JP2001178459A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程を特に要しないＤＮ
Ａチップを得ること。 【解決手段】 表面に環化付加反応の一方の反応成分が
導入された固相担体と、一方の末端部に環化付加反応の
他方の反応成分を有するＤＮＡ断片とを、液相にて接触
させることにより、双方の反応成分間で環化付加反応さ
せて共有結合を形成させることを特徴とするＤＮＡ断片
の固相担体表面への固定方法、この方法により得られた
ＤＮＡチップ、そしてそのＤＮＡチップを用いるＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片
を検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる導電性基を持つ
インターカレータを利用する方法などが知られている。

【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。

【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。

【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。

【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。

【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。

【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。

【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。

【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。 （１）表面に環化付加反応の一方の反応成分が導入され
た固相担体と、一方の末端部に環化付加反応の他方の反
応成分を有するＤＮＡ断片とを、液相にて接触させるこ
とにより、双方の反応成分間で環化付加反応させて共有
結合を形成させることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担
体表面への固定方法。本発明において、環化付加反応の
一方の反応成分がジエン構造を持ち、そして他方の反応
成分がジエノフィル構造を持つことが好ましい。

【００１３】（２）上記の方法によって得られたＤＮＡ
チップ。

【００１４】（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、導電性基を有する
インターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与
する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と
相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーション
によってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡ
チップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハ
イブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの導
電性基を介して流れる電流を電気化学的に検出する工程
からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性
を有する核酸断片の検出方法。

【００１５】本発明において、固相担体表面へのＤＮＡ
断片固定は環化付加反応に基づく共有結合の形成をもっ
て行われる。ここでいう環化付加反応とは、例えば、デ
ィールスアルダー反応、［４＋２］環化反応、エン反
応、１，３−双極子環化付加反応、あるいは［２＋２］
環化付加反応と呼ばれる範疇に属するものである。環化
付加反応は二つの反応剤（反応成分）の組合せからな
り、極めて特異性の高い組合せが可能である。すなわ
ち、二つの反応剤の一方をＤＮＡ断片に結合し、他方を
固相担体表面に結合することにより、この両者が接触し
て初めて結合を形成することが可能になる。前述したよ
うに、この共有結合の形成は特異性が高いために、二つ
の反応剤のいずれを固相担体表面に結合した場合におい
ても、被検体核酸断片とは強い相互作用をしないように
容易に選択することができる。固相担体表面が被検体核
酸と相互作用（結合や吸着など）を有すると、検出の際
にバックグラウンドが上昇し、好ましくない感度低下を
きたす結果となる。

【００１６】従って、本発明の方法を用いることによっ
て、ＤＮＡ固定固相担体と被検体核酸断片（検出対象の
核酸断片）とはハイブリダイゼーション相互作用以外の
好ましくない相互作用を最小にとどめることが可能とな
り、ＤＮＡチップを用いての核酸断片の検出操作におけ
る感度低下の弊害を防ぐことができるほか、煩雑なブロ
ッキング工程を不要化することも可能となった。

【００１７】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）環化付加反応により共有結合を形成するための一
対の反応成分の一方を有する化合物を、固相担体表面に
固定する。 （２）ＤＮＡ断片として、環化付加反応により共有結合
を形成するための一対の反応成分の他方を末端にを有
し、その塩基配列が既知であるものを用いる。 （３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成
したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着する。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明の固定方法において用いら
れる環化付加反応の二つの反応剤の組合せについて述べ
る。

【００１９】本発明において用いられる環化付加反応の
一対の反応剤については、環化付加反応として公知の組
合せのいずれも使用することができる。これらの組合せ
については前述のように、ディールスアルダー反応、
［４＋２］環化反応、エン反応、１，３−双極子環化付
加反応、［２＋２］環化付加反応と呼ばれるものについ
ては、公知の組合せであり、例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒ
ｓ著、「シクロアディション・リアクション・イン・オ
ーガニック・シンセシス（Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ）」ＰＥＲＡＭＯＮ ＰＲＥＳＳ刊（１９
９０年）、Ｄａｌｅ Ｌ． Ｂｏｇｅｒ、Ｓｔｅｖｅｎ
Ｎ． Ｗｅｉｎｒｅｂ著「ヘテロ・ディールスアルダ
ー・メソドロジー・イン・オーガニック・シンセシス
（ＨＥＴＥＲＯ ＤＩＥＬＳＡＬＤＥＲ ＭＥＴＨＯＤ
ＯＬＯＧＹ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩ
Ｓ」ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ．刊（１９
８７年）、Ｐａｕｌ Ａ．Ｇｒｉｅｃｏ編「オーガニッ
ク・シンセシス・イン・ウォーター（ＯＲＧＡＮＩＣＳ
ＹＮＴＨＥＳＩＳ ＩＮ ＷＡＴＥＲ）」ＢＬＡＣＫＩ
Ｅ ＡＣＡＤＥＭＩＣ＆ ＰＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ刊
（１９９８年）に記載されている反応剤の組合せや、そ
れらの文献で引用されている文献に記されているものを
使用することができる。

【００２０】本発明において特に好ましく用いられる環
化付加反応の一対の反応剤（反応成分）としては、オー
ガニック・リアクションズ（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎｓ）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．刊、第４巻、第１章、同第４巻、第２章、同第５
巻第３章、特開平６−６４３４３号、特開平７−１３２
６８５号および特開平７−１４４４７８号に記載のディ
ールスアルダー反応と呼ばれる極めて広範囲にわたる環
化付加反応として公知の反応剤の組合せを挙げることが
できる。

【００２１】環化付加反応は、室温あるいは室温以下の
温度にて速やかに進行するものが多く、そのような組合
せは特に好ましく用いることができるが、室温ないし１
８０℃で進行するものも、固定時に加熱を行うことで好
ましく用いることができる。最も好ましい組合せとして
は１２０℃以下で進行する組合せである。

【００２２】本発明の固定方法においては、実質的に水
が存在しない反応系を使用することもできるが、ＤＮＡ
断片を溶解または分散するうえで水の存在が重要である
ことから、水が存在しても十分に安定な反応剤が好まし
く用いられる。また、上記の成書にも記載されている
が、環化付加反応は、例えば、塩化亜鉛、四塩化スズ、
臭化マグネシウムなどの触媒により大きく反応が加速さ
れる場合があり、そのような触媒の存在下にＤＮＡ断片
を固相担体表面に固定する方法も好ましく用いることが
できる。

【００２３】本発明の代表的な固定方法を次に示す。環
化付加反応によって共有結合を形成する官能基を有する
化合物（２）を固相担体表面に担持してなる固相担体
（１）に、末端に環化付加反応によって共有結合を形成
する官能基を有するＤＮＡ断片を含む水性液体を点着す
る。点着部分において、遷移金属触媒が存在するように
固相担体に均一におよび／または点着する液体中に存在
させる。必要があれば塩基などの促進剤も同様に存在さ
せる。ＤＮＡ断片が固相担体と共有結合を形成する。こ
のように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行い、必要
によっては加熱処理を施すことによってＤＮＡチップ
（３）を得ることができる。ＤＮＡ断片が有する官能基
と、ＤＮＡ断片のリン酸エステル基との間には、合成の
都合上クロスリンカーを存在させてもよい。以下、各工
程について説明する。

【００２４】固相担体としては、その表面が疎水性、あ
るいは親水性の低い担体を用いることが好ましい。ま
た、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであって
も好ましく用いることができる。固相担体の材質として
は、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしく
はニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、
酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネー
ト、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリ
マー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミ
ックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み
物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の
多孔質物質、金などの導電性物質などを拳げることがで
きる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎ
ｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５００ｎｍの範
囲にあることが特に好ましい。固相担体の材質は、ガラ
スもしくはシリコンであることが特に好ましい。これ
は、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容
易さによるものである。固相担体の厚さは、１００乃至
２０００μｍの範囲にあることが好ましい。

【００２５】環化付加反応によって共有結合を形成する
基が固定された固相担体は、次のようにして作製するこ
とができる。ガラス製の担体の場合には、環化付加反応
によって共有結合を形成する官能基を有するシランカッ
プリング剤を接触、反応させて、固相表面上に固定する
ことができる。この際に該官能基は一時的に保護された
形で導入し、ＤＮＡ断片を含有する水性液体を点着し、
固定化するまでの間に脱保護するようにしてもよい。

【００２６】表面にアミノ基を有する固相担体（例え
ば、ガラス製担体表面を３−アミノプロピルトリメトシ
キシランを作用させて作製する）を用いる場合には、環
化付加反応によって共有結合を形成する反応剤にアミノ
基との反応が可能な基を結合して、該アミノ基に反応さ
せることによって得ることができる。このような連結基
の例としては、カルボキシル基、ホルミル基、スルホ
基、イソシアナト基、イソチオシアナト基、酸無水物な
どが挙げられ、結合の際には、加熱や適当な塩基、縮合
剤を用いて固定する方法を用いることができる。この中
ではカルボキシル基を有するものであり、縮合剤（カル
ボジイミド化合物など）を用いてアミド結合を形成する
方法が好ましい。

【００２７】表面がアミノ基を有する固相担体であり、
固相担体側にディールスアルダー反応におけるジエノフ
ィルを結合する場合においては、無水マレイン酸を結合
してマレイミドを形成する化合物を用いる方法は特に簡
便であり、好ましく用いることができる。

【００２８】環化付加反応によって共有結合を形成する
官能基を有する重合性モノマーを構成単位として有する
ポリマーを担持した固相担体もまた、好ましく用いるこ
とができる。これらの重合性モノマーはホモポリマーと
して用いることもできるが、適宜、他の重合性モノマー
と共重合して用いることも好ましい。この時に共重合の
モノマーとしてシランカップリング剤の部分構造を有す
るものを用いることも好ましい。

【００２９】これらのポリマーはラテックスとして担体
表面に塗布した後、加熱処理などによって融着させる方
法もとることができる。環化付加反応によって共有結合
を形成する反応剤がアクリレートやアクリルアミドの部
分構造を有するものについては、多官能のモノマーを重
合させ、重合せずに残存した重合性官能基を用いて環化
付加反応による共有結合をさせる方法も利用することが
できる。

【００３０】環化付加反応によって共有結合を形成する
反応剤がアミノ基や脂肪族水酸基を有している場合に
は、基板上に固定するため、多官能カップリング剤を固
定化剤としてを用いることができる。このような固定化
剤としてはシランカップリング剤、多官能エポキシ化合
物、多官能ビニルスルホン、塩化シアヌルなどの多点反
応剤が好ましく用いられる。この中ではシランカップリ
ング剤が好ましく、シランカップリング剤の例としては
１，２−ビス（トリメトキシシリル）エタン、１，７−
ジクロロオクタメチルテトラシロキサン、１，３−ジク
ロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルシロキサ
ン、３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン
などが挙げられる。また、シランカップリング剤を構成
モノマーとして有するポリマーを用いることもできる。

【００３１】固相担体の表面には、層間の密着を良くす
るために、ゼラチンなどの下塗り層を施してもよいし、
コロナ放電などにより、担体表面を処理する方法も用い
ることができる。

【００３２】環化付加反応によって共有結合を形成する
反応剤を固相担体上に付与する量については、分子を直
接シランカップリングなどで結合する方法においては担
体表面を完全に被覆する量が好ましいが、それ以下、例
えば完全被覆量の２０乃至１００％の範囲にて用いるこ
とが好ましく、４０乃至１００％の範囲にて用いること
がより好ましく、５０乃至１００％の範囲にて用いるこ
とが特に好ましい。

【００３３】環化付加反応によって共有結合を形成する
反応剤がポリマー等の形態で固相担体表面に付与される
（塗布法や浸漬法による）場合には、該反応剤はポリマ
ー重量の５乃至９５％の範囲にて含有されることが好ま
しく、１０乃至８０％の範囲にて含有されていることが
より好ましく、３０乃至７５％の範囲にて含有されてい
ることが特に好ましい。この場合、形成された薄層状の
固相膜の厚さは、２ｎｍ乃至１μｍの範囲にあることが
好ましく、１０乃至８００ｎｍの範囲にあることが特に
好ましい。環化付加反応によって共有結合を形成する反
応剤を固相担体上に施された薄層状の固相膜に結合する
場合も、該固相膜の厚さは２ｎｍ乃至１μｍの範囲にあ
ることが好ましく、１０乃至８００ｎｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。

【００３４】環化付加反応によって共有結合を形成する
反応剤を固相担体に固定する工程では、酸、塩基や触媒
の使用、水および有機溶媒の使用、加熱なども適宜行う
ことができる。酸としては、無機酸および有機酸の何れ
も用いることができるが、塩酸、トリフルオロ酢酸、酢
酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸もしくはリン酸が好
ましく、トリフルオロ酢酸もしくは酢酸が特に好まし
い。

【００３５】塩基としては、無機塩基および有機塩基の
何れをも用いることができる。無機塩基の例としては炭
酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、水酸化リ
チウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セ
シウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムなどを
挙げることができる。有機塩基の例としては、トリメチ
ルアミン、トリエチルアミン、水酸化テトラメチルアン
モニウム、ジメチルベンジルアミン、ジエチルアニリ
ン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、１，４ジ
アザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８−ジアザ
ビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、ナトリウム
メトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔ−ブ
トキシド、ｎ−ブチルリチウム、リチウムジイソプロピ
ルアミド、フッ化テトラブチルアンモニウム、酢酸ナト
リウム、酢酸カリウムなどを挙げることができる。１−
メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピ
リジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２
−ピロリドンを用いることが特に好ましい。

【００３６】本発明の環化付加反応においては、反応
時、室温付近あるいは冷却して反応することができる
が、加熱することも好ましい。冷却する場合は、その温
度が５乃至１０℃の範囲にあることが好ましく、加熱す
る場合には、その温度が４０乃至１５０℃の範囲にある
ことが好ましく、５０乃至１３０℃の範囲にあることが
より好ましく、５０乃至１００℃の範囲にあることが特
に好ましい。また、反応の際には反応溶媒の揮発、揮散
を防ぐ目的、あるいは調湿やガス状の試薬を供給するた
めに、周囲を隔壁で覆って行なうことも好ましい。圧力
をかける必要がある反応については、オートクレーブな
どの耐圧力容器中で反応を行なうこともできる。

【００３７】本発明の環化付加反応においては、溶媒と
して水の他に種々の有機溶媒を用いることができる。有
機溶媒としては、トルエン、キシレン、ｎ−ヘキサンの
ような疎水性溶媒を用いることもできるが、水と混和す
る極性の高い溶媒を用いることが特に好ましい。その例
としては、酢酸エチル、酢酸メチル、メタノール、エタ
ノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ｔ
−ブタノール、スルホラン、１，２−ジメトキシエタ
ン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジ
メチルアセトアミド、アセトニトリル、プロピオニトリ
ル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、エチレン
グリコール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタ
ンジオール、グリセリン、２−メトキシエタノール、ジ
エチレングリコール、ジエチレングリコールジメチルエ
ーテル、酢酸、ピリジン、ギ酸、プロピオン酸、酪酸な
どを挙げることができる。

【００３８】環化付加反応によって共有結合を形成する
官能基を末端に有するＤＮＡ断片を得る方法は大別して
次の二つの方法が挙げられる。一つは該官能基を有する
プライマーを用いてＰＣＲ法にて、該官能基を有するＤ
ＮＡ断片を増幅する方法であり、他の一つはアミノ基な
どの反応性基を有するプライマーを用いてＰＣＲ法にて
ＤＮＡ断片を増幅したのち、環化付加反応によって共有
結合を形成する反応剤を連結する方法である。

【００３９】通常は後者の方法が容易であり、本発明に
おいても好ましい。連結方法としては、カルボキシル基
を有する環化付加反応によって共有結合を形成する反応
剤とアミノ基を末端に有するＤＮＡ断片を適当な縮合剤
を用いてアミド結合により連結することができる。

【００４０】表面処理がされた固相担体表面上には、さ
らに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減するこ
とができる。固相担体の種類によっては、その担体中に
親水性高分子等を含有させることも可能であり、このよ
うな処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。

【００４１】クロスリンカーは、単結合、アルキレン基
あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であることが
好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルア
ミノへキシレン基であることが特に好ましい。

【００４２】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。

【００４３】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。

【００４４】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１0³乃至１０⁶の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ
目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、
９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環
境に置くことも好ましい。

【００４５】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。

【００４６】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０²乃至１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０¹⁵モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。

【００４７】環化付加反応の一方の反応成分が導入され
た固相担体の表面に、環化付加反応の他方の反応成分を
有するＤＮＡ断片を点着させると、環化付加反応が進行
し、該ＤＮＡ断片が固定されるが、固相担体の表面には
該ＤＮＡ断片が結合していない反応成分も存在する。こ
のような反応成分は、標識された核酸断片試料との非特
異的な反応を生じる可能性があるため、予め該反応成分
をブロッキング処理（ブロッキング処理を施さなくて
も、本発明の固定方法によって製造された、ＤＮＡ断片
固定固相担体は、充分にＤＮＡチップとして使用するこ
とができる。）しておくことも好ましい。ブロッキング
処理は、固相担体の表面に導入されている反応成分がジ
エノフィルである場合には、チオグリコール酸、３−メ
ルカプトプロピオン酸、チオサリチル酸あるいはこれら
の塩を接触させることによって行うことが好ましく、該
反応成分がジエンである場合には、水溶性のジエノフィ
ル（例えば、Ｎ−（２−スルホエチル）マレイミド、ア
セチレンジカルボン酸、ジ−（２−ヒドロキシエチル）
エステル等）を接触させることによって行うことが好ま
しい。

【００４８】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。

【００４９】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ²−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。

【００５０】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。

【００５１】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片
は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライ
マーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰ
ＣＲを行って得ることが好ましい。

【００５２】ハイブリダイゼーションは、９６穴もしく
は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液
を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによ
つて実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１０
０ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼー
ションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至
２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダ
イゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液
を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去する
ことが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液と
しては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
るが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

【００５３】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。

【００５４】

【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成
及びＤＮＡ断片の固定量の測定法

【００５５】（１）表面にジエノフィルとしてマレイミ
ド基が導入されたスライド（Ｃ）の作成 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を５質量％の無水マレイン
酸および０．０５質量％の４−ジメチルアミノピリジン
を含有するアセトニトリル溶液に、１０分間浸した後取
り出し、エタノールで洗浄後、１２０℃で１５分間乾燥
して、マレイミド被覆スライド（Ｃ）を作成した。

【００５６】（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３'末端および５'未端がそれぞれにアミノ基および蛍光
標織試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、ア
マシャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾さ
れたＤＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）をフ
ルフラール（東京化成工業（株）製）およびナトリウム
シアノボロヒドリド（アルドリッチ社製で処理し、３'
末端にフルフリルアミノ基が導入されたＤＮＡ断片を作
成した。このＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
９．８）に分散してなる水性液（１×１０^-6Ｍ、１μ
Ｌ）とし、上記（１）で得たスライド（Ｃ）にこれを点
着した。直ちに、それぞれの点着後のスライドを６０
℃、湿度９０％にて１時間放置した後、１２０℃で２０
分間加熱した。このスライドを０．１質量％ＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：Ｓ
ＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩ク
エン酸緩衝液）との混合溶液で２回、そして０．２×Ｓ
ＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、室温で乾燥さ
せ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ１）を得た。
このスライド表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で
測定したところ、それぞれ１５９９であった。本発明の
固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラ
スに固定されたことが分かる。

【００５７】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 ５'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０質量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に付与し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１質量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１質量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、６２５であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。

【００５８】

【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。すなわ
ち、ＤＮＡ断片に環化付加反応の反応成分の一方を含有
させ、他方を固相担体表面が含有させた場合には、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製に有効であ
る。その一つの例として、本発明によって作製されたＤ
ＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリダイゼ
ーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定されて
いるＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を感度よ
く検出することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＺ Ｆターム(参考） 4B033 NA01 NA45 NB04 NB15 NB25 NB68 NC03 NC12 ND05 ND12 4B063 QA01 QA11 QA18 QQ42 QR32 QR56 QR84 QS03 QS34 QS39 QX02 QX04 QX07

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面に環化付加反応の一方の反応成分が
   導入された固相担体と、一方の末端部に環化付加反応の
   他方の反応成分を有するＤＮＡ断片とを、液相にて接触
   させることにより、双方の反応成分間で環化付加反応さ
   せて共有結合を形成させることを特徴とするＤＮＡ断片
   の固相担体表面への固定方法。
2. 【請求項２】 環化付加反応の一方の反応成分がジエン
   構造を持ち、そして他方の反応成分がジエノフィル構造
   を持つことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片の
   固相担体表面への固定方法。
3. 【請求項３】 請求項１もしくは２に記載の方法によっ
   て得られたＤＮＡチップ。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
   料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
   片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
   らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
   有する核酸断片の検出方法。
5. 【請求項５】 請求項３に記載のＤＮＡチップの表面
   に、導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料
   とを含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試
   料とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれた
   インターカレータの導電性基を介して流れる電流を電気
   化学的に検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮ
   Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。