JP2001178469A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程が不要なＤＮＡチッ
プを得ること。 【解決手段】 末端部に官能基を有するＤＮＡ断片と、
該ＤＮＡ断片の官能基に対して反応性を示さない官能基
を表面に有する固相担体とを、該固相担体の官能基と反
応して、該官能基をＤＮＡ断片の末端官能基に対して反
応性を示すように変えることのできる反応性試薬の存在
下にて接触させることにより、該ＤＮＡ断片の末端官能
基と該固相担体の官能基とを反応させて、共有結合を生
じさせること特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への
固定方法、この方法により得られたＤＮＡチップ、そし
てそのＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ上のＤＮＡ断
片に対して相補性を有する核酸断片を検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる導電性基を持つ
インターカレータを利用する方法などが知られている。

【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。

【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。

【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。

【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。

【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。

【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。

【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。

【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。

【００１３】（１）末端部に官能基を有するＤＮＡ断片
と、該ＤＮＡ断片の官能基に対して反応性を示さない官
能基を表面に有する固相担体とを、該固相担体の官能基
と反応して、該官能基をＤＮＡ断片の末端官能基に対し
て反応性を示すように変えることのできる反応性試薬の
存在下にて接触させることにより、該ＤＮＡ断片の末端
官能基と該固相担体の官能基とを反応させて、共有結合
を生じさせること特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面
への固定方法。この固定方法において、ＤＮＡ断片の末
端官能基がアミノ基であり、固相担体表面の官能基が一
級もしくは二級の脂肪族水酸基であることが望ましく、
またこの場合には、反応性試薬として、酸無水物および
カルボジイミド化合物からなる群から選ばれる少なくと
も一つの化合物とスルホキシド化合物とからなる組合わ
せからなる試薬を用いることが好ましい。 （２）上記の方法によって得られたＤＮＡチップ。

【００１４】（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、導電性基を有する
インターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与
する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と
相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーション
によってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡ
チップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハ
イブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの導
電性基を介して流れる電流を電気化学的に検出する工程
からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性
を有する核酸断片の検出方法。

【００１５】本発明は、固定対象のＤＮＡ断片および後
に行なわれる検出操作の試料核酸断片試料（被検体核酸
断片試料）とに対して相互作用の小さい固相担体を用
い、予め調製したＤＮＡ断片を固相担体上に点着した箇
所でのみ、該ＤＮＡ断片と固相担体との間に共有結合が
形成され、固定化が起こり、さらに、被検体核酸断片試
料との相互作用の小さい固相担体を用いている結果とし
て、ブロッキング工程が不要となるという、本発明の発
明者による新規な知見に基づいている。

【００１６】

【発明の実施の形態】次に、本発明を、本発明の好まし
い態様を中心にして説明する。本発明は以下のようにし
て具体化することが可能である。固相担体表面へのＤＮ
Ａ断片固定は共有結合の形成をもって行われる。この共
有結合の形成は、固相担体表面に一級または二級の脂肪
族水酸基を有する化合物を固定し、この脂肪族水酸基を
有する化合物とアミノ基を有するＤＮＡ断片間で形成す
る方法により有利に実施される。

【００１７】一般に、水酸基とアミノ基は混合しても反
応することはない。しかし、酸化性の化合物が共存する
と、一級または二級の脂肪族水酸基は酸化作用を受け、
アルデヒドまたはケトンに変換される。さらに、アルデ
ヒドやケトンはアミノ基と反応してシッフ塩基を形成す
る。この反応によりアミノ基を有するＤＮＡ断片を固相
担体表面に固定することが可能である。

【００１８】本発明は、上述の反応を用いてアミノ基を
有するＤＮＡ断片を固相担体表面に固定する際に、酸化
性の化合物を固定されるべきＤＮＡ断片を含む液体にの
み含有せしめ、該液体を脂肪族水酸基を有する化合物が
固定された固相担体上に点着することにより、点着部分
のみが共有結合性を発現し、共有結合を形成することが
できる。非点着部分では脂肪族水酸基を有する化合物が
酸化されないため、被検体核酸断片が非特異的に吸着さ
れることが極めて少なく、本発明によってブロッキング
工程を施す必要がない。

【００１９】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）水酸基を有する化合物を、固相担体表面に固定す
る。 （２）ＤＮＡ断片として、末端にアミノ基を有し、その
塩基配列が既知であるものを用いる。 （３）水酸基を有する化合物を固定した固相担体表面
に、酸化性の化合物を含有したＤＮＡ断片を含む液体を
点着し、点着部分においては水酸基を有する化合物、ア
ミノ基を有するＤＮＡ断片が共存するようにして、ＤＮ
Ａ断片を固定する。

【００２０】本発明のＤＮＡ断片固定固相担体（以下
「ＤＮＡチップ」という。）の好ましい例では、固相担
体表面に固定された一級または二級の脂肪族水酸基を有
する化合物に、共有結合を介してＤＮＡ断片が固定され
ている。ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定は、固相担
体表面に、脂肪族水酸基を有する化合物を固相担体表面
に固定する工程、そして酸化性の化合物を含有したＤＮ
Ａ断片を含む液体を点着し、点着部分においては水酸基
を有する化合物、酸化性の化合物、アミノ基を有するＤ
ＮＡ断片が共存するようにして、ＤＮＡ断片を固定する
工程を順次行うことによって有利に実施することができ
る。

【００２１】本発明の代表的な固定方法を以下に示す。
一級または二級の脂肪族水酸基を有する化合物（ＬＣＨ
（ＯＨ）Ｒ、但しＲは水素原子、アルキル基、アリール
基）を固相担体表面に担持してなる固相担体（１）に、
酸化性の化合物（２）を含有したＤＮＡ断片を含む液体
を点着する。点着部分においては水酸基を有する化合物
は酸化性の化合物と反応し、アルデヒドやケトンとな
り、生成したカルボニル基に対してアミノ基を有するＤ
ＮＡ断片が共有結合を形成する。このように、ＤＮＡ断
片を固定する工程を順次行うことによってＤＮＡチップ
（３）を得ることができる。ここで、ＤＮＡ断片が有す
るアミノ基とＤＮＡ断片のリン酸エステル基との間に
は、合成の都合上、クロスリンカーを存在させてもよ
い。Ｌは、脂肪族水酸基を有する化合物の選択により決
定される。以下、各工程について説明する。一級または
二級の脂肪族水酸基を有する化合物の中では一級の脂肪
族水酸基を有するものが好ましい。

【００２２】固相担体としては、疎水性、あるいは親水
性の低い担体を用いることが好ましい。また、その表面
が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用
いることができる。固相担体の材質としては、ガラス、
セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラ
ミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織物、織物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金
などの導電性金属などを拳げることができる。多孔質物
質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にある
ことが好ましく、２乃至５００n mの範囲にあることが
特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリ
コンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容
易さや電気化学的方法による解析の容易さによるもので
ある。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範
囲にあることが好ましい。

【００２３】脂肪族水酸基を有する化合物が固定された
固相担体は、次のようにして作製することができる。ガ
ラス製の担体の場合には、脂肪族水酸基を有するシラン
カップリング剤を接触、反応させて、該担体表面上に脂
肪族水酸基を有する固相担体を得ることができる。この
際に脂肪族水酸基はエステル結合などによって一時的に
保護された形で導入し、後で脱保護するようにしてもよ
い。

【００２４】表面にアミノ基を有する固相担体（例え
ば、ガラス製担体表面を３−アミノプロピルトリメトシ
キシランを作用させて作製する）を用いる場合には、該
アミノ基に、水酸基導入試薬（Ｘ¹）を反応させること
によって得ることができる。このような（Ｘ¹）の例と
しては、水酸基を有するカルボン酸（１１−ヒドロキシ
ウンデカン酸、２−ヒドロキシエチルメタクリレートと
３−カルボキシプロピルメタクリレートの共重合体な
ど）、ラクトン類（β−プロピオラクトン、β−ブチロ
ラクトン、γ−プロピオラクトン、フタリドなど）、環
状エーテル類（エチレンオキシド、グリシドール、オキ
セタンなど）、ハロアルコール類（２−クロロエタノー
ル、２−ブロモエタノール、３−ブロモプロパノールな
ど）を加熱や適当な塩基、縮合剤を用いて固定する方法
を用いることができる。この中で好ましいのは水酸基を
有するカルボン酸と縮合剤（カルボジイミド化合物な
ど）を用いる方法、ラクトン類を加熱処理する方法が好
ましい。

【００２５】脂肪族水酸基を有する重合性モノマーを構
成単位として有するポリマーを担持した固相担体も好ま
しく用いることができる。この場合、脂肪族水酸基を有
する重合性モノマーとしては３−ヒドロキシプロピルア
クリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、２−
ヒドロキシエチルメタクリレートなどが挙げられ、これ
らの重合性モノマーはホモポリマーとして用いることも
できるが、適宜、他の重合性モノマーと共重合して用い
ることも好ましい。この時に共重合のモノマーとしてシ
ランカップリング剤の部分構造を有するものを用いても
よい。これらのポリマーはラテックスとして担体表面に
塗布した後、加熱処理などによって融着させる方法もと
ることができる。

【００２６】また、ポリビニルアルコールやポリアリル
アルコールも好ましく用いられる。さらに、種々の脂肪
族水酸基を有するポリマーに他の化合物やポリマーを混
合して用いることもできる。

【００２７】上で述べた脂肪族水酸基を有する化合物を
固相担体に確実に固定する方法として、固定化剤を用い
る方法を挙げることができる。このような固定化剤とし
てはシランカップリング剤、多官能エポキシ化合物、多
官能ビニルスルホン、塩化シアヌルなどの多点反応剤が
好ましく用いられる。この中ではシランカップリング剤
が好ましく、シランカップリング剤の例としては１，２
−ビス（トリメトキシシリル）エタン、１，７−ジクロ
ロオクタメチルテトラシロキサン、１，３−ジクロロ−
１，１，３，３−テトライソプロピルシロキサン、３−
グリシジルオキシプロピルトリメトキシシランなどが挙
げられる。また、シランカップリング剤を構成モノマー
として有するポリマーを用いることもできる。脂肪族水
酸基を有する化合物を固定する担体上には、層間の密着
を良くするために、ゼラチンなどの下塗り層を施しても
よいし、コロナ放電などにより、担体表面を処理する方
法も用いることができる。

【００２８】上記の脂肪族水酸基を有する化合物を固相
担体に固定する工程中では、酸、塩基や触媒の使用、水
および有機溶媒の使用、加熱なども適宜行うことができ
る。酸としては無機酸および有機酸のいずれでも用いる
ことができるが、塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫
酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが好ましく、トリフル
オロ酢酸、酢酸が好ましい。

【００２９】塩基としては、無機塩基および有機塩基の
何れも用いることができるが、１−メチル−２−ピロリ
ドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムある
いは炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−
メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピ
リジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２
−ピロリドンを用いることが特に好ましい。加熱する場
合には、その温度が４０乃至１５０℃の範囲にあること
が好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあることが特に
好ましい。

【００３０】表面処理がされた固相担体表面上には、さ
らに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減するこ
とができる。固相担体の種類によっては、その担体中に
親水性高分子等を含有させることも可能であり、このよ
うな処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。

【００３１】本発明で用いられる酸化性の化合物は、一
級または二級の脂肪族水酸基を酸化可能なものである。
このような酸化剤としてはクロム酸、過マンガン酸塩、
二酸化マンガン、ピリジニウムクロロクロメートまたは
スルホキシド化合物／脱水作用を有する化合物の併用が
挙げられ、ピリジニウムクロロクロメートまたはスルホ
キシド化合物と脱水作用を有する化合物の併用がより好
ましく、スルホキシド化合物と脱水作用を有する化合物
の併用が最も好ましい。

【００３２】スルホキシド化合物の例としてはジメチル
スルホキシド、ジフェニルスルホキシド、メチルフェニ
ルスルホキシド、ジエチルスルホキシドなどが挙げら
れ、ジメチルスルホキシドが好ましい。脱水作用を有す
る化合物としてはカルボジイミド化合物または酸無水物
が好ましく、カルボジイミドが最も好ましい。カルボジ
イミド化合物としては水溶性の高いカルホジイミド化合
物が好ましく、ジイソプロピルカルボジイミド、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジ
イミドメート、ｐ−トルエンスルホネート、１−（３−
ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミ
ド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩などが好ましい。

【００３３】スルホキシド化合物と脱水作用を有する化
合物との併用を利用する際には、スルホキシド化合物と
脱水作用を有する化合物の少なくとも１つはＤＮＡ断片
を含む液体に含有させることが必要である。すなわち、
いずれか一方がＤＮＡ断片を含む液体に含有されている
場合、他方は固相担体に一様に添加されていても良い。
この際の好ましい態様としては、スルホキシド化合物を
ＤＮＡ断片を含む液体に含有させ、脱水作用を有する化
合物を固相担体に添加する方法、または脱水作用を有す
る化合物をＤＮＡ断片を含む液体に含有させ、スルホキ
シド化合物を固相担体に添加する方法である。

【００３４】クロスリンカーは、、単結合、アルキレン
基あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であること
が好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチル
アミノへキシレン基であることが特に好ましい。

【００３５】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。

【００３６】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。

【００３７】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１0₃乃至１０⁶の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ
目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、
９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環
境に置くことも好ましい。

【００３８】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。

【００３９】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０²乃至１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０¹⁵モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。

【００４０】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。

【００４１】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、例えば、シアニン色素（例えば、
ＣｙＤｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミ
ン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ²−アセチルアミノフ
ルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素
誘導体）を使用することができる。

【００４２】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブ
リッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレー
タを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方
法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチッ
プはこの検出方法に利用することもできる。

【００４３】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片
は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライ
マーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰ
ＣＲを行なって調製することが好ましい。

【００４４】ハイブリダイゼーション操作は、９６穴も
しくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておい
た、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着するこ
とによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃
至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダ
イゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして
６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイ
ブリダイゼーション操作終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。

【００４５】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。

【００４６】

【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作
成、およびＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）脂肪族水酸基を有する化合物が導入されたスライ
ド（Ｃ）の作成 ２重量％の１，２−ビス（トリエトキシシリル）エタン
（アルドリッチ社製）のエタノール溶液に、スライドガ
ラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出
し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥し
て、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次い
で、このシラン化合物被覆スライド（Ａ）を、ポリ（４
−ヒドロキシブチルアクリレート）４重量％水溶液（５
０ｍＬ）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリ
ルで洗浄し、１時間減圧下乾燥した。乾燥後の、スライ
ドをさらに２重量％の１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液に３０分
間浸した後、１時間減圧乾燥して、カルボジイミド化合
物を含有した１級脂肪族水酸基の導入されたスライド
（Ｃ）を作製した。

【００４７】（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３'末端および５'未端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試
薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤ
ＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を０．１Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（１×
１０^-6Ｍ、１μＬ）に、３重量％になるようにジメチル
スルホキシドを添加した溶液を作成し、上記（１）で得
たスライド（Ｃ）にこれを点着した。直ちに、点着後の
スライドを２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、
このスライドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２
倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）
との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次
洗浄した。次いで、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定
されたスライド（Ｄ１）を得た。このスライド（Ｄ１）
表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したとこ
ろ、１５１０であった。本発明の固定化方法により、Ｄ
ＮＡ断片が効率よくスライドガラスに固定されたことが
分かる。

【００４８】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 ３'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に点着し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、５１０であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。

【００４９】

【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面にアミノ酸をシランカップリング剤を用いて
導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合
も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製に繋がるも
のである。その一つの例として、本発明によって作製さ
れたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定
されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を
感度よく検出することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 末端部に官能基を有するＤＮＡ断片と、
   該ＤＮＡ断片の官能基に対して反応性を示さない官能基
   を表面に有する固相担体とを、該固相担体の官能基と反
   応して、該官能基をＤＮＡ断片の末端官能基に対して反
   応性を示すように変えることのできる反応性試薬の存在
   下にて接触させることにより、該ＤＮＡ断片の末端官能
   基と該固相担体の官能基とを反応させて、共有結合を生
   じさせること特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への
   固定方法。
2. 【請求項２】 ＤＮＡ断片の末端官能基がアミノ基であ
   り、固相担体表面の官能基が一級もしくは二級の脂肪族
   水酸基であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ
   断片の固相担体表面への固定方法。
3. 【請求項３】 反応性試薬が、酸無水物およびカルボジ
   イミド化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの
   化合物とスルホキシド化合物とからなることを特徴とす
   る請求項２に記載のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定
   方法。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３のうちのいずれかに記載
   の方法によって得られたＤＮＡチップ。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
   料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
   片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
   らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
   有する核酸断片の検出方法。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレ
   ータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、Ｄ
   ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
   る核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮ
   Ａチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮ
   Ａ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構
   造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から
   発する蛍光、もしくは導電性基を介して流れる電流を検
   出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対
   して相補性を有する核酸断片の検出方法。