기판을 스핀 건조하여 프로브 폴리뉴클레오티드가 고정화된 본 발명에 따른 마이크로어레이(이하, "CRS 1"이라 함)를 얻었다.　 얻어진 마이크로어레이는 각각 9개의 스팟으로 이루어지며, 스팟이 300 ㎛의 간격으로 배열되어 있다.
한편, 대조군 마이크로어레이는 상기 실시예 1(2)에서 준비된 감마-아미노프 로필트리에톡시실란(GAPS)로 코팅된 실리콘 웨이퍼 기판을 사용하여 상기와 동일한 방법을 수행함으로써 제조되었다.
(2) 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이 제조(프로브 고정화 후의 후처리 배제)
실시예 1에서 제조된 본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판을 이용하여 후처리 공정을 수행하지 않은 점을 제외하고는 상기 (1)과 동일한 방법을 수행한 본 발명에 따른 마이크로어레이(이하, "CRS 2"라 함)를 제작하였다.
실시예 3: 프로브 폴리뉴클레오티드의 고정화 효율
본 실시예에서는 실시예 2에서 제조된 프로브 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용하여, 기판상에 고정화된 프로브 폴리뉴클레오티드와 표적 핵산 간의 혼성화 반응을 일으키고 그 결과를 검출함으로써, 본 발명의 방법에 따라 제작된 마이크로어레이에 프로브의 고정화 효율을 확인하였다.
먼저, 분석에 사용될 표적 DNA는 5' 말단이 -NH2-Cy3인 서열번호:2의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.　 15㎕의 표적 DNA(100pM)를 1.5mL 튜브에 넣고, 각 10초 동안 볼텍싱하고 원심분리하였다.　
이를 94℃의 가열 블록(heating block)에서 5분 동안 변성시킨 뒤, 얼음에 넣어두었다.　 그런 다음, 얼음에 넣어둔 상태에서 혼성화 완충용액(NaH2PO4H2O 138g, NaCl 876g, 0.5M EDTA 200ml, 10N NaOH 100ml의 혼합액을 희석한 용액) 16㎕를 넣어 총 32 ㎕ 가 되게 하였다.　 10초 동안 볼텍싱을 하고 원심분리기 10초 동안 수행한 후 본 발명에 따른 CRS 1 및 2, 및 대조군 마이크로어레이에 42℃에서 1시간 동안 반응시켰다.　 반응 후, 세척액 I(3XSSPET) 및 세척액 II(1XSSPET)으로 각각 5분씩 세척하여 건조한 후, 액손 인스투르먼트 (Axon Instruments) 사의 GenePix 4000B 스캐너로 측정하여 이미지를 생성하였으며, 진픽스 프로소프트웨어 (GenePix Pro software) (Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다.　 얻어진 이미지 데이터와 형광강도 데이터를 표 1 및 도 3에 나타내었는 바, 이러한 결과는 532 nm(PMT560 또는 PMT500Z)에서 관찰된 형광 강도를 나타내는 것이다.
　 대조군 마이크로어레이 (PMT 560) CRS 1(후처리 有) CRS 2(후처리 無)
PMT560 PMT500 PMT560 PMT500
강도(Intensity) 31345 65500 43100 65500 54290
배경(Backgroud) 57 279 54 281 53
그 결과, 본 발명에 따른 마이크로어레이는 후처리 여부에 관계없이 프로브 뉴클레오티드의 고정화가 대조군에 비하여 현저히 우수한 것을 확인하였다.
실시예 4: 후처리 부재에 따른 표적 DNA 의 비특이적 결합 확인
상기 실시예 3에서 수행한 방법과 동일하게 수행한 후, 배경의 이미지 데이터와 형광강도를 표 2 및 도 4에 나타내었는 바, 이러한 결과는 532 nm(PMT560)에서 관찰된 형광 강도를 나타내는 것이다.
기판 1 2 평균
대조군 마이크로어레이 230 241 235
CRS 1(후처리 有) 254 274 264
CRS 2(후처리 無) 266 301 283
상기 결과에 따르면, 본 발명에 따른 마이크로어레이의 경우 표적 DNA와의 혼성화 반응을 수행하게 되면 후처리 공정을 거치지 않은 경우(CRS 2)와 후처리 공정을 거친 경우(CRS 1)와 유사한 형광 강도를 나타내는 바, 이로써 본 발명에 따른 기판을 사용하게 되면 프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화 조건에서 표적 DNA가 기판으로의 비특이적으로 결합하는 것이 방지됨을 확인할 수 있다.
실시예 5: pH 3에서의 프로브의 손상 여부 확인
본 실시예에서는 기판상에 고정되어 있는 프로브가 pH 3의 환경에서 손상되는지 여부를 표적 DNA와의 혼성화 정도를 측정함으로써 확인하였다.
(1) 상기 실시예 2에서 제조된 프로브 DNA가 고정화된 본 발명에 따른 마이크로어레이(CRS 2, 후처리 無) 및 대조군 마이크로어레이를 pH 3의 결합 버퍼(100mM phosphate buffer)에 5분 동안 침지시켰다.　 그런 다음 실시예 3에 기재된 것과 동일한 표적 DNA(500 pM, 5' 말단이 -NH2-Cy3인 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드)를 동량의 혼성화 버퍼(6x SSPE-0.1% Triton X-100)와 섞은 후, 각각 마이크로어레이 상에 적용하였다.　 42℃에서 1시간 동안 배양한 후 세척 버퍼 I (3x SSPE-Triton X-100 0.005%)로 5분 동안 세척한 다음 세척 버퍼 II (1x SSPE-Triton X-100 0.005%)로 5분간 세척하였다.　 15분 동안 상온에서 건조한 다음, 액손 인스투르먼트 (Axon Instruments) 사의 GenePix 4000B 스캐너를 이용하여 532 nm(PMT 560)에서 측정하여 이미지를 생성하였으며, 진픽스 프로소프트웨어(GenePix Pro software)(Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 이미지 분석을 수행하였는 바, 그 결과는 하기 표 3과 같다(도 5a 참조).　
(2) 한편, 상기 실시예 2에서 제조된 프로브 DNA가 고정화된 본 발명에 따른 마이크로어레이(CRS 2, 후처리 無) 및 대조군 마이크로어레이를 pH 3의 버퍼에 침지시키지 않은 점을 제외하고는 상기 (1)과 동일한 방법을 수행하여 이미지 분석을 수행하였는 바, 그 결과는 하기 표 3과 같다(도 5b 참조).
기판 pH 3의 버퍼에 침지한 경우 pH 3의 버퍼에 침지하지 않은 경우
강도 배경 강도 배경
대조군 마이크로어레이(PMT 560) 31345 60 42653 57
CRS 2(PMT 560) 65500 281 65500 279
CRS 2(PMT 500) 53107 53 54290 54
상기 결과에 따르면, 본 발명에 따른 마이크로어레이의 경우 프로브가 고정화된 기판을 pH 3의 환경에 노출한 경우라도 표적 DNA와의 혼성화 정도는 pH3의 환경에 노출하지 않은 경우와 유사하므로, 마이크로어레이에 고정화된 프로브는 pH 3의 조건에서도 손상되지 않음을 확인하였다.
실시예 6: PCR 반응 효율의 확인
본 실시예에서는 실리콘 웨이퍼 기판 대신 실리카 비드를 사용한 점을 제외하고는 실시예 1(1)에 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여 CRS 비드를 제조하였다.
제조된 CRS 비드에 실시예 2에 기재된 마이크로어레이 스팟팅 방식과 동일한 방법으로 서열번호: 3의 프로브 DNA를 고정화하였다.　 (본 실시예에서는 후처리 공정을 수행하지 않았다.)
이 비드에서 표적 DNA(스테필로코커스 아우레우스스(Staphylococcus aureus) gDNA)와 혼성화 반응을 수행한 후, PCR 완충액을 이용하여 95℃에서 1분 동안 표적 DNA를 비드로부터 용리시킨 다음 그 용리액으로 PCR을 수행한 후, 그 반응 효율을 확인하였다.　
음성 대조군으로, 상기 CRS 비드에 혼성화반응을 수행한 후, PCR 완충액을 이용하여 상온에서 1분 동안 표적 DNA를 비드로부터 용리시킨 다음 그 용리액으로 PCR을 수행한 후, 그 반응 효율을 확인하였다.
양성 대조군으로, 통상적으로 이용되는 용액 상(solution phase) PCR 반응을 수행한 후, 그 반응 효율을 비교하였다.　
PCR 반응은, PCR 완충액(10X PCR buffer, Solgent) 10 ㎕, 용리된 용액(주형) 5 ㎕, 프라이머 0.68μM(정방향 프라이머: 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드, 역방향 프라이머: 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드), 0.25mM dNTP, 0.5unit의 Taq 중합효소를 포함하는 총 부피 50 ㎕에서 PCR 반응기(GeneAmp(등록상표) thermocycler, Applied Biosystems사)에서 25주기 동안 수행하였다.
PCR 반응은, 95℃에서 1 분 동안 변성시킨 후, 95℃에서 5초, 62℃에서 13초 및 72℃에서 15초를 25주기 수행한 후, 72에서 1분 동안 연장함으로써 수행하였다.　
DNA 증폭 후, Lab chip(Agilent사)을 이용하여 수율을 정량하였는 바, 그 결과는 양성 대조군은 4.1ng/l, 음성 대조군은 1.4ng/㎕ 및 본 발명은 4.7ng/㎕이었다.
그 결과, 용액 상 PCR(solution phase PCR)을 수행한 양성 대조군(positive control)보다 본 발명에 따른 경우(가열-CRS)에 PCR 반응 생성물의 수율이 우수한 것으로 확인되었다(도 6).　 따라서, 본 발명에 따른 마이크로어레이을 포함하는 경우, 기판상에서 세포 파괴, 핵산 정제, PCR 반응을 동시에 수행하는 칩을 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판을 사용하게 되면, 프로브의 고정화 효율을 향상시킴과 동시에, 표적 생물분자 및 단백질의 비특이적 결합을 막아주며 프로브를 기판에 고정화한 후에 어떠한 후속공정 없이 정제되지 않은 PCR 시료를 직접 기판에 적용할 수 있어, 공정의 단순화를 달성함으로써 적은 비용으로 칩을 제작하고 생물 분자를 분석할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
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Claims (23)

  1. 고체 기판상에 하기 화학식 1로 표시되는 기가 고정화되어 있는 마이크로어레이용 기판:
    [화학식 1]
    Figure 112006080483542-pat00017
    상기 식에서,
    n은 1 내지 10의 정수이고,
    [ ] 부분의 구조는 피로멜리틱(pyromellitic) 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실릭 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,2',3,3'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실릭 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐) 에테르 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술폰 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 1,2,5,6-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실릭 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-헥사플루오로프로판 이무수물, 시클로부탄테트라카르복실릭 이무수물, 메틸시클로부탄 테트라카르복실릭 이무수물, 및 1,2,3,4-테트라카르복시부탄 이무수물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 테트라카르복실산 무수물이 양쪽에 인접한 각각의 -NH(CH2)nNH2 및 -NH(CH2)nNH-를 생성시키는 각각의 아민과의 공유결합에 의해 생성된 모이어티이며,
    상기 [ ] 부분의 R10은 상기 테트라카르복실산 무수물의 종류에 따라 결정된다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 기가 하기 화학식 3으로 표시되는 기인 것을 특징으로 하는 기판:
    <화학식 3>
    Figure 112006080483542-pat00018
    상기 식에서, n은 1 내지 10의 정수이다.
  3. 제2항에 있어서, n이 2인 것을 특징으로 하는 기판.
  4. 하기 화학식 2로 표시되는 기가 고정화되어 있는 마이크로어레이용 기판:
    <화학식 2>
    Figure 112006080483542-pat00019
    상기 식에서,
    R1 및 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 또는 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수)이고,
    R3은 C1-10 알킬기이고,
    l은 1 내지 30,000의 정수이다.
  5. 제4항에 있어서, 화학식 2로 표시되는 기가 하기 화학식 4로 표시되는 기인 것을 특징으로 하는 기판:
    <화학식 4>
    Figure 112007082796597-pat00020
    상기 식에서, R1과 R2는 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 -OH 기 및 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수임)이고,
    m은 1 내지 10의 정수이고,
    l은 1 내지 30,000의 정수이다.
  6. 제5항에 있어서, R1과 R2는 각각 독립적으로 -OH 기 또는 -NH(CH2)2NH2 기로부터 선택되고, m은 2이고, l은 1 내지 30,000의 정수인 것을 특징으로 하는 기판.
  7. 제5항에 있어서, R1 또는 R2에 해당하는 -OH 기와 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수임)가 2:1의 비율로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 기판.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판은 실리콘, 유리, 및 플라스틱 물질로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기판.
  9. i) 고체 기판상에 하기 화학식 1의 기를 고정함으로써, 마이크로어레이용 기판을 제조하는 단계; ii) 제1 pH에서, 상기 마이크로어레이용 기판에 프로브 생물 분자를 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 단계; iii) 제1 pH에서, 상기 마이크로어레이의 프로브 영역 이외의 영역에 목적 생물분자를 결합(attach)시키는 단계; iv) 제2 pH에서, 상기 결합된 목적 생물분자를 용출(elution)시킨 후 증폭하는 단계; 및 iv) 제2 pH에서, 단계 ii)에서 제조된 마이크로어레이상의 프로브 생물분자와 목적 생물분자의 혼성화 반응을 수행하는 단계를 포함하는 생물분자의 분석 방법:
    <화학식 1>
    Figure 112007082796597-pat00021
    상기 식에서,
    n 및 [ ] 부분의 기는 각각 제1항에서 정의된 바와 같다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 화학식 1의 기가 하기 화학식 3의 기인 것을 특징으로 하는 방법:
    <화학식 3>
    Figure 112006080483542-pat00022
    상기 식에서, n은 1 내지 10의 정수이다.
  11. 제10항에 있어서, n이 2인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 pH는 2 내지 3.5이 고, 상기 제2 pH는 5 내지 10인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판은 실리콘, 유리, 및 플라스틱 물질로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물분자가 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. i) 고체 기판상에 하기 화학식 2의 기를 고정함으로써, 마이크로어레이용 기판을 제조하는 단계; ii) 제1 pH에서, 상기 마이크로어레이용 기판에 프로브 생물 분자를 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 단계; iii) 제1 pH에서, 상기 마이크로어레이의 프로브 영역 이외의 영역에 목적 생물분자를 결합(attach)시키는 단계; iv) 제2 pH에서, 상기 결합된 목적 생물분자를 용출(elution)시킨 후 증폭하는 단계; 및 iv) 제2 pH에서, 단계 ii)에서 제조된 마이크로어레이상의 프로브 생물분자와 목적 생물분자의 혼성화 반응을 수행하는 단계를 포함하는 생물분자의 분석 방법:
    <화학식 2>
    Figure 112007082796597-pat00023
    상기 식에서,
    R1, R2, R3 및 l은 각각 제4항에서 정의된 바와 같다.
  16. 제15항에 있어서, 상기 화학식 2의 기가 하기 화학식 4의 기인 것을 특징으로 하는 방법:
    <화학식 4>
    Figure 112006080483542-pat00024
    상기 식에서,
    R1, R2, m 및 l 은 각각 제5항에서 정의된 바와 같다.
  17. 제16항에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 -OH 기 또는 -NH(CH2)2NH2 기로부터 선택되고, m은 1 내지 10의 정수이고, l은 1 내지 30,000인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 -OH 기 또는 -NH(CH2)2NH2 기로부터 선택되고, m은 2이고, l은 1 내지 30,000인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, R1 또는 R2에 해당하는 -OH 기와 -NH(CH2)nNH2 기(이때, n이 1 내지 10의 정수임) 가 2:1의 비율로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 pH는 2 내지 3.5이고, 상기 제2 pH는 5 내지 10인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판은 실리콘, 유리, 및 플라스틱 물질로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 생물분자가 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항 또는 제4항에 따른 마이크로어레이용 기판을 포함하는 랩온 어칩.
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