KR100738083B1 - 마이크로어레이용 기판 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리무수물 중합체 표면을 갖는 고체 지지체에, 작용기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 코팅된 마이크로어레이용 기판 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판을 사용하게 되면, 프로브의 고정화 효율을 향상시킴과 동시에 표적 생물분자 및 단백질의 비특이적 결합을 막아주므로, 프로브를 기판에 고정한 후에 후처리 공정 없이 정제되지 않은 PCR 시료를 직접 기판에 적용할 수 있어, 공정의 단순화를 달성함으로써 적은 비용으로 칩을 제작하고 생물 분자를 분석할 수 있다.

Description

마이크로어레이용 기판 및 그의 제조방법{A substrate used in a microarray and a method for preparing the same}
도 1은 감마-아미노프로필트리에톡시실란(GAPS)이 코팅된 고체 지지체에 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)을 고정화시키는 반응을 나타낸 것이다.
도 2는 폴리에틸렌 글리콜에 아민기를 도입하는 반응을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3d는 폴리에틸렌 글리콜의 표면에 아민기를 도입하는 반응에서의 시작 화합물인 화학식 1의 화합물(도 3a), 중간 산물인 화학식 2 및 3의 화합물(도 3b 및 3c), 및 최종 산물인 화학식 4의 화합물(도 4) 각각의 1H NMR 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물) 표면을 갖는 고체 지지체에, 아민기가 도입된 폴리에틸렌글리콜이 코팅되는 과정을 도시한 것이다.
도 5a 및 5b는 프로브가 고정화된 대조군 마이크로어레이 1 및 본 발명에 따른 마이크로어레이 1 각각을 표적 DNA와 혼성화시킨 후 관찰된 형광 강도 데이터를 나타낸 것이다. (도 5b의 강도는 형광 강도(RFU)를 의미한다.)
도 6은 본 발명에 따른 기판 및 대조군 기판 상에 FITC가 표지된 BSA를 적용시킨 후 관찰된 형광 강도 데이터를 나타낸 것이다. (도 6의 강도는 형광 강도 (RFU)를 의미한다.)
도 7은 프로브 고정화 이후 기판상에 남아있는 아민기를 보호하는 후처리 공정을 수행하지 않고 대조군 마이크로어레이 2 및 본 발명에 따른 마이크로어레이 2 각각과, 증폭 후 정제과정을 거치지 않은 표적 DNA 시료와의 혼성화 반응 이후 관찰된 형광 강도 데이터를 나타낸 것이다.
본 발명은 마이크로어레이용 기판 및 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 폴리무수물 중합체 표면을 갖는 고체 지지체에, 작용기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 코팅된 마이크로어레이용 기판 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
마이크로어레이는 특정 분자가 기판 상에 일정한 면적에 고밀도로 고정화되어 있는 것을 말한다. 이러한 마이크로어레이에는, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 마이크로어레이 등이 포함된다. 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관해서는, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호 등에 개시되어 있다.
고체 기판상에 폴리뉴클레오티드의 고정화 방식은 기판 상에서 직접적으로 합성하는 방식과, 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 일정한 위치에 고정화시키는 방법 (스팟팅 법)이 알려져 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조방법은 예를 들면, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이 및 그의 제조방법에 관한 상기 문헌은 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어진다. 스팟팅 방법이 널리 사용되고 있다. 그러나, 스팟팅 방법은 생물분자를 공유적으로 고체 기판상에 고정화하는 데 사용되었다. 예를 들면, 기판 상의 표면을 아미노 기와 같은 친핵성 관능기로 활성화시키고, 이를 좋은 이탈기 (good leaving group)로 활성화된 폴리뉴클레오티드와 같은 생물분자와 커플링 반응시킨 다음, 반응하지 않은 반응물을 제거함으로써 생물분자를 고체 기판상에 고정화하는 과정이 널리 이용되어 왔다.
또한, 폴리에틸렌글리콜은 친수성 화합물로서 마이크로어레이에 사용된 예가 있다. 예를 들면, 미국특허공개 제2003-0108917A1호에는 말단에 에폭시기를 가진 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체로 구성되는 히드로겔에 프로브 폴리뉴클레오티드를 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 프로브의 고정화 효율을 향상되며 표적 생물분자 및 단백질이 기판상에 비특이적으로 결합하는 것을 감소시켜 주는 마이크로어레이용 기판을 제공하는 것이다.
본 발명은 다른 목적은 상기 마이크로어레이용 기판을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로어레이용 기판에 프로브 생물분자를 고정화시킨 마이크로어레이 및 상기 마이크로어레이를 이용하여 표적 생물분자를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 폴리무수물 표면을 갖는 고체 지지체에, 작용기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 코팅된 마이크로어레이용 기판을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 다른 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 (a) 아민기를 포함하는 물질로 코팅된 고체 지지체를 준비하는 단계; (b) 상기 고체 지지체 표면에 폴리무수물을 고정화시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 폴리무수물이 고정화된 고체 지지체에, 작용기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 코팅하는 단계를 포함하는 마이크로어레이용 기판의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 또 다른 목적을 이루기 위하여, 본 발명은 폴리무수물 중합체 표면을 갖는 고체 지지체에, 작용기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 코팅된 마이크로어레이용 기판에 프로브 생물분자를 고정화한 마이크로어레이 및 이러한 마이크로어레이를 이용하여 생물분자를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판을 사용하게 되면, 프로브의 고정화 효율을 향상시킴과 동시에, 표적 생물분자 및 단백질의 비특이적 결합을 막아주며, 프로브를 기판에 고정한 후에 후처리 공정 없이 정제되지 않은 PCR 시료를 직접 기 판에 적용할 수 있어, 공정의 단순화를 달성함으로써 적은 비용으로 칩을 제작하고 생물 분자를 분석할 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 기판은, 고체 지지체 표면을 폴리무수물로 변형시킨 다음, 작용기를 갖는 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 화합물로 코팅된 것이다.
본 발명에 있어서, 고체 지지체의 재질은 특별하게 한정되는 것은 아니고, 고체상의 것으로 표면을 제공할 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 폴리올레핀과 같은 플라스틱 물질, 유리, 실리콘 웨이퍼 및 이들의 개질된 기판이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 고체 지지체는 아민기, 티올기 또는 히드록시기와 같은 수소 결합 공여능을 갖는 관능기를 갖는 것으로, 기판 재질의 특성상 그러한 관능기를 가지고 있거나, 코팅과 같은 화학적 또는 물리적 처리에 의하여 그러한 관능기가 부가된 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 고체 지지체는 아민 작용기를 갖는 물질로 코팅된 것이 바람직하며, 이러한 아미노기를 갖는 화합물로는 감마-아미노프로필트리에톡시실란 (GAPS), 감마-아미노프로필디에톡시 실란 (GAPDES) 및 아미노헥실기가 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 바람직한 고체 지지체는 감마-아미노프로필트리에톡시실란으로 코팅된 것이다.
본 발명에 따른 기판의 제조에 사용되는 폴리무수물로는 폴리(에틸렌-그래프트-말레산 무수물)(poly(ethylene-graft-maleic anhydride)), 폴리(이소부틸렌-알 트-말레산 무수물)(poly(isobutylene-alt-maleic anhydride), 폴리[(이소부틸렌-알트-말레미드)-co-이소부틸렌-알트-말레산 무수물](poly[(isobutylene-alt-malemide)-co-isobutylene-alt-maleic anhydride]) 등이 있으며, 바람직하게는 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)(Poly(ethylene-alt-maleic anhydride)이다. 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)의 경우 그 분자량은 128 내지 10,000,000인 것이 바람직하며, 100,000 내지 500,000인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서, 폴리무수물이 고정된 고체 지지체를, 작용기가 도입된 (폴리)에틸렌 글리콜 화합물로 코팅한다. 여기서, (폴리)에틸렌 글리콜 화합물에 도입된 작용기는 아민기, 티올기, 알코올기, 에폭시기 또는 에스테르기인 것이 바람직하며, 아민기인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 분자량은 60 내지 10,000,000, 바람직하게는 200 내지 1,000,000, 더욱 바람직하게는 200 내지 10,000이다.
또한 상기 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 화합물은 방사형(star) 또는 선형의 분자일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 아민기를 포함하는 물질로 코팅된 고체 지지체를 준비하는 단계; (b) 상기 고체 지지체 표면에 폴리무수물을 고정화시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 폴리무수물이 고정화된 고체 지지체에, 작용기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 코팅하는 단계를 포함하는 마이크로어레이용 기판의 제조방법을 제공하는 것이다.
이러한 기판을 제조하기 위하여, 먼저 아민기를 포함하는 물질(바람직하게 는, 감마-아미노프로필트리에톡시실란, 감마-아미노프로필디에톡시 실란 또는 아미노헥실기이고, 가장 바람직하게는 감마-아미노프로필트리에톡시실란)로 코팅된 고체 지지체를 준비한다. 이 단계는, 아민기를 갖는 기판을 상업적으로 구입하거나, 코팅과 같은 화학적 또는 물리적 처리에 의하여 그러한 아민기를 부가하는 공정을 통해 상기와 같은 고체 지지체를 준비할 수 있다.
아민기를 포함하는 물질로 코팅된 고체 지지체가 준비되면, 폴리무수물(바람직하게는, 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물))을 상기 고체 지지체 표면에 고정화시킨다(도 1 참조). 일반적으로, 상기 폴리무수물은 고체 지지체 표면에 존재하는 아민 작용기에 연결됨으로써 고정화된다.
고체 지지체 표면에 폴리무수물이 고정화되면, 아민기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜로 상기 고체 지지체 표면을 코팅한다. 이 단계에서 아민기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 화합물은 폴리무수물로 코팅된 고체 지지체 표면과 반응하는데, 구체적으로 폴리무수물 중의 무수물 잔기는 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 화합물중의 아민기와 반응하여 카르복실기를 노출시키게 된다. 그 결과, 본 발명에 따른 기판의 표면에는 많은 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 아민기 및 카르복실기가 노출되게 된다. 아민기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜은 당업계에 통상적으로 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 상기 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜은 가능한 많은 아민기를 포함하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 제조된 마이크로어레이용 기판은, 그 표면에 아민기가 풍부하여 프로브 생물분자의 고정화 능력이 향상되며, 또한 그 표면의 에틸렌글리콜 및 카르복실기는 혼성화 반응의 pH 조건하에서 고정화된 프로브 외의 기판 표면에 표적 생물분자가 비특이적으로 흡착되는 현상을 방지하고 단백질이 기판에 비특이적으로 결합하는 것도 방지하기 때문에, 프로브 고정후 배경 차단 (backgrourd capping) 공정 등의 후처리 공정이나 세포 파괴(cell lysis) 및 PCR 반응 이후 정제 단계를 거치지 않고 바로 분석 혼성화 공정을 수행할 수 있게 되어 전체 공정을 단순화할 수 있어 적은 비용으로 칩을 제작하고 생물 분자를 분석할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 기판에 프로브 생물분자를 고정화시킨 마이크로어레이 및 상기 마이크로어레이를 이용하여 표적 생물분자를 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 생물분자는 생물로부터 유래하는 화합물로서, 예를 들면, 핵산, 단백질, 다당류 및 그의 조합으로 이루어지는 분자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 핵산이다. 이러한 핵산에는, DNA 또는 RNA가 포함된다. 본 발명에 있어서, 고체 기판 상에 고정화되는 생물분자는 일반적으로 분석하고자 하는 표적 분자와 특이적 반응하는 특성을 가지고 있는 것이 일반적이다. 예를 들면, 상기 생물분자가 핵산인 경우 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 핵산과 혼성화 반응을 통하여 상호반응할 수 있다. 상기 생물분자가 단백질인 경우, 항원 및 항체 반응, 리간드 및 수용체 사이의 상호반응, 효소와 기질 사이의 상호 반응을 통하여 서로 특이적으로 상호작용할 수 있다. 또한, 상기 생물분자가 다당류인 경우, 다당류를 인지하는 렉틴(lectin)과 같은 단백질 또는 항체에 의하여 특이적으로 인지될 수 있다. 이러한 생물분자와 표적 분자의 특이적 상호작용과 이러한 상호작용의 결과를 검출할 수 있는 검출시스템을 이용하여, 본 발명의 생물분자를 기판상에 고정화하는 방법에 의하여 얻어지는 생물분자 마이크로어레이를 여러 가지 분석에 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 고정화에 사용되는 생물분자의 농도는 각각의 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 또한 얻고자 하는 데이터의 종류에 따라 달라 수 있다. 따라서, 반응에 사용되는 생물분자의 농도는 특별하게 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에서, 생물분자가 DNA인 경우, 20 μM 내지 100 μM의 농도로 사용될 수 있으나 이러한 농도 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 기판상에 생물분자를 고정화하는 방법은 종래 알려진 DNA 또는 단백질의 마이크로어레이를 제조하기 위하여 사용되는 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 이러한 마이크로어레이의 제조방법에는 일반적으로 포토리소그래피를 이용하는 방법이 알려져 있다. 포토리소그래피를 이용하는 경우, 제거가능한 기로 보호된 단량체가 도포된 기판 표면 상의 일정한 영역을 에너지 원에 노출시켜 보호기를 제거하고, 제거가능한 기로 보호된 단량체를 커플링시키는 단계를 반복함으로써, 폴리뉴클레오티드의 어레이를 제조할 수 있다. 이 경우, 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이 상에 고정화되는 폴리뉴클레오티드는 단량체를 하나씩 연장시키는 방식으로 합성하거나, 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 일정한 위치에 고정화시키는 방법에 의하여 고정화될 수 있다(spotting 법).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.
실시예 1 : 본 발명에 따른 기판 및 대조군 기판의 제조
(1) 본 발명에 따른 기판의 제조
가. 감마-아미노프로필트리에톡시실란으로 코팅된 실리콘 기판 표면 상에 폴리무수물의 고정화
본 발명에 따른 기판을 제조하기 위해, 먼저 감마-아미노프로필트리에톡시실란(GAPS)로 코팅된 실리콘 웨이퍼 기판(엘지 실트론, 한국)을 N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 중의 200 mM (반복 단위 기준) 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)(분자량 100,000 내지 500,000)에 실온에서 1 시간 동안 침지한 다음, 아세톤 및 에탄올로 세척하고, 진공 하에서 건조하였다(도 1 참조).
나. 아민기가 도입된 폴리에틸렌 글리콜의 제조
폴리에틸렌 글리콜을 기본 골격으로 하고 아민기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 제조하였는 바, 그 구체적인 제조 방법은 도 2에 도시되어 있다.
화학식 2의 화합물의 제조
출발물질인 화학식 1의 화합물인 폴리에틸렌 글리콜(EO/OH=15/4)(1당량)을 트리에틸아민(TEA)(5g, 6당량), DMF 용매(20ml) 및 토실클로라이드(TsCl)(7.1g, 6당량)의 존재하에서 120℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography(TLC); 용리액 조성: CHCl3중의 10% 메탄올)로 출발물질인 폴 리에틸렌 글리콜이 모두 제거되었음을 확인하였다.
그런 다음, 반응용액을 메틸렌 클로라이드(10ml)로 희석하고 분별 깔대기로 옮겼다. 분별 깔대기에서, 물을 이용해 DMF 및 메틸렌 클로라이드를 추출해 내고, 회전식 증발장치(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 제거한 후 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피는 컬럼에 실리카겔을 충전시키고 가압한 다음, 실리카겔위에 상기 용매가 제거된 추출물을 로딩한뒤 10% 메탄올/90% 클로로포름의 용매를 이용하여 공기로 밀어내어 수행되었다. 그 결과, 화학식 2의 화합물을 제조하였다.
화학식 3의 화합물의 제조
DMF중에서 화학식 2의 화합물(1당량) 및 소듐 아자이드(NaN3)(10당량)를 TEA(10당량)의 존재하에서 100℃에서 밤새도록 반응시킨 후, 박층 크로마토그래피(용리액 조성: CHCl3중의 8% 메탄올)로 화학식 2의 화합물이 제거되었음을 확인하였다.
그런 다음, 반응용액을 메틸렌 클로라이드(10ml)로 희석하고 분별 깔대기로 옮겼다. 분별 깔대기에서, 물을 이용해 DMF 및 메틸렌 클로라이드를 추출해 내고, 회전식 증발장치를 이용하여 용매를 제거한 후 상기와 동일한 방법으로 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화학식 3의 화합물을 제조하였다.
화학식 4의 화합물의 제조
메탄올 용매(20ml) 및 Pd/C 촉매(10당량)의 존재하에서, 화학식 3의 화합물 (5g)과 H2를 반응시켜 아민 잔기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(화학식 4의 화합물)을 제조하였다. 박층 크로마토그래피(용리액 조성: CHCl3중의 8% 메탄올)로 화학식 3의 화합물이 제거되었음을 확인하였다 (Rf 값이 0으로 떨어짐).
그런 다음, 반응 용액을 셀라이트 패드를 이용하여 여과한 후 회전 증발기에서 용매를 제거하여 화학식 4의 화합물을 제조하였다.
화학식 1 내지 4의 화합물은 클로로포름 용매하에서 각각 브루커(Bruker) 500MHz를 이용하여 1H NMR로 확인하였는 바, 그 결과는 각각 도 3a 내지 3d와 같다.
다. 본 발명에 따른 기판의 제조
상기 가.에서 제조된 아민기로 코팅된 실리콘 기판 상의 표면을 폴리무수물로 고정화시킨 기판을, NMP 중의 상기 나.에서 제조된 아민기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(200mM)/물(300mM) 용액에 침지하여 가수분해시킨 다음, 에탄올 및 아세톤으로 세척하고 건조함으로써, 폴리에틸렌 글리콜에 도입된 아민기와 카르복실기가 동시에 코팅된 본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판을 제조하였다(도 4 참조).
(2) 대조군 기판의 준비
이하, 실시예에서는 대조군 기판으로서 감마-아미노프로필트리에톡시실란로 코팅된 실리콘 기판을 사용하였다.
실시예 2 : 기판상에 프로브 DNA를 고정화함으로써 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 기판상에 5'말단이 관능기화된 DNA를 이용하여 DNA가 상기 기판상에 스팟의 그룹으로 배열된 DNA 마이크로어레이를 제조하였다.
먼저 스탓팅 용액을 제조하였는데, 용액의 조성은 포름아마이드(formamide) 50%, NaHCO3(0.1M, pH 10)중의 폴리에틸렌글리콜(분자량 10,000) 용액 25%, 및 5' 말단이 아민기(NH2)로 관능기화된 서열번호: 1의 폴리뉴클레오티드 프로브 용액 25%로 이루어졌으며, DNA 최종 농도가 20 μM 가 되도록 하였다.
이렇게 얻어진 각 프로브 폴리뉴클레오티드 용액을 상기 실리콘 기판 상에 카르티션 (Cartesian) 사 Pix5500 스팟터를 이용하여 스폿팅하고, 70℃의 온도, 40% 습도에서 1시간 동안 항온 항습기 내에서 고정화 반응을 수행하였다. 반응이 종결된 후, 상기 기판을 증류수로 세척한 뒤 남아있는 아민기를 무수 숙신산 (차단제)로 보호한 뒤 에탄올로 씻어준 뒤 스핀 건조하여 프로브 폴리뉴클레오티드가 고정화된 마이크로어레이를 제조하였으며, 이를 "본 발명에 따른 마이크로어레이 1"이라 명명하였다.
한편, "대조군 마이크로어레이 1"은 상시 실시예 1(2)에서 준비된 GAPS로 코팅된 실리콘 기판을 사용하여 상기와 동일한 방법을 수행함으로써 제조되었다.
실시예 3: 프로브 폴리뉴클레오티드의 고정화 효율
본 실시예에서는 실시예 2에서 제조된 본 발명에 따른 마이크로어레이 1을 이용하여, 기판상에 고정화된 프로브 폴리뉴클레오티드와 표적 DNA 간의 혼성화 반응을 일으키고 그 결과를 검출함으로써, 본 발명의 방법에 따라 제작된 마이크로어레이에 프로브의 고정화 효율을 확인하였다.
먼저, 분석에 사용될 표적 DNA는 5' 말단이 -NH2-Cy3인 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
15㎕ 의 표적 DNA(100pM)를 1.5mL 튜브에 넣고, 각 10초 동안 볼텍싱하고 원심분리하였다.
이를 94℃의 가열 블록(heating block)에서 5분 동안 변성시킨 뒤, 얼음에 넣어두었다. 그런 다음, 얼음에 넣어둔 상태에서 혼성화 완충용액(NaH2PO4H2O 138g, NaCl 876g, 0.5M EDTA 200ml, 10N NaOH 100ml의 혼합액을 희석한 용액) 16㎕를 넣어 총 32 ㎕ 가 되게 한다. 10초 동안 볼텍싱을 하고 10초 동안 원심분리한 후 본 발명에 따른 마이크로어레이 1 및 대조군 마이크로어레이 1에 42℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 세척액 I(1XSSPET) 및 세척액 II(3XSSPET)으로 각각 5분씩 세척하여 건조한 후, 액손 인스투르먼트 (Axon Instruments) 사의 GenePix 4000B 스캐너로 측정하여 이미지를 생성하였으며, 진픽스 프로소프트웨어 (GenePix Pro software) (Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다. 얻어진 이미지 데이터와 형광강도 데이터를 도 5a 및 5b에 나 타내었는 바, 이러한 결과는 532 nm(PMT560)에서 관찰된 형광 강도를 나타내는 것이다.
그 결과, 본 발명에 따른 마이크로어레이 1은 대조군 마이크로어레이 1에 비하여 그 프로브의 고정화가 300% 이상 높았으며(배경(background) 보정전), 배경 보정후에도 대조군 마이크로어레이 1에 비하여 30% 이상 프로브의 고정화가 향상됨을 확인하였다.
실시예 4: 본 발명에 따른 기판의 단백질 결합능의 확인
실시예 1에서 제조된 본 발명에 따른 기판 및 대조군 기판 상에, 표준 단백질인 FITC-표지된 BSA 수용액(1mg/ml)을 500μl를 첨가하고, 뚜껑을 덮고 실온에서 2 분 동안 방치한 다음, 증류수로 세척하고 형광 강도를 측정하였다.
액손 인스투르먼트 (Axon Instruments) 사의 GenePix 4000B 스캐너를 이용하여 532 nm(PMT560)에서 측정하여 이미지를 생성하였으며, 진픽스 프로소프트웨어 (GenePix Pro software) (Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다. 그 결과는 하기 표 1 및 도 6에 나타내었다.
대조군 기판 본 발명에 따른 기판
기판상의 FITC-표지된 BSA 13924.93 465.37
배경(Backgroud) 110 213
상기 결과에 따르면, 본 발명에 따른 기판을 이용하는 경우 단백질의 비특이적인 결합이 현저히 감소되었는바, 대조군 기판에 비하여 96% 이상 감소되었다.
실시예 5: 후처리 부재에 따른 표적 DNA의 비특이적 결합 확인
프로브를 서열번호: 1의 올리뉴클레오티드 대신, 서열번호: 3 내지 5의 3종류의 올리고뉴클레오티드를 사용한다는 점, 및 프로브를 고정화한 후 남아있는 아민기를 보호하기 위한 공정(무수 숙신산 (차단제)를 이용하여 아민기를 보호하는 반응)을 수행하지 않은 점을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 본 발명에 따른 마이크로어레이 1의 제조방법과 동일하게 수행하여 "본 발명에 따른 마이크로어레이 2"및 "대조군 마이크로어레이 2"를 제조하였다.
표적 DNA로는, 호흡기 박테리아인 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 16S rRNA 및 23S rRNA에 해당하는 서열을 갖도록 제작되었다.
16S rRNA에 해당하는 표적 DNA는 서열번호: 6 및 7의 올리고뉴클레오티드를 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였으며, 23S rRNA에 해당 표적 DNA는 서열번호: 8 및 9의 올리고뉴클레오티드를 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다.
상기에서 증폭된 표적 DNA들은 각각 5'말단을 Cy5로 표지한 다음, 정제하지 않고 본 발명에 따른 마이크로어레이 2 및 대조군 마이크로어레이 2에 대해 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 반응은 실시예 3에 기재된 바와 동일하게 수행하였다.
상기에서 제조된 본 발명에 따른 마이크로어레이 2를 혼성화 단계 이전 및 이후에 각각 액손 인스투르먼트 (Axon Instruments) 사의 GenePix 4000B 스캐너를 이용하여 532 nm에서 측정하여 이미지를 생성하였으며, 진픽스 프로소프트웨어 (GenePix Pro software) (Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다. 그 결과는 하기 표 2 및 도7과 같다.
대조군 마이크로어레이 2 본 발명에 따른 마이크로어레이 2
조건 혼성화 이전 혼성화 이후 혼성화 이전 혼성화 이후
배경 강도 61.11 154.85 63.31 82.56
증가율(%) 154 30
기판상에 프로브를 고정화한 후 기판상에 남아있는 아민기를 보호하지 않고 혼성화 반응을 수행한 결과, 대조군 마이크로어레이 2의 경우 자발광이 150%이상 증가한 반면, 본 발명에 따른 마이크로어레이 2를 사용한 경우 자발광이 30% 증가하는데 그쳤다.
따라서 본 발명에 따른 마이크로어레이의 경우, 프로브를 기판에 고정한 다음, 기판 표면상에 노출되어 있는 다른 아미노기를 보호하는 후처리 공정을 수행하지 않아도 DNA가 마이크로어레이 기판에 비특이적으로 결합하는 현상이 현저히 감속하였음을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판을 사용하면, 표적 생물분자 및 단백질의 비특이적 결합을 현저하게 감소시켜 프로브를 기판에 고정화한 후에 후속공정 없이 정제되지 않은 PCR 시료를 직접 적용할 수 있게 되어, 공정의 단순화를 달성할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이용 기판을 사용하게 되면, 프로브의 고정화 효율을 향상시킴과 동시에 표적 생물분자 및 단백질의 비특이적 결합을 막아주므로, 프로브를 기판에 고정한 후에 후처리 공정 없이 정제되지 않은 PCR 시료를 직접 기판에 적용할 수 있어, 공정의 단순화를 달성함으로써 적은 비용으로 칩을 제작하고 생물 분자를 분석할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (22)

  1. 분자량 100,000 내지 10,000,000의 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물) 표면을 갖는 고체 지지체에, 작용기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 코팅된 마이크로어레이용 기판.
  2. 제1항에 있어서, 상기 작용기는 아민기, 티올기, 알코올기, 에폭시기 또는 에스테르기인 것을 특징으로 하는 기판.
  3. 제2항에 있어서, 상기 작용기는 아민기인 것을 특징으로 하는 기판.
  4. 제1항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 방사형 또는 선형의 분자인 것을 특징으로 하는 기판.
  5. 제4항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 200 내지 10,000,000인 것을 특징으로 하는 기판.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 실리콘, 유리 또는 플라스틱 물질인 것을 특징으로 하는 기판.
  9. 제8항에 있어서, 상기 고체 지지체는 아민기를 갖는 물질로 코팅된 것을 특징으로 하는 기판.
  10. 제9항에 있어서, 상기 고체 지지체는 감마-아미노프로필트리에톡시실란, 감마-아미노프로필디에톡시 실란 또는 아미노헥실로 코팅된 것을 특징으로 하는 기판.
  11. 제10항에 있어서, 상기 고체 지지체는 감마-아미노프로필트리에톡시실란으로 코팅된 것을 특징으로 하는 기판.
  12. (a) 아민기를 포함하는 물질로 코팅된 고체 지지체를 준비하는 단계;
    (b) 상기 고체 지지체 표면에 분자량 100,000 내지 10,000,000의 폴리(에틸렌-알트-말레산 무수물)을 고정화시키는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 폴리무수물이 고정화된 고체 지지체에, 작용기가 도입된 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 코팅하는 단계를 포함하는 마이크로어레이용 기판의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 도입된 작용기는 아민기인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 단계 (c)의 폴리에틸렌 글리콜은 방사형 또는 선형의 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 단계 (c)의 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 200 내지 10,000,000인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제12항에 있어서, 상기 고체 지지체는 실리콘, 유리 또는 플라스틱 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 아민기를 포함하는 물질은 감마-아미노프로필트리에톡시실란, 감마-아미노프로필디에톡시 실란 또는 아미노헥실기인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항에 따른 마이크로어레이용 기판에 프로브 생물분자를 고정화한 마이크로어레이.
  21. 제20항에 있어서, 상기 프로브 생물분자가 핵산인 마이크로어레이.
  22. 제20항 또는 제21항에 따른 마이크로어레이를 이용하여 표적 생물분자를 분석하는 방법.
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