JP2001183367A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents
固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程が不要なＤＮＡチッ
プを得ること。 【解決手段】 表面に反応性基を有する固相担体と、一
端に反応性基を有するＤＮＡ断片とを液相にてパラジウ
ムなどの遷移金属触媒の存在下で接触させることによ
り、双方の反応基間で反応させて共有結合を形成させる
ことを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方
法、この方法により得られたＤＮＡチップ、そしてその
ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対
して相補性を有する核酸断片を検出する方法。
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程が不要なＤＮＡチッ
プを得ること。 【解決手段】 表面に反応性基を有する固相担体と、一
端に反応性基を有するＤＮＡ断片とを液相にてパラジウ
ムなどの遷移金属触媒の存在下で接触させることによ
り、双方の反応基間で反応させて共有結合を形成させる
ことを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方
法、この方法により得られたＤＮＡチップ、そしてその
ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対
して相補性を有する核酸断片を検出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。
【０００２】
【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もし
くは導電性基を持つインターカレータを利用する方法な
どが知られている。
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もし
くは導電性基を持つインターカレータを利用する方法な
どが知られている。
【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。
【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。
【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。
【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。
【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。
【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。
【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。
【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。
明によって解決された。
【００１３】（１）表面に反応性基を有する固相担体
と、一方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、
液相にて、遷移金属触媒の存在下で接触させることによ
り、双方の反応性基間で反応させて共有結合を形成させ
ることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定
方法。遷移金属触媒は、スカンジウム、コバルト、ニッ
ケル、銅、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、あるい
はランタニドなどの金属元素を含むことが望ましい。ま
た、固相担体表面の反応性基とＤＮＡ断片の反応性基の
うちのいずれかが二重結合もしくは三重結合を有する反
応性基であることが望ましい。 （２）上記の方法によって得られたＤＮＡチップ。
と、一方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、
液相にて、遷移金属触媒の存在下で接触させることによ
り、双方の反応性基間で反応させて共有結合を形成させ
ることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定
方法。遷移金属触媒は、スカンジウム、コバルト、ニッ
ケル、銅、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、あるい
はランタニドなどの金属元素を含むことが望ましい。ま
た、固相担体表面の反応性基とＤＮＡ断片の反応性基の
うちのいずれかが二重結合もしくは三重結合を有する反
応性基であることが望ましい。 （２）上記の方法によって得られたＤＮＡチップ。
【００１４】（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしく
は導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料と
を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定され
ているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイ
ブリダーゼイションによってＤＮＡチップ上に固定する
工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料
とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたイ
ンターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは
導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしく
は導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料と
を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定され
ているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイ
ブリダーゼイションによってＤＮＡチップ上に固定する
工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料
とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたイ
ンターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは
導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。
【００１５】本発明は、遷移金属触媒を用いることによ
り、末端部に予め決められた官能基を有するＤＮＡ断片
を、同じく予め決められた官能基を有する固相担体上に
点着した箇所でのみ、該ＤＮＡ断片と固相担体との間に
極めて効率よく共有結合が形成され、固定化されるとい
う本発明者による新規な発見に基づいている。本発明の
ように、遷移金属触媒を用いることにより、ＤＮＡ断片
と固相担体表面との間の極めて効率よく強固な共有結合
が形成可能となり、ＤＮＡチップを用いる拡散断片の検
出の際の感度が向上することはこれまで知られていなか
った。
り、末端部に予め決められた官能基を有するＤＮＡ断片
を、同じく予め決められた官能基を有する固相担体上に
点着した箇所でのみ、該ＤＮＡ断片と固相担体との間に
極めて効率よく共有結合が形成され、固定化されるとい
う本発明者による新規な発見に基づいている。本発明の
ように、遷移金属触媒を用いることにより、ＤＮＡ断片
と固相担体表面との間の極めて効率よく強固な共有結合
が形成可能となり、ＤＮＡチップを用いる拡散断片の検
出の際の感度が向上することはこれまで知られていなか
った。
【００１６】本発明は下記の方法により具体化すること
が可能である。固相担体表面へのＤＮＡ断片固定は共有
結合の形成をもって行われる。この共有結合の形成は固
相担体表面とＤＮＡ断片にそれぞれ遷移金属触媒の非存
在下では結合を形成せず、遷移金属触媒の存在下でのみ
共有結合を形成するような官能基を連結して達成され
る。
が可能である。固相担体表面へのＤＮＡ断片固定は共有
結合の形成をもって行われる。この共有結合の形成は固
相担体表面とＤＮＡ断片にそれぞれ遷移金属触媒の非存
在下では結合を形成せず、遷移金属触媒の存在下でのみ
共有結合を形成するような官能基を連結して達成され
る。
【００１７】従って、本発明においては遷移金属触媒を
固相担体表面に均一に存在させてＤＮＡ断片を含む水性
液体を点着する方法、あるいは遷移金属触媒をＤＮＡ断
片を含む水性液体に存在させ、これを固相担体表面に点
着する方法の二つの方法の方法のうちのいずれかが好ま
しく採用される。このような方法を採用することによっ
て、特別な工程を施すことなく点着部分のみが共有結合
性を発現し、共有結合を形成することができる。非点着
部分を被検体核酸断片との相互作用を小さくすることに
よって、検出のバックグラウンドを低下させることがで
き、その結果として、煩雑なブロッキング工程を不要化
することも可能となる。
固相担体表面に均一に存在させてＤＮＡ断片を含む水性
液体を点着する方法、あるいは遷移金属触媒をＤＮＡ断
片を含む水性液体に存在させ、これを固相担体表面に点
着する方法の二つの方法の方法のうちのいずれかが好ま
しく採用される。このような方法を採用することによっ
て、特別な工程を施すことなく点着部分のみが共有結合
性を発現し、共有結合を形成することができる。非点着
部分を被検体核酸断片との相互作用を小さくすることに
よって、検出のバックグラウンドを低下させることがで
き、その結果として、煩雑なブロッキング工程を不要化
することも可能となる。
【００１８】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）遷移金属触媒を用いて共有結合を形成するための
官能基を有する化合物を固相担体表面に固定する。 （２）ＤＮＡ断片として、遷移金属触媒を用いて共有結
合を形成するための官能基を一方の端部にを有し、その
塩基配列が既知であるものを用いる。 （３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成
したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着する。この際
に固相担体表面およびＤＮＡ断片を含有している水性液
体の少なくとも一方に遷移金属触媒を存在させる。
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）遷移金属触媒を用いて共有結合を形成するための
官能基を有する化合物を固相担体表面に固定する。 （２）ＤＮＡ断片として、遷移金属触媒を用いて共有結
合を形成するための官能基を一方の端部にを有し、その
塩基配列が既知であるものを用いる。 （３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成
したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着する。この際
に固相担体表面およびＤＮＡ断片を含有している水性液
体の少なくとも一方に遷移金属触媒を存在させる。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明の固定方法において用いら
れる共有結合を形成するための遷移金属触媒および遷移
金属触媒と組み合わされて用いられる官能基について述
べる。本発明において用いられる遷移金属触媒としては
共有結合を形成する反応を触媒するものであれば、どの
ようなものでも使用することができる。また、一種の遷
移金属だけではなく、二種以上の遷移金属を組み合わせ
て用いることも可能であり、さらに、遷移金属と典型金
属の組合せも可能である。
れる共有結合を形成するための遷移金属触媒および遷移
金属触媒と組み合わされて用いられる官能基について述
べる。本発明において用いられる遷移金属触媒としては
共有結合を形成する反応を触媒するものであれば、どの
ようなものでも使用することができる。また、一種の遷
移金属だけではなく、二種以上の遷移金属を組み合わせ
て用いることも可能であり、さらに、遷移金属と典型金
属の組合せも可能である。
【００２０】本発明のＤＮＡ断片の固定方法において
は、水が存在しない反応系を使用することもできるが、
ＤＮＡ断片を溶解または分散する上で有利なことから、
水が存在しても十分な触媒活性を保持しうる遷移金属触
媒が好ましく用いられる。
は、水が存在しない反応系を使用することもできるが、
ＤＮＡ断片を溶解または分散する上で有利なことから、
水が存在しても十分な触媒活性を保持しうる遷移金属触
媒が好ましく用いられる。
【００２１】このような遷移金属を触媒とする共有結合
形成反応については非常に多くの成書が知られており、
それらを参考にすることができるが、例えば、山本明夫
著「有機金属化学」裳華房刊（１９８２年）、山崎博
史、若槻康雄著「有機金属の化学」大日本図書（１９８
９年）、山川浩司、松島美一、久留正雄著「有機金属錯
体の化学」講談社刊（１９８９年）、Ｃｈ．Ｅｌｓｃｈ
ｅｎｂｒｏｉｃｈ、Ａ．Ｓａｌｚｅｒ著「オーガノメタ
リックス，ア・コンサイス・イントロダクション（Orga
nometallics, A Concise Introduction）」ＶＣＨ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊（１９８９年）、渡部正利、矢野
重信、碇屋隆雄著「錯体化学の基礎」講談社（１９９０
年）、伊藤卓、内本喜一朗、中村晃、干鯛眞信著「＜化
学総説１７＞前周期遷移金属の有機化学」山崎博史編、
学会出版センター刊（１９９３年）、辻二郎著「遷移金
属が拓く有機合成その多彩な反応形式と最新の成果」
（株）化学同人刊（１９９７年）、Ｌ．Ｂｒａｎｄｓｍ
ａ、Ｓ．Ｆ．Ｖａｓｉｌｅｖｓｋｙ、Ｈ．Ｄ．Ｖｅｒｋ
ｒｕｉｊｓｓｅ共著「アプリケーション・オブ・トラン
ジション・メタル・キャタリスツ・イン・オーガニック
・シンセシス（Application of Transition Metal Cata
lysts in Organic Synthesis）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ刊
（１９９８年）、Ｐａｕｌ Ａ．Ｇｒｉｅｃｏ編「オー
ガニック・シンセシス・イン・ウォーター（Organic Sy
nthesis in Water）」ＢＬＡＣＫＩＥ・ＡＣＡＤＥＭＩ
Ｃ ＆ ＰＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ刊（１９９８年）に記
載の方法やこれらに記載の引用文献等を参考にすること
ができる。
形成反応については非常に多くの成書が知られており、
それらを参考にすることができるが、例えば、山本明夫
著「有機金属化学」裳華房刊（１９８２年）、山崎博
史、若槻康雄著「有機金属の化学」大日本図書（１９８
９年）、山川浩司、松島美一、久留正雄著「有機金属錯
体の化学」講談社刊（１９８９年）、Ｃｈ．Ｅｌｓｃｈ
ｅｎｂｒｏｉｃｈ、Ａ．Ｓａｌｚｅｒ著「オーガノメタ
リックス，ア・コンサイス・イントロダクション（Orga
nometallics, A Concise Introduction）」ＶＣＨ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊（１９８９年）、渡部正利、矢野
重信、碇屋隆雄著「錯体化学の基礎」講談社（１９９０
年）、伊藤卓、内本喜一朗、中村晃、干鯛眞信著「＜化
学総説１７＞前周期遷移金属の有機化学」山崎博史編、
学会出版センター刊（１９９３年）、辻二郎著「遷移金
属が拓く有機合成その多彩な反応形式と最新の成果」
（株）化学同人刊（１９９７年）、Ｌ．Ｂｒａｎｄｓｍ
ａ、Ｓ．Ｆ．Ｖａｓｉｌｅｖｓｋｙ、Ｈ．Ｄ．Ｖｅｒｋ
ｒｕｉｊｓｓｅ共著「アプリケーション・オブ・トラン
ジション・メタル・キャタリスツ・イン・オーガニック
・シンセシス（Application of Transition Metal Cata
lysts in Organic Synthesis）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ刊
（１９９８年）、Ｐａｕｌ Ａ．Ｇｒｉｅｃｏ編「オー
ガニック・シンセシス・イン・ウォーター（Organic Sy
nthesis in Water）」ＢＬＡＣＫＩＥ・ＡＣＡＤＥＭＩ
Ｃ ＆ ＰＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ刊（１９９８年）に記
載の方法やこれらに記載の引用文献等を参考にすること
ができる。
【００２２】本発明のＤＮＡ断片の固定に際して用いら
れる遷移金属触媒の遷移金属の例としてはスカンジウ
ム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバ
ルト、ニッケル、銅、イットリウム、ジルコニウム、ニ
オブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウ
ム、銀、カドミウム、ランタニド系列の各金属、ハフニ
ウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウ
ム、イリジウム、白金、金、水銀などが挙げられる。こ
の中でさらに好ましいのはスカンジウム、コバルト、ニ
ッケル、銅、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、ラン
タニド（特に、イッテルビウム、サマリウム、プラセオ
ジム、ネオジム、ガドリニウム）であり、最も好ましい
のはパラジウムである。
れる遷移金属触媒の遷移金属の例としてはスカンジウ
ム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバ
ルト、ニッケル、銅、イットリウム、ジルコニウム、ニ
オブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウ
ム、銀、カドミウム、ランタニド系列の各金属、ハフニ
ウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウ
ム、イリジウム、白金、金、水銀などが挙げられる。こ
の中でさらに好ましいのはスカンジウム、コバルト、ニ
ッケル、銅、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、ラン
タニド（特に、イッテルビウム、サマリウム、プラセオ
ジム、ネオジム、ガドリニウム）であり、最も好ましい
のはパラジウムである。
【００２３】次に、本発明の遷移金属触媒を用いる共有
結合形成において、好ましく使用される遷移金属および
それと組み合わせて使用される共有結合形成性の官能基
の組合せについて述べる。これらの組合せについては、
前述した成書に詳しく記載されており、それらの引用文
献をとともに使用することができる。共有結合形成性の
官能基の組合せは、前述のように、一方を固相担体に結
合し、他方をＤＮＡ断片に結合して用いる。ＤＮＡ断片
への結合個所は好ましくはＤＮＡ断片の末端である。
結合形成において、好ましく使用される遷移金属および
それと組み合わせて使用される共有結合形成性の官能基
の組合せについて述べる。これらの組合せについては、
前述した成書に詳しく記載されており、それらの引用文
献をとともに使用することができる。共有結合形成性の
官能基の組合せは、前述のように、一方を固相担体に結
合し、他方をＤＮＡ断片に結合して用いる。ＤＮＡ断片
への結合個所は好ましくはＤＮＡ断片の末端である。
【００２４】（１）パラジウム触媒 ヨウ化アリール／オレフィン；臭化アリール／オレフィ
ン；ジアゾニウム塩／オレフィン；カルボニルハライド
／オレフィン；エノールエーテル／オレフィン；アルキ
ル、アルケニルまたはアリールボロン酸／ヨウ化アリー
ルまたは臭化アリール；アリールボロン酸／アルケニル
またはアリールトリフレート；グリニャール試薬／アリ
ールトリフレート；酸化ジアリールホスフィン／アリー
ルトリフレート；アリールボロン酸／ジアゾニウム塩；
アルケニルボロン酸エステル／臭化アルケニル；ヨウ化
ヘテロアリール／レフォルマツキー試薬；アルケニルト
リフレート／アリール亜鉛試薬；アリールトリフレート
／ヘテロアリール亜鉛試薬；アルキル亜鉛試薬／アルケ
ニルトリフレート；アルキルボラン／ヨウ化アルキル；
アルキルボラン／ビニルトリフレート；アルケニルアル
ミニウム試薬／ヨウ化アルケニルまたはヨウ化アリー
ル；アリールトリフレート／アルキルアルミニウム；ア
ルケニルジルコノセン試薬／ヨウ化アルケニル；アルケ
ニルスズ試薬／ヨウ化アルケニルまたはヨウ化アリー
ル；アルケニルシラン／ヨウ化アリール；アリールシラ
ン／アリールトリフレート；アルケニルシラン／塩化ア
リール；ビス（ピナコラート）ジボロン／臭化アリー
ル；臭化アリールまたはヨウ化アリール／テトラアリー
ルボレート；ジシラン／ヨウ化アルケニル；塩化ベンジ
ル／ジシラン；塩化カルボニル／ジシラン；マロノニト
リルまたはシアノ酢酸エステル／臭化アリールまたはヨ
ウ化アリール；臭化アリール／アルキルアミンまたはア
リールアミン；ヨウ化アリールまたは臭化アリール／ア
ルカンチオールまたはアリールチオール；ヨウ化アリー
ル／ホスフィン酸エステル；臭化アリールまたはヨウ化
アリール／末端アルキン；塩化アルケニル、臭化アルケ
ニルまたはヨウ化アルケニル／末端アルキン；ヨウ化ア
ルケン／アルキニルスズ試薬；ヨウ化アルキニル／末端
アルキン；臭化アリールまたはヨウ化アリール／内部ア
ルキン；臭化アルケンまたはヨウ化アルケン／内部アル
キン；アリールトリフレート、塩化アリール、臭化アリ
ールまたはヨウ化アリール／アルコールまたはアミン／
一酸化炭素（外部よりガスとして供給）；ヨウ化アリー
ル／アルキル亜鉛試薬；アルケニルトリフレート／アル
ケニルスズ試薬／一酸化炭素（外部よりガスとして供
給）；カルボニルハライド／レフォルマツキー試薬；エ
ノン／マロン酸エステルまたはスルホニル酢酸エステ
ル；アリルエステル類またはアリルハライド類／マロン
酸エステルやスルホニル酢酸エステル等の活性メチレン
化合物；アリルエステル類またはアリルハライド類／ケ
トンのシリルエノールエーテル類およびエノールエステ
ル類；共役ジエン／共役ジエン；共役ジエン／アルコー
ル；共役ジエン／フェノール類；共役ジエン／カルボン
酸類；共役ジエン／１級アミンまたは２級アミン；共役
ジエン／活性メチレン化合物；共役ジエン／ニトロアル
カン；共役ジエン／ニトロアルカン；共役ジエン／エナ
ミン；共役ジエン／ケイ素水素結合を有するシラン類；
共役ジエン／アルコール類／一酸化炭素（外部よりガス
として供給）；共役ジエン／ジシラン；カルボニルハラ
イド／共役ジエン／ジシラン類；カテコールボラン／共
役ジエン；アルキン／アクリル酸エステル；アルキン／
アルコール／一酸化炭素（外部よりガスとして供給）；
プロパルギルアルコール／ハロ炭酸エステル；プロパル
ギルアルコール炭酸エステル／活性メチレン化合物／一
酸化炭素（外部よりガスとして供給）；プロパルギルア
ルコール炭酸エステル／活性メチレン化合物；エチニル
オキシラン類／活性メチレン化合物；プロパルギルメタ
ンスルホネート／アリールアミン；共役ジエン／オレフ
ィン；末端オレフィン／アルコール／一酸化炭素（外部
よりガスとして供給）；末端アルキン／アルコール／一
酸化炭素（外部よりガスとして供給）；末端アルキン／
ケイ素水素結合を有するシラン類／一酸化炭素（外部よ
りガスとして供給）；オレフィン／オレフィン；オレフ
ィン／アルキン；アルキン／アルキン；末端アルキン／
末端アルキン；アリルアルコールまたはその炭酸エステ
ル／アルデヒド類；ヨウ化アリールまたはアリールトリ
フレート／亜リン酸エステル；ヨウ化アリールまたは臭
化アリール／末端アルキンまたは末端オレフィン；ジア
リールヨウドニウム塩／オレフィンまたはアクリル酸。
ン；ジアゾニウム塩／オレフィン；カルボニルハライド
／オレフィン；エノールエーテル／オレフィン；アルキ
ル、アルケニルまたはアリールボロン酸／ヨウ化アリー
ルまたは臭化アリール；アリールボロン酸／アルケニル
またはアリールトリフレート；グリニャール試薬／アリ
ールトリフレート；酸化ジアリールホスフィン／アリー
ルトリフレート；アリールボロン酸／ジアゾニウム塩；
アルケニルボロン酸エステル／臭化アルケニル；ヨウ化
ヘテロアリール／レフォルマツキー試薬；アルケニルト
リフレート／アリール亜鉛試薬；アリールトリフレート
／ヘテロアリール亜鉛試薬；アルキル亜鉛試薬／アルケ
ニルトリフレート；アルキルボラン／ヨウ化アルキル；
アルキルボラン／ビニルトリフレート；アルケニルアル
ミニウム試薬／ヨウ化アルケニルまたはヨウ化アリー
ル；アリールトリフレート／アルキルアルミニウム；ア
ルケニルジルコノセン試薬／ヨウ化アルケニル；アルケ
ニルスズ試薬／ヨウ化アルケニルまたはヨウ化アリー
ル；アルケニルシラン／ヨウ化アリール；アリールシラ
ン／アリールトリフレート；アルケニルシラン／塩化ア
リール；ビス（ピナコラート）ジボロン／臭化アリー
ル；臭化アリールまたはヨウ化アリール／テトラアリー
ルボレート；ジシラン／ヨウ化アルケニル；塩化ベンジ
ル／ジシラン；塩化カルボニル／ジシラン；マロノニト
リルまたはシアノ酢酸エステル／臭化アリールまたはヨ
ウ化アリール；臭化アリール／アルキルアミンまたはア
リールアミン；ヨウ化アリールまたは臭化アリール／ア
ルカンチオールまたはアリールチオール；ヨウ化アリー
ル／ホスフィン酸エステル；臭化アリールまたはヨウ化
アリール／末端アルキン；塩化アルケニル、臭化アルケ
ニルまたはヨウ化アルケニル／末端アルキン；ヨウ化ア
ルケン／アルキニルスズ試薬；ヨウ化アルキニル／末端
アルキン；臭化アリールまたはヨウ化アリール／内部ア
ルキン；臭化アルケンまたはヨウ化アルケン／内部アル
キン；アリールトリフレート、塩化アリール、臭化アリ
ールまたはヨウ化アリール／アルコールまたはアミン／
一酸化炭素（外部よりガスとして供給）；ヨウ化アリー
ル／アルキル亜鉛試薬；アルケニルトリフレート／アル
ケニルスズ試薬／一酸化炭素（外部よりガスとして供
給）；カルボニルハライド／レフォルマツキー試薬；エ
ノン／マロン酸エステルまたはスルホニル酢酸エステ
ル；アリルエステル類またはアリルハライド類／マロン
酸エステルやスルホニル酢酸エステル等の活性メチレン
化合物；アリルエステル類またはアリルハライド類／ケ
トンのシリルエノールエーテル類およびエノールエステ
ル類；共役ジエン／共役ジエン；共役ジエン／アルコー
ル；共役ジエン／フェノール類；共役ジエン／カルボン
酸類；共役ジエン／１級アミンまたは２級アミン；共役
ジエン／活性メチレン化合物；共役ジエン／ニトロアル
カン；共役ジエン／ニトロアルカン；共役ジエン／エナ
ミン；共役ジエン／ケイ素水素結合を有するシラン類；
共役ジエン／アルコール類／一酸化炭素（外部よりガス
として供給）；共役ジエン／ジシラン；カルボニルハラ
イド／共役ジエン／ジシラン類；カテコールボラン／共
役ジエン；アルキン／アクリル酸エステル；アルキン／
アルコール／一酸化炭素（外部よりガスとして供給）；
プロパルギルアルコール／ハロ炭酸エステル；プロパル
ギルアルコール炭酸エステル／活性メチレン化合物／一
酸化炭素（外部よりガスとして供給）；プロパルギルア
ルコール炭酸エステル／活性メチレン化合物；エチニル
オキシラン類／活性メチレン化合物；プロパルギルメタ
ンスルホネート／アリールアミン；共役ジエン／オレフ
ィン；末端オレフィン／アルコール／一酸化炭素（外部
よりガスとして供給）；末端アルキン／アルコール／一
酸化炭素（外部よりガスとして供給）；末端アルキン／
ケイ素水素結合を有するシラン類／一酸化炭素（外部よ
りガスとして供給）；オレフィン／オレフィン；オレフ
ィン／アルキン；アルキン／アルキン；末端アルキン／
末端アルキン；アリルアルコールまたはその炭酸エステ
ル／アルデヒド類；ヨウ化アリールまたはアリールトリ
フレート／亜リン酸エステル；ヨウ化アリールまたは臭
化アリール／末端アルキンまたは末端オレフィン；ジア
リールヨウドニウム塩／オレフィンまたはアクリル酸。
【００２５】（２）ニッケル触媒 ヨウ化ビニル／オレフィン； グリニャール試薬／臭化
アリール；アリールボロン酸／塩化アリール；アリール
ボロン酸／アリールメタンスルホネート；アリールトリ
フレート／ジアリールホスフィン；酸化ジアリールホス
フィン／アリールトリフレート；アルケニルカルバメー
ト／アルキニルグリニャール試薬；塩化アリール、臭化
アリールまたはヨウ化アリール／塩化アリール、臭化ア
リールまたはヨウ化アリール；アリールトリフレート／
アリールトリフレート；共役ジエン／共役ジエン；アル
キン／共役ジエン；共役ジエン／オレフィン；プロピオ
ール酸エステル／プロピオール酸エステル；末端アルキ
ン／末端アルキン。
アリール；アリールボロン酸／塩化アリール；アリール
ボロン酸／アリールメタンスルホネート；アリールトリ
フレート／ジアリールホスフィン；酸化ジアリールホス
フィン／アリールトリフレート；アルケニルカルバメー
ト／アルキニルグリニャール試薬；塩化アリール、臭化
アリールまたはヨウ化アリール／塩化アリール、臭化ア
リールまたはヨウ化アリール；アリールトリフレート／
アリールトリフレート；共役ジエン／共役ジエン；アル
キン／共役ジエン；共役ジエン／オレフィン；プロピオ
ール酸エステル／プロピオール酸エステル；末端アルキ
ン／末端アルキン。
【００２６】（３）鉄触媒 共役ジエン／共役ジエン；アルキン／共役ジエン；共役
ジエン／オレフィン；アルキン／アルキン。 （４）チタン触媒 共役ジエン／オレフィン；ケトン／ケトン。 （５）ロジウム触媒 アルキン／共役ジエン；アルキン／オレフィン；ジアゾ
化合物／オレフィン；ジアゾ化合物／ケトン類；アルキ
ン／アルキン；アルキン／水素ケイ素結合を有するシラ
ン類。
ジエン／オレフィン；アルキン／アルキン。 （４）チタン触媒 共役ジエン／オレフィン；ケトン／ケトン。 （５）ロジウム触媒 アルキン／共役ジエン；アルキン／オレフィン；ジアゾ
化合物／オレフィン；ジアゾ化合物／ケトン類；アルキ
ン／アルキン；アルキン／水素ケイ素結合を有するシラ
ン類。
【００２７】（６）コバルト触媒 共役ジエン／共役ジエン；共役ジエン／アクリル酸エス
テル；アルキン／ニトリル；アルキン／アルキン。 （７）ルテニウム触媒 共役ジエン／アクリルアミド；末端アルキン／α，β，
γ，δ−不飽和カルボン酸エステル；オレフィン／オレ
フィン；アルキン／アルキン；アルキン／ニトリル；ア
ルキン／オレフィン；アルキン／イソシアネート；α，
β−不飽和ニトリル／α，β−不飽和ニトリル／水素
（外部よりガスとして供給）；アクリル酸エステル／ア
クリル酸エステル；アルキン／アクリル酸エステル；水
素ケイ素結合を有するシラン類。 （８）白金触媒 共役ジエン／ジボラン類；オレフィン／水素ケイ素結合
を有するシラン類；アルキン／水素ケイ素結合を有する
シラン類。
テル；アルキン／ニトリル；アルキン／アルキン。 （７）ルテニウム触媒 共役ジエン／アクリルアミド；末端アルキン／α，β，
γ，δ−不飽和カルボン酸エステル；オレフィン／オレ
フィン；アルキン／アルキン；アルキン／ニトリル；ア
ルキン／オレフィン；アルキン／イソシアネート；α，
β−不飽和ニトリル／α，β−不飽和ニトリル／水素
（外部よりガスとして供給）；アクリル酸エステル／ア
クリル酸エステル；アルキン／アクリル酸エステル；水
素ケイ素結合を有するシラン類。 （８）白金触媒 共役ジエン／ジボラン類；オレフィン／水素ケイ素結合
を有するシラン類；アルキン／水素ケイ素結合を有する
シラン類。
【００２８】（９）タングステン触媒 オレフィン／オレフィン；オレフィン／ケトン類。 （１０）レニウム触媒 オレフィン／オレフィン。 （１１）モリブデン触媒 オレフィン／ケトン類。
【００２９】（１２）銅触媒 ジアゾ化合物／オレフィン。 （１３）クロム触媒 ｇｅｍ−ジヨウ化アルキル／アルデヒド。 （１４）スカンジウム、ランタニド触媒 エノールシリルエーテル／アルデヒド；アリルスズ試薬
／アルデヒド；α，β−不飽和カルボニル化合物／共役
ジエン；エノールシリルエーテル／イミン；エノールエ
ーテル／イミン；イミン／共役ジエン。
／アルデヒド；α，β−不飽和カルボニル化合物／共役
ジエン；エノールシリルエーテル／イミン；エノールエ
ーテル／イミン；イミン／共役ジエン。
【００３０】本発明において、特に好ましい組合せは、
パラジウム触媒を用いたアルキルボロン酸、アルケニル
ボロン酸、アリールボロン酸のそれぞれに対してハロゲ
ン化アルケニルまたはハロゲン化アリールの組合せ、パ
ラジウム触媒を用いたハロゲン化アリール、ハロゲン化
アルケニルのそれぞれに対して末端アルキンの組合せ
（この反応にはヨウ化銅を添加することがさらに好まし
い）である。
パラジウム触媒を用いたアルキルボロン酸、アルケニル
ボロン酸、アリールボロン酸のそれぞれに対してハロゲ
ン化アルケニルまたはハロゲン化アリールの組合せ、パ
ラジウム触媒を用いたハロゲン化アリール、ハロゲン化
アルケニルのそれぞれに対して末端アルキンの組合せ
（この反応にはヨウ化銅を添加することがさらに好まし
い）である。
【００３１】本発明で用いられる遷移金属触媒は種々の
酸化状態が可能であり、個々の反応に適した酸化状態を
上述の成書やその引用文献を参考に適当なものを選択す
ることができる。ゼロ価以外の場合には対アニオンを必
要とするが、その際の対アニオンとしても種々のアニオ
ンが使用できる。この例としては、ハロゲン化物イオン
（フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ
化物イオンなど）、カルボキシレートイオン（アセテー
ト、シトレート、オキザレートなど）、スルホネート
（メタンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネー
ト、パラトルエンスルホネートなど）、硫酸イオン、硝
酸イオン、シクロペンタジエニル、ペンタメチルシクロ
ペンタジエニルなどが挙げられる。
酸化状態が可能であり、個々の反応に適した酸化状態を
上述の成書やその引用文献を参考に適当なものを選択す
ることができる。ゼロ価以外の場合には対アニオンを必
要とするが、その際の対アニオンとしても種々のアニオ
ンが使用できる。この例としては、ハロゲン化物イオン
（フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ
化物イオンなど）、カルボキシレートイオン（アセテー
ト、シトレート、オキザレートなど）、スルホネート
（メタンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネー
ト、パラトルエンスルホネートなど）、硫酸イオン、硝
酸イオン、シクロペンタジエニル、ペンタメチルシクロ
ペンタジエニルなどが挙げられる。
【００３２】遷移金属触媒は酸化状態とともに、配位す
る化合物によっても触媒作用に大きな違いがあることが
知られている。個々の反応に適した配位子は上述の成書
やその引用文献を参考に適当なものを選択することがで
きるが、通常、以下の例の中から適宜選択される。具体
例として、アセチルアセトン、Ｎ，Ｎ'−ビス（ベンジ
リデン）エチレンジアミン、２，２'−ビス（ジフェニ
ルホスフィノ）−１，１'−ビナフチル、［２−（ジフ
ェニルホスフィノ−１，１'−ビナフタレン−２'−イ
ル）１，１'−ビナフタレン−２，２'−イル］ホスフィ
ン、１，１'−ビ−２−ナフトール、２，２'−ビス（ジ
フェニルホスフィノ）−６，６'−ジメチル−１，１'−
ビフェニル、（２Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボ
ニル−２，４−ビス（ジフェニルホスフィノ）メチルピ
ロリジン、２，２'−ビピリジル、１，５，９−シクロ
ドデカトリエン、１，５−シクロオクタジエン、シクロ
オクタテトラエン、ジベンジリデンアセトン、１，４−
ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、２，３−ジシ
クロヘキシルホスフィノ）エタン、２，３−Ｏ−イソプ
ロピリデン−２，３−ジヒドロキシ−１，４−ビス（ジ
フェニルホスフィノ）ブタン、１，２−ビス［（ｏ−メ
トキシフェニル）フェニルホスフィノ］エタン、１，２
−ジメトキシエタン、ジフェニル（ｍ−スルホフェニ
ル）ホスフィン、ビス（ジフェニルホスフィノ）エタ
ン、ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタン、１，１'−
ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン、ビス（ジフ
ェニルホスフィノ）プロパン、エチレンビス（テトラヒ
ドロインデニル）、２，２'−ビス［１−（ジフェニル
ホスフィノ）エチル］−１，１'−ビフェロセン、１，
１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，２−
（ジフェニルホスフィノ）フェロセニルエチルアミン、
１，２−ビス（トランス−２，５−ジイソプロピルホス
ホラノ）エタン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジ
ン、トリ（２，６−ジメトキシフェニル）ホスフィン、
トリ（２−フリル）ホスフィン、トリメチロールプロパ
ンホスファイト、トリ（ｍ−スルホフェニル）ホスフィ
ン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，２−エチレ
ンジアミン、トリ（ｏ−トリル）ホスファイト、および
トリフェニルホスフィンを挙げることができる。
る化合物によっても触媒作用に大きな違いがあることが
知られている。個々の反応に適した配位子は上述の成書
やその引用文献を参考に適当なものを選択することがで
きるが、通常、以下の例の中から適宜選択される。具体
例として、アセチルアセトン、Ｎ，Ｎ'−ビス（ベンジ
リデン）エチレンジアミン、２，２'−ビス（ジフェニ
ルホスフィノ）−１，１'−ビナフチル、［２−（ジフ
ェニルホスフィノ−１，１'−ビナフタレン−２'−イ
ル）１，１'−ビナフタレン−２，２'−イル］ホスフィ
ン、１，１'−ビ−２−ナフトール、２，２'−ビス（ジ
フェニルホスフィノ）−６，６'−ジメチル−１，１'−
ビフェニル、（２Ｓ，４Ｓ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボ
ニル−２，４−ビス（ジフェニルホスフィノ）メチルピ
ロリジン、２，２'−ビピリジル、１，５，９−シクロ
ドデカトリエン、１，５−シクロオクタジエン、シクロ
オクタテトラエン、ジベンジリデンアセトン、１，４−
ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、２，３−ジシ
クロヘキシルホスフィノ）エタン、２，３−Ｏ−イソプ
ロピリデン−２，３−ジヒドロキシ−１，４−ビス（ジ
フェニルホスフィノ）ブタン、１，２−ビス［（ｏ−メ
トキシフェニル）フェニルホスフィノ］エタン、１，２
−ジメトキシエタン、ジフェニル（ｍ−スルホフェニ
ル）ホスフィン、ビス（ジフェニルホスフィノ）エタ
ン、ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタン、１，１'−
ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン、ビス（ジフ
ェニルホスフィノ）プロパン、エチレンビス（テトラヒ
ドロインデニル）、２，２'−ビス［１−（ジフェニル
ホスフィノ）エチル］−１，１'−ビフェロセン、１，
１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，２−
（ジフェニルホスフィノ）フェロセニルエチルアミン、
１，２−ビス（トランス−２，５−ジイソプロピルホス
ホラノ）エタン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジ
ン、トリ（２，６−ジメトキシフェニル）ホスフィン、
トリ（２−フリル）ホスフィン、トリメチロールプロパ
ンホスファイト、トリ（ｍ−スルホフェニル）ホスフィ
ン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，２−エチレ
ンジアミン、トリ（ｏ−トリル）ホスファイト、および
トリフェニルホスフィンを挙げることができる。
【００３３】これらの配位子は予め遷移金属触媒の配位
子として調製して用いてもよいし、あるいは反応時に反
応系に添加する方法を用いることもできる。また、一種
のみを用いることもできるが、数種を組み合わせて用い
ることもできる。
子として調製して用いてもよいし、あるいは反応時に反
応系に添加する方法を用いることもできる。また、一種
のみを用いることもできるが、数種を組み合わせて用い
ることもできる。
【００３４】本発明の遷移金属触媒を用いる反応におい
ては、塩基が反応を促進する場合があり、本発明におい
ても塩基を好ましく用いることができる。本発明で用い
ることができる塩基は無機または有機の塩基でもよく、
これらを組み合わせて用いることも好ましい。無機塩基
の例としては炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシ
ウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化セシウム、水酸化カルシウム、水酸化マグ
ネシウムなどが挙げられる。有機塩基の例としては、ト
リメチルアミン、トリエチルアミン、水酸化テトラメチ
ルアンモニウム、ジメチルベンジルアミン、ジエチルア
ニリン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、１，
４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８−
ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、ナト
リウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−
ｔ−ブトキシド、ｎ−ブチルリチウム、リチウムジイソ
プロピルアミド、フッ化テトラブチルアンモニウム、酢
酸ナトリウム、酢酸カリウムなどが挙げられる。
ては、塩基が反応を促進する場合があり、本発明におい
ても塩基を好ましく用いることができる。本発明で用い
ることができる塩基は無機または有機の塩基でもよく、
これらを組み合わせて用いることも好ましい。無機塩基
の例としては炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシ
ウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化セシウム、水酸化カルシウム、水酸化マグ
ネシウムなどが挙げられる。有機塩基の例としては、ト
リメチルアミン、トリエチルアミン、水酸化テトラメチ
ルアンモニウム、ジメチルベンジルアミン、ジエチルア
ニリン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、１，
４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８−
ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、ナト
リウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−
ｔ−ブトキシド、ｎ−ブチルリチウム、リチウムジイソ
プロピルアミド、フッ化テトラブチルアンモニウム、酢
酸ナトリウム、酢酸カリウムなどが挙げられる。
【００３５】本発明の遷移金属触媒を用いる反応におい
ては、溶媒として水の他に種々の有機溶媒を用いること
ができる。有機溶媒としてはトルエン、キシレン、ｎ−
ヘキサンのような疎水的な溶媒を用いることもできる
が、水と混和する極性の高い溶媒が好ましい。その例と
しては、酢酸エチル、酢酸メチル、メタノール、エタノ
ール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ｔ−
ブタノール、スルホラン、１，２−ジメトキシエタン、
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチ
ルアセタミド、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジ
エチルエーテル、テトラヒドロフラン、エチレングリコ
ール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオ
ール、グリセリン、２−メトキシエタノール、ジエチレ
ングリコール、ジエチレングリコールジメチルエーテ
ル、酢酸、ピリジン、ギ酸、プロピオン酸、酪酸などが
挙げられる。
ては、溶媒として水の他に種々の有機溶媒を用いること
ができる。有機溶媒としてはトルエン、キシレン、ｎ−
ヘキサンのような疎水的な溶媒を用いることもできる
が、水と混和する極性の高い溶媒が好ましい。その例と
しては、酢酸エチル、酢酸メチル、メタノール、エタノ
ール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ｔ−
ブタノール、スルホラン、１，２−ジメトキシエタン、
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチ
ルアセタミド、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジ
エチルエーテル、テトラヒドロフラン、エチレングリコ
ール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオ
ール、グリセリン、２−メトキシエタノール、ジエチレ
ングリコール、ジエチレングリコールジメチルエーテ
ル、酢酸、ピリジン、ギ酸、プロピオン酸、酪酸などが
挙げられる。
【００３６】本発明の遷移金属触媒を用いる共有結合形
成反応においては、反応時、室温付近あるいは冷却して
反応することができるが、加熱することも好ましい。冷
却する場合は、その温度は５乃至１０℃の範囲にあるこ
とが好ましく、加熱する場合には、その温度は４０乃至
１５０℃の範囲にあることが好ましく、５０乃至１３０
℃の範囲にあることがより好ましく、５０乃至１００℃
の範囲にあることが特に好ましい。また、反応の際には
反応溶媒の揮発、揮散を防ぐ目的、あるいは調湿やガス
状の試薬を供給するためにで周囲を隔壁で覆って行うこ
とも好ましい。圧力をかける必要がある反応については
オートクレーブなどの耐圧力容器中で反応を行うことも
できる。
成反応においては、反応時、室温付近あるいは冷却して
反応することができるが、加熱することも好ましい。冷
却する場合は、その温度は５乃至１０℃の範囲にあるこ
とが好ましく、加熱する場合には、その温度は４０乃至
１５０℃の範囲にあることが好ましく、５０乃至１３０
℃の範囲にあることがより好ましく、５０乃至１００℃
の範囲にあることが特に好ましい。また、反応の際には
反応溶媒の揮発、揮散を防ぐ目的、あるいは調湿やガス
状の試薬を供給するためにで周囲を隔壁で覆って行うこ
とも好ましい。圧力をかける必要がある反応については
オートクレーブなどの耐圧力容器中で反応を行うことも
できる。
【００３７】以下に、本発明の代表的な固定方法を示
す。遷移金属触媒の作用によって共有結合を形成する官
能基を有する化合物（２）を固相担体表面に担持してな
る固相担体（１）に、末端に遷移金属触媒の作用によっ
て共有結合を形成する官能基を有するＤＮＡ断片を含む
水性液体を点着する。点着部分において、遷移金属触媒
が存在するように固相担体に均一におよび／または点着
する液体中に存在させる。必要があれば塩基などの促進
剤も同様に存在させる。ＤＮＡ断片が共有結合を形成す
る。このように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行
い、必要によっては加熱処理を施すことによってＤＮＡ
チップ（３）を得ることができる。ここで、ＤＮＡ断片
が有する官能基とＤＮＡ断片のリン酸エステル基との間
には、合成の都合上クロスリンカーを存在していてもよ
い。以下、各工程について説明する。
す。遷移金属触媒の作用によって共有結合を形成する官
能基を有する化合物（２）を固相担体表面に担持してな
る固相担体（１）に、末端に遷移金属触媒の作用によっ
て共有結合を形成する官能基を有するＤＮＡ断片を含む
水性液体を点着する。点着部分において、遷移金属触媒
が存在するように固相担体に均一におよび／または点着
する液体中に存在させる。必要があれば塩基などの促進
剤も同様に存在させる。ＤＮＡ断片が共有結合を形成す
る。このように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行
い、必要によっては加熱処理を施すことによってＤＮＡ
チップ（３）を得ることができる。ここで、ＤＮＡ断片
が有する官能基とＤＮＡ断片のリン酸エステル基との間
には、合成の都合上クロスリンカーを存在していてもよ
い。以下、各工程について説明する。
【００３８】固相担体としては、疎水性、あるいは親水
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金
などの導電性金属などを拳げることができる。多孔質物
質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にある
ことが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが
特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリ
コンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容
易さや電気化学的方法による解析の容易さによるもので
ある。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範
囲にあることが好ましい。
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金
などの導電性金属などを拳げることができる。多孔質物
質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にある
ことが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが
特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリ
コンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容
易さや電気化学的方法による解析の容易さによるもので
ある。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範
囲にあることが好ましい。
【００３９】遷移金属触媒の作用によって共有結合を形
成する官能基を有する化合物が固定された固相担体は、
次のようにして作製することができる。ガラス製の担体
の場合には、遷移金属触媒の作用によって共有結合を形
成する官能基を有するシランカップリング剤を接触、反
応させて固相表面上に遷移金属触媒の作用によって共有
結合を形成する官能基を有する固相担体を得ることがで
きる。この際に該官能基は一時的に保護された形で導入
し、後で脱保護するようにしてもよい。
成する官能基を有する化合物が固定された固相担体は、
次のようにして作製することができる。ガラス製の担体
の場合には、遷移金属触媒の作用によって共有結合を形
成する官能基を有するシランカップリング剤を接触、反
応させて固相表面上に遷移金属触媒の作用によって共有
結合を形成する官能基を有する固相担体を得ることがで
きる。この際に該官能基は一時的に保護された形で導入
し、後で脱保護するようにしてもよい。
【００４０】表面にアミノ基を有する固相担体（例え
ば、ガラス製担体表面を３−アミノプロピルトリメトシ
キシランを作用させて作製する）を用いる場合には、遷
移金属触媒の作用によって共有結合を形成する官能基を
有する化合物にアミノ基との反応が可能な基を結合し
て、該アミノ基に反応させることによって得ることがで
きる。このような連結基の例としては、カルボキシル
基、ホルミル基、スルホ基、イソシアナト基、イソチオ
シアナト基、酸無水物などが挙げられ、結合の際には、
加熱や適当な塩基、縮合剤を用いて固定する方法を用い
ることができる。この中ではカルボキシル基を有するも
のであり、縮合剤（カルボジイミド化合物など）を用い
てアミド結合を形成する方法が好ましい。
ば、ガラス製担体表面を３−アミノプロピルトリメトシ
キシランを作用させて作製する）を用いる場合には、遷
移金属触媒の作用によって共有結合を形成する官能基を
有する化合物にアミノ基との反応が可能な基を結合し
て、該アミノ基に反応させることによって得ることがで
きる。このような連結基の例としては、カルボキシル
基、ホルミル基、スルホ基、イソシアナト基、イソチオ
シアナト基、酸無水物などが挙げられ、結合の際には、
加熱や適当な塩基、縮合剤を用いて固定する方法を用い
ることができる。この中ではカルボキシル基を有するも
のであり、縮合剤（カルボジイミド化合物など）を用い
てアミド結合を形成する方法が好ましい。
【００４１】遷移金属触媒の作用によって共有結合を形
成する官能基を有する重合性モノマーを構成単位として
有するポリマーを担持した固相担体も好ましく用いるこ
とができる。これらの重合性モノマーはホモポリマーと
して用いることもできるが、適宜、他の重合性モノマー
と共重合して用いることも好ましい。この時に共重合の
モノマーとしてシランカップリング剤の部分構造を有す
るものを用いてもよい。これらのポリマーは、ラテック
スとして担体表面に塗布した後、加熱処理などによって
融着させる方法もとることができる。
成する官能基を有する重合性モノマーを構成単位として
有するポリマーを担持した固相担体も好ましく用いるこ
とができる。これらの重合性モノマーはホモポリマーと
して用いることもできるが、適宜、他の重合性モノマー
と共重合して用いることも好ましい。この時に共重合の
モノマーとしてシランカップリング剤の部分構造を有す
るものを用いてもよい。これらのポリマーは、ラテック
スとして担体表面に塗布した後、加熱処理などによって
融着させる方法もとることができる。
【００４２】遷移金属触媒の作用によって共有結合を形
成する官能基を有する化合物がアクリレートやアクリル
アミドの部分構造を有するものについては、多官能のモ
ノマーを重合させ、重合せずに残存した重合性官能基を
用いて遷移金属触媒の作用によって共有結合をさせる方
法もとることができる。
成する官能基を有する化合物がアクリレートやアクリル
アミドの部分構造を有するものについては、多官能のモ
ノマーを重合させ、重合せずに残存した重合性官能基を
用いて遷移金属触媒の作用によって共有結合をさせる方
法もとることができる。
【００４３】遷移金属触媒の作用によって共有結合を形
成する官能基を有する化合物がアミノ基や脂肪族水酸基
を有している場合には、基板上に固定するため、多官能
カップリング剤を固定化剤としてを用いることができ
る。このような固定化剤としてはシランカップリング
剤、多官能エポキシ化合物、多官能ビニルスルホン、塩
化シアヌルなどの多点反応剤が好ましく用いられる。こ
の中ではシランカップリング剤が好ましく、シランカッ
プリング剤の例としては１，２−ビス（トリメトキシシ
リル）エタン、１，７−ジクロロオクタメチルテトラシ
ロキサン、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトラ
イソプロピルシロキサン、３−グリシジルオキシプロピ
ルトリメトキシシランなどが挙げられる。また、シラン
カップリング剤を構成モノマーとして有するポリマーを
用いることもできる。脂肪族水酸基を有する化合物を固
定する担体上には、層間の密着を良くするために、ゼラ
チンなどの下塗り層を施してもよいし、コロナ放電など
により、担体表面を処理する方法も用いることができ
る。
成する官能基を有する化合物がアミノ基や脂肪族水酸基
を有している場合には、基板上に固定するため、多官能
カップリング剤を固定化剤としてを用いることができ
る。このような固定化剤としてはシランカップリング
剤、多官能エポキシ化合物、多官能ビニルスルホン、塩
化シアヌルなどの多点反応剤が好ましく用いられる。こ
の中ではシランカップリング剤が好ましく、シランカッ
プリング剤の例としては１，２−ビス（トリメトキシシ
リル）エタン、１，７−ジクロロオクタメチルテトラシ
ロキサン、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトラ
イソプロピルシロキサン、３−グリシジルオキシプロピ
ルトリメトキシシランなどが挙げられる。また、シラン
カップリング剤を構成モノマーとして有するポリマーを
用いることもできる。脂肪族水酸基を有する化合物を固
定する担体上には、層間の密着を良くするために、ゼラ
チンなどの下塗り層を施してもよいし、コロナ放電など
により、担体表面を処理する方法も用いることができ
る。
【００４４】遷移金属触媒の作用によって共有結合を形
成する官能基を有する化合物を固相担体に固定する工程
中では、酸、塩基や触媒の使用、水および有機溶媒の使
用、加熱なども適宜行うことができる。酸としては無機
酸および有機酸のいずれでも用いることができるが、塩
酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫酸、ｐ−トルエンスル
ホン酸などを用いることがより好ましく、トリフルオロ
酢酸もしくは酢酸を用いることが特に好ましい。
成する官能基を有する化合物を固相担体に固定する工程
中では、酸、塩基や触媒の使用、水および有機溶媒の使
用、加熱なども適宜行うことができる。酸としては無機
酸および有機酸のいずれでも用いることができるが、塩
酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫酸、ｐ−トルエンスル
ホン酸などを用いることがより好ましく、トリフルオロ
酢酸もしくは酢酸を用いることが特に好ましい。
【００４５】塩基としては、無機塩基および有機塩基の
何れも用いることができるが、１−メチル−２−ピロリ
ドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムある
いは炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−
メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピ
リジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２
−ピロリドンを用いることが特に好ましい。加熱して行
う場合には、その温度は、４０乃至１５０℃の範囲にあ
ることが好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあること
が特に好ましい。
何れも用いることができるが、１−メチル−２−ピロリ
ドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムある
いは炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−
メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピ
リジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２
−ピロリドンを用いることが特に好ましい。加熱して行
う場合には、その温度は、４０乃至１５０℃の範囲にあ
ることが好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあること
が特に好ましい。
【００４６】遷移金属触媒の作用によって共有結合を形
成する官能基を末端に有するＤＮＡ断片を得る方法は大
別して次の二つの方法が挙げられる。 （１）官能基を有するプライマーを用いてＰＣＲ法に
て、該官能基を有するＤＮＡ断片を増幅する方法。 （２）アミノ基などの反応性基を有するプライマーを用
いてＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅したのち、遷移金属
触媒の作用によって共有結合を形成する官能基を有する
化合物を連結する方法。 一般的には後者の方法が容易であり、本発明においても
好ましい。連結方法としては、カルボキシル基を有する
遷移金属触媒の作用によって共有結合を形成する官能基
を有する化合物とアミノ基を末端に有するＤＮＡ断片を
適当な縮合剤を用いてアミド結合により連結することが
できる。
成する官能基を末端に有するＤＮＡ断片を得る方法は大
別して次の二つの方法が挙げられる。 （１）官能基を有するプライマーを用いてＰＣＲ法に
て、該官能基を有するＤＮＡ断片を増幅する方法。 （２）アミノ基などの反応性基を有するプライマーを用
いてＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅したのち、遷移金属
触媒の作用によって共有結合を形成する官能基を有する
化合物を連結する方法。 一般的には後者の方法が容易であり、本発明においても
好ましい。連結方法としては、カルボキシル基を有する
遷移金属触媒の作用によって共有結合を形成する官能基
を有する化合物とアミノ基を末端に有するＤＮＡ断片を
適当な縮合剤を用いてアミド結合により連結することが
できる。
【００４７】表面処理がされた固相担体表面上には、さ
らに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減するこ
とができる。固相担体の種類によっては、その担体中に
親水性高分子等を含有させることも可能であり、このよ
うな処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。
らに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減するこ
とができる。固相担体の種類によっては、その担体中に
親水性高分子等を含有させることも可能であり、このよ
うな処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。
【００４８】クロスリンカーは、単結合、アルキレン基
あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であることが
好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルア
ミノへキシレン基であることが特に好ましい。
あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であることが
好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルア
ミノへキシレン基であることが特に好ましい。
【００４９】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。
【００５０】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。
【００５１】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ
目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、
９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環
境に置くことも好ましい。
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ
目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、
９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環
境に置くことも好ましい。
【００５２】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００５３】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。
して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。
【００５４】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。
【００５５】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。
【００５６】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブ
リッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレー
タを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方
法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチッ
プはこの検出方法に利用することもできる。
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブ
リッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレー
タを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方
法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチッ
プはこの検出方法に利用することもできる。
【００５７】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片
は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライ
マーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰ
ＣＲを行なって調製することが好ましい。
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片
は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライ
マーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰ
ＣＲを行なって調製することが好ましい。
【００５８】ハイブリダイゼーション操作は、９６穴も
しくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておい
た、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着するこ
とによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃
至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダ
イゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そ
して６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。
しくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておい
た、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着するこ
とによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃
至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダ
イゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そ
して６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。
【００５９】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。
【００６０】
【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作
成、およびＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）末端アルキンの導入されたスライド（Ｃ）の作成 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後、取り出し、エタ
ノールで洗浄した後、１１０℃で１０分間乾燥して、シ
ラン化合物被覆スライ（Ａ）を作成した。次いで、この
シラン化合物被覆スライド（Ａ）を、６−ヘプチノイッ
クアシッド（東京化成（株）製）４重量％、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩（東京化成（株）製）２重量％の混合水溶液（５
０ｍＬ）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリ
ルで洗浄し、１時間減圧下乾燥し、固相担体表面に末端
にアルキン（三重結合）の導入されたスライド（Ｃ１）
を作成した。また、上記（Ｃ１）の作成において６−ヘ
プチノイックアシッドの代わりに４−カルボキシフェニ
ルボロン酸（東京化成（株）製）を同様に反応させ、固
相担体表面上にアリールボロン酸が導入されたスライド
（Ｃ２）を作成した。
成、およびＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）末端アルキンの導入されたスライド（Ｃ）の作成 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後、取り出し、エタ
ノールで洗浄した後、１１０℃で１０分間乾燥して、シ
ラン化合物被覆スライ（Ａ）を作成した。次いで、この
シラン化合物被覆スライド（Ａ）を、６−ヘプチノイッ
クアシッド（東京化成（株）製）４重量％、１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩（東京化成（株）製）２重量％の混合水溶液（５
０ｍＬ）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリ
ルで洗浄し、１時間減圧下乾燥し、固相担体表面に末端
にアルキン（三重結合）の導入されたスライド（Ｃ１）
を作成した。また、上記（Ｃ１）の作成において６−ヘ
プチノイックアシッドの代わりに４−カルボキシフェニ
ルボロン酸（東京化成（株）製）を同様に反応させ、固
相担体表面上にアリールボロン酸が導入されたスライド
（Ｃ２）を作成した。
【００６１】（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３'末端および５'未端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試
薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤ
ＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を４−ヨウ
ド安息香酸および１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（いずれも東京化成
（株）製）で処理し、３'末端に４−ヨウドフェニルカ
ルボニルアミノ基が導入されたＤＮＡ断片を作成した。
このＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に
分散してなる水性液（１×１０-6Ｍ、１μＬ）とし、１
×１０-8Ｍとなるように、テトラキス［トリ（ｍ−スル
ホフェニル）ホスフィン］パラジウム（０）を添加した
のち、上記（１）で得たスライド（Ｃ１およびＣ２）に
これを点着した。直ちに、それぞれの点着後のスライド
を６０℃、湿度９５％にて１時間放置した後、このスラ
イドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈
した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との混合
溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄し
た。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍ無水コ
ハク酸アセトニトリル溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０
分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮ
Ａ断片が固定されたスライド（Ｄ１およびＤ２）を得
た。このスライド（Ｄ１およびＤ２）表面の蛍光強度を
蛍光スキャニング装置で測定したところ、それぞれ１７
５０および１７８０であった。本発明の固定化方法によ
り、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラスに固定された
ことが分かる。
薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤ
ＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を４−ヨウ
ド安息香酸および１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（いずれも東京化成
（株）製）で処理し、３'末端に４−ヨウドフェニルカ
ルボニルアミノ基が導入されたＤＮＡ断片を作成した。
このＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に
分散してなる水性液（１×１０-6Ｍ、１μＬ）とし、１
×１０-8Ｍとなるように、テトラキス［トリ（ｍ−スル
ホフェニル）ホスフィン］パラジウム（０）を添加した
のち、上記（１）で得たスライド（Ｃ１およびＣ２）に
これを点着した。直ちに、それぞれの点着後のスライド
を６０℃、湿度９５％にて１時間放置した後、このスラ
イドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈
した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との混合
溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄し
た。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍ無水コ
ハク酸アセトニトリル溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０
分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮ
Ａ断片が固定されたスライド（Ｄ１およびＤ２）を得
た。このスライド（Ｄ１およびＤ２）表面の蛍光強度を
蛍光スキャニング装置で測定したところ、それぞれ１７
５０および１７８０であった。本発明の固定化方法によ
り、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラスに固定された
ことが分かる。
【００６２】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 ５'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライドＤ１に対応するＤ３、およびＤ２に対
応するＤ４を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ３およびＤ４）に付与
し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイス
チャンバー内にて６０℃で２０時間インキュベートし
た。次いで、このものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳ
Ｃとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣ
との混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄
した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥し
た。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング
装置で測定したところ、Ｄ３とＤ４でそれぞれ、６８８
および７１０であった。本発明の固定化方法によって作
成されたＤＮＡチップを用いることによって、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する試料
ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライドＤ１に対応するＤ３、およびＤ２に対
応するＤ４を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ３およびＤ４）に付与
し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイス
チャンバー内にて６０℃で２０時間インキュベートし
た。次いで、このものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳ
Ｃとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣ
との混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄
した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥し
た。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング
装置で測定したところ、Ｄ３とＤ４でそれぞれ、６８８
および７１０であった。本発明の固定化方法によって作
成されたＤＮＡチップを用いることによって、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する試料
ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
【００６３】
【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面にアミノ酸をシランカップリング剤を用いて
導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合
も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製に繋がるも
のである。その一つの例として、本発明によって作製さ
れたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定
されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を
感度よく検出することができる。
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面にアミノ酸をシランカップリング剤を用いて
導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合
も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製に繋がるも
のである。その一つの例として、本発明によって作製さ
れたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定
されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を
感度よく検出することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA17 AA20 BA80 CA01 HA14 HA19 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC08 FA15 4B063 QA01 QA12 QA17 QA18 QA19 QQ03 QQ08 QQ42 QQ53 QR32 QR38 QR55 QR84 QS03 QS34 QS36 QS39 QX02 QX05 QX07
Claims (6)
- 【請求項１】 表面に反応性基を有する固相担体と、一
方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、液相に
て、遷移金属触媒の存在下で接触させることにより、双
方の反応性基間で反応させて共有結合を形成させること
を特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。 - 【請求項２】 遷移金属触媒が、スカンジウム、コバル
ト、ニッケル、銅、ルテニウム、ロジウム、パラジウム
およびランタニドからなる群より選ばれる金属元素を含
むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片の固相
担体表面への固定方法。 - 【請求項３】 固相担体表面の反応性基とＤＮＡ断片の
反応性基のうちのいずれかが二重結合もしくは三重結合
を有する反応性基であることを特徴とする請求項１もし
くは２に記載のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方
法。 - 【請求項４】 請求項１乃至３の内のいずれかの項に記
載の方法によって得られたＤＮＡチップ。 - 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
有する核酸断片の検出方法。 - 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレ
ータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮ
Ａチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮ
Ａ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構
造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から
発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検
出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対
して相補性を有する核酸断片の検出方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37018099A JP2001183367A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
| US09/749,146 US6368808B2 (en) | 1999-12-27 | 2000-12-27 | DNA chip and its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37018099A JP2001183367A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001183367A true JP2001183367A (ja) | 2001-07-06 |
Family
ID=18496270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37018099A Pending JP2001183367A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6368808B2 (ja) |
| JP (1) | JP2001183367A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004537050A (ja) * | 2001-07-25 | 2004-12-09 | ポスコ | 核酸ハイブリッド化検出方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6868289B2 (en) * | 2002-10-02 | 2005-03-15 | Standen Ltd. | Apparatus for treating a tumor or the like and articles incorporating the apparatus for treatment of the tumor |
| CN1610742B (zh) * | 2001-12-26 | 2010-05-05 | 佳能株式会社 | 探针介质 |
| DE10211741B4 (de) * | 2002-03-14 | 2005-12-01 | November Ag | Verfahren zum elektrochemischen Detektieren eines Analyten |
| US7332273B2 (en) * | 2002-06-20 | 2008-02-19 | Affymetrix, Inc. | Antireflective coatings for high-resolution photolithographic synthesis of DNA arrays |
| US20070275411A1 (en) | 2006-05-25 | 2007-11-29 | Mcgall Glenn H | Silane mixtures |
| US7851658B2 (en) * | 2004-08-17 | 2010-12-14 | President And Fellows Of Harvard College | Palladium-catalyzed carbon-carbon bond forming reactions |
| WO2007011722A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | President And Fellows Of Harvard College | Reaction discovery system |
| CN102424694B (zh) * | 2011-10-25 | 2014-09-17 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种钯配合物和共轭芳烃聚合物的制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5620850A (en) * | 1994-09-26 | 1997-04-15 | President And Fellows Of Harvard College | Molecular recognition at surfaces derivatized with self-assembled monolayers |
-
1999
- 1999-12-27 JP JP37018099A patent/JP2001183367A/ja active Pending
-
2000
- 2000-12-27 US US09/749,146 patent/US6368808B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004537050A (ja) * | 2001-07-25 | 2004-12-09 | ポスコ | 核酸ハイブリッド化検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20010005588A1 (en) | 2001-06-28 |
| US6368808B2 (en) | 2002-04-09 |
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