JP2001178470A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固相担体表面に、ＤＮＡ断片を迅速な反応に
よって結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安
定に結合を維持することが可能な固定方法を開発するこ
と。 【解決手段】 表面に金属酸化膜が形成された固相担体
の表面に、ＤＮＡ断片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断
片を金属酸化膜に結合させることを特徴とするＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法、この方法により得られ
たＤＮＡチップ、そしてそのＤＮＡチップを用いるＤＮ
Ａチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断
片を検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もし
くは導電性基を持つインターカレータを利用する方法な
どが知られている。

【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。

【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。

【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。

【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。

【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。

【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。

【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。

【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有していた。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、ＤＮＡ断片を迅速な反応によって結合させること
が可能で、かつ、反応生成物が安定に結合を維持するこ
とが可能な固定方法、および核酸断片の検出方法を提供
することを、その課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。

【００１３】（１）表面に金属酸化膜が形成された固相
担体の表面に、ＤＮＡ断片を液相にて接触させ、該ＤＮ
Ａ断片を金属酸化膜に結合させることを特徴とするＤＮ
Ａ断片の固相担体表面への固定方法。この固定方法にお
いて用いる金属酸化物は、アルミニウム、チタン、ジル
コニウム、ハフニウム、ストロンチウム、亜鉛、インジ
ウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、
タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、鉄、ニ
ッケルまたは銀の酸化物であることが好ましい。また、
固相担体の表面へのＤＮＡ断片の液相にての接触を行な
った後、ｐＫａ値が１２以下の酸素酸で処理を行なうこ
とが好ましい。 （２）上記の方法により得られたＤＮＡチップ。

【００１４】（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしく
は導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料と
を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定され
ているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイ
ブリダーゼイションによってＤＮＡチップ上に固定する
工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料
とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたイ
ンターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは
導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。

【００１５】本発明者らは、種々の金属酸化物とＤＮＡ
断片との相互作用について研究した結果、アルミニウ
ム、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウ
ム、亜鉛、スズ、インジウム、イットリウム、ランタ
ン、バナジウム、ニオブ、タンタル、クロム、モリブデ
ン、タングステン、鉄、ニッケルまたは銀の酸化物とＤ
ＮＡ断片が極めて強い相互作用を有することを見出し
た。本発明はこの発見をもとに完成されたものである。

【００１６】本研究者らは以上の研究結果をもとに研究
を行ったところ、酸化物を薄膜状にし、ＤＮＡ断片の水
性液を点着することによって、ＤＮＡ断片に特別な官能
基を導入することなしに、強く固定化でき、ＤＮＡチッ
プとして十分に機能する強固な固定が可能になることを
見出した。さらに、ＤＮＡ断片が点着されなかった個所
においては、本発明の金属酸化物が露出しているため、
被検体である試料核酸断片が吸着されやすく、ハイブリ
ダイゼーションが起こった箇所を検出する際のバックグ
ラウンドが上昇し、感度低下を引き起こす場合がある。
このためＤＮＡ断片が点着されなかった個所を表面処理
により、被覆することが好ましい。

【００１７】本発明者らは以上の点に関してさらに検討
を行った結果、本発明の金属酸化物を用いるＤＮＡ断片
の固定方法においては、ｐＫａ１２以下の酸素酸を被覆
剤として用いることが、極めて好ましい結果を与えるこ
とを見出した。

【００１８】この中で、本発明で特に有効な酸素酸はリ
ン酸モノエステル類、リン酸ジエステル類、ホスホン酸
類、ホスホン酸モノエステル類、カルボン酸類、ホウ酸
モノエステル類、ホウ酸ジエステル類、スクアリン酸
類、カテコール類、ボロン酸類およびボロン酸モノエス
テル類である。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表
面への固定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）本発明の金属酸化物を基板上に薄膜として固定す
る。 （２）ＤＮＡ断片としてその塩基配列が既知であるもの
を用いる。 （３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成
したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着する。 （４）（３）で作成したＤＮＡ断片を固定した固体固相
担体を被覆剤で処理し、ＤＮＡ断片が点着されていない
部分を被覆する。

【００２０】次に、上記の各工程について順に述べる。

【００２１】本発明で用いられる金属酸化物は、アルミ
ニウム、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロン
チウム、亜鉛、スズ、インジウム、イットリウム、ラン
タン、バナジウム、ニオブ、タンタル、クロム、モリブ
デン、タングステン、鉄、ニッケルまたは銀の酸化物で
ある。以上の中でより好ましい金属酸化物は、アルミニ
ウム、チタン、ニオブ、スズ、亜鉛、タングステン、
鉄、ジルコニウム、バナジウム、鉛または銀であり、さ
らに好ましくはアルミニウム、チタン、スズ、タングス
テンまたは亜鉛であり、最も好ましくはアルミニウムま
たはチタンである。これらの金属酸化物は単独であって
も、また混合されていてもよく、ペロブスカイトのよう
な他成分系のものであってもよい。

【００２２】固相担体としては、疎水性、あるいは親水
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金
などの導電性材料などを拳げることができる。多孔質物
質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にある
ことが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが
特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリ
コンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容
易さや電気化学的方法による解析の容易さによるもので
ある。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範
囲にあることが好ましい。

【００２３】金属酸化物を固体基板上に固定する方法と
しては、支持基板としてはガラスまたはプラスチック等
を用いることができ、基板表面への本発明の金属酸化物
の固定は蒸着法や塗布法を用いるのが好ましい。

【００２４】次に、蒸着法について説明する。本発明の
金属酸化物を微粒子として塗布する場合には、粒径は一
般にｎｍ乃至μｍの範囲のオーダーであるが、投影面積
を円に換算したときの直径から求めた一次粒子の半径粒
径は５乃至２００ｎｍの範囲にあることが好ましく、８
乃至１００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。ま
た、分散液中の微粒子（二次粒子）の平均粒径は０．０
１乃至１００μｍにあることが好ましい。また、粒径分
布の異なる２種類以上の微粒子を混合してもよく、この
場合小さい粒子の平均サイズは５ｎｍ以下であることが
好ましい。

【００２５】本発明で用いられる金属酸化物微粒子の作
製法としては、作花済夫の「ゾルゲル法の科学」アグネ
承風社（１９９８年）、技術情報協会の「ゾルゲル法に
よる薄膜コーティング技術」（１９９５年）等に記載の
ゾルゲル法、杉本忠夫の「新合成法ゲルゾル法による単
分散粒子の合成とサイズ形態制御」、マテリア、第３５
巻、第９号、１０１２−１０２８頁（１９９６年）に記
載のゲルゾル法が好ましい。また、Ｄｅｇｕｓｓａ社が
開発した塩化物を酸水素塩中で高温加水分解により酸化
物を作製する方法も好ましい。

【００２６】酸化物微粒子が酸化チタンの場合、上記ゾ
ルゲル法、ゲルゾル法、塩化物の酸水素塩中での高温加
水分解法はいずれも好ましいが、さらに清野学の「酸化
チタン 物性と応用技術」技報堂出版（１９９７年）に
記載の硫酸法および塩素法を用いることもできる。さら
にゾルゲル法として、バーブらのジャーナル・オブ・ア
メリカン・セラミック・ソサエティー、第８０巻、第１
２号、３１５７−３１７１頁（１９９７年）に記載の方
法や、バーンサイドらのケミカル・マテリアルズ、第１
０巻、第９号、２４１９−２４２５頁に記載の方法も好
ましい。

【００２７】本発明の金属酸化物微粒子を固体基板上に
塗布するには、酸化体微粒子の分散液またはコロイド溶
液を固体基板上に塗布する方法の他に、前述のゾルゲル
法等を使用することもできる。ＤＮＡチップの量産化や
支持体の融通性を考慮すると、湿式の製膜方法が比較的
有利である。湿式の製膜方法としては、塗布法、印刷法
が代表的である。

【００２８】本発明の金属酸化物微粒子の分散液を作製
する方法としては、前述のゾルゲル法の他に、乳鉢です
りつぶす方法、ミルを使って粉砕しながら分散する方
法、あるいは金属酸化物を合成する際に、溶媒中で微粒
子として析出させ、そのまま使用する方法が挙げられ
る。

【００２９】分散媒としては、水または各種の有機溶媒
（例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコ
ール、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、酢
酸エチル等）が挙げられる。分散の際、必要に応じてポ
リマー、界面活性剤、酸またはキレート剤等を分散助剤
として用いてもよい。

【００３０】塗布方法としては、アプリケーション系と
してローラ法、ディップ法、メータリング系としてはエ
アーナイフ法、ブレード法等、またアプリケーションと
メータリングを同一部分にできるものとして、特公昭５
８−４５８９号に開示されているワイヤーバー法、米国
特許２６８１２９４号、同２７６１４１９号、同２７６
１７９１号等に記載のスライドホッパー法、エクストル
ージョン法、カーテン法等が好ましい。また、汎用機と
してスピン法やスプレー法も好ましい。湿式印刷方法と
しては凸版、オフセットおよびグラビアの三大印刷法を
はじめ、凹版、ゴム版、スクリーン印刷等が好ましい。
これらの中から、液粘度やウェット厚さに応じて、好ま
しい製膜方法を選択する。

【００３１】本発明で用いる金属酸化物微粒子の分散液
の粘度は、該微粒子の種類や分散性、使用溶媒種、界面
活性剤やバインダー等の添加剤により大きく左右され
る。高粘度液（例えば、０．０１乃至５００Ｐｏｉｓｅ
の範囲）ではエクストルージョン法、キャスト法、スク
リーン印刷法等が好ましい。また、低粘度液（例えば、
０．１Ｐｏｉｓｅ以下）では、スライドホッパー法、ワ
イヤーバー法またはスピン法が好ましく、均一な膜にす
ることが可能である。なお、ある程度の塗布量があれ
ば、低粘度液の場合でもエクストルージョン法による塗
布は可能である。このように塗布液の粘度、塗布量、固
体基板種、塗布速度等に応じて、適宜湿式製膜方法を採
用すればよい。

【００３２】本発明の金属酸化物微粒子層の厚さは、
０．０１乃至１００μｍの範囲にあることが好ましく、
０．１乃至３０μｍの範囲にあることがより好ましく、
０．１３μｍの範囲にあることが特に好ましい。金属微
粒子の１ｍ²当たりの塗布量は、０．０１乃至４０ｇの
範囲にあることが好ましく、０．１乃至１０ｇの範囲に
あることが特に好ましい。

【００３３】本発明の金属酸化物微粒子を付与した固体
基板は、設置した膜と基板の密着性を向上させるため
に、加熱処理することが好ましい。加熱温度の範囲は、
４０乃至４００℃の範囲にあることが好ましく、６０乃
至３００℃の範囲にあることが特に好ましい。また、加
熱時間は、１分乃至１０時間の範囲にあることが好まし
い。ポリマーフィルムのように融点や軟化点の低い基板
を用いる場合、高温処理は支持体の劣化を招くため好ま
しくない。また、コストの観点からもできる限り低温で
あるのが好ましい。低温下では、先に述べた５ｎｍ以下
の小さい金属酸化物微粒子の併用や鉱酸の存在下での加
熱処理により可能となる。

【００３４】本発明の金属酸化物を用いるＤＮＡ断片の
固定方法においては、ｐＫａ値が１２以下の酸素酸を被
覆剤として用いることが、検出の際のバックグラウンド
を低下させ、好ましい結果を与える。

【００３５】この中で、本発明で特に有効な酸素酸は、
リン酸モノエステル類、リン酸ジエステル類、ホスホン
酸類、ホスホン酸モノエステル類、カルボン酸類、ホウ
酸モノエステル類、ホウ酸ジエステル類、スクアリン酸
類、カテコール類、ボロン酸類およびボロン酸モノエス
テル類である。

【００３６】以下、それぞれについて好ましい具体例を
挙げる。リン酸モノエステル類の例としては、リン酸モ
ノオクチルエステルジナトリウム塩、リン酸モノドデシ
ルエステルモノナトリウム塩、リン酸モノオクタデシル
エステルなどが挙げられる。リン酸ジエステル類として
は、リン酸ジベンジルエステル、リン酸ジブチルエステ
ル、リン酸ジデシルエステル、リン酸ジ−（２−エチル
ヘキシル）エステル、リン酸ジヘキサデシルエステルな
どが挙げられる。ホスホン酸類としては、４−ブトキシ
フェニルホスホン酸、ヘキシルホスホン酸、ドデシルホ
スホン酸などが挙げられる。ホスホン酸モノエステル類
としては、ベンジルホスホン酸モノエチルエステル、エ
トキシカルボニルメチルホスホン酸モノエチルエステル
などが挙げられる。カルボン酸類としては、プロピオン
酸、酪酸、ヘキサン酸、ドデカン酸、２−エチルヘキサ
ン酸、ヘキサデカン酸、安息香酸、３−クロロ安息香
酸、４−ドデシルオキシ安息香酸、ドデシルコハク酸、
４−ブトキシフタル酸などが挙げられる。ホウ酸モノエ
ステル類としては、ホウ酸モノデシルエステル、ホウ酸
モノオクタデシルエステルなどが挙げられる。ホウ酸ジ
エステル類としては、ホウ酸ジオクチルエステル、ホウ
酸ジヘキサデシルエステルなどが挙げられる。スクアリ
ン酸類としてはスクアリン酸、スクアリン酸ジナトリウ
ム塩、スクアリン酸モノシクロヘキシルエステルなどが
挙げられる。カテコール類としては、４−ｔ−ブチルカ
テコール、４−ヘキサデシルオキシカテコール、３，５
−ジ−ｔ−ブチルカテコール、３，５−ジスルホカテコ
ールジナトリウム塩などが挙げられる。ボロン酸類とし
ては、５−アセチルチオフェン−２−ボロン酸、ベンゾ
［ｂ］フラン−２−ボロン酸、４−ベンジルオキシフェ
ニルボロン酸、４−ビフェニルボロン酸、４−ブチルフ
ェニルボロン酸、フェニルボロン酸ジエチルエステルな
どが挙げられる。

【００３７】これらの被覆剤を固相担体上に付与する場
合には、水あるいは水と混和可能な有機溶媒、またはこ
れらの混合溶媒に溶解して、固相担体上に塗布する方
法、スプレーする方法、あるいはこの溶液に固相担体を
浸漬する方法が好ましく用いられる。

【００３８】被覆剤の固相担体上へ付与する量に関して
は、本発明の金属酸化物の種類や量、固相担体表面の粗
さによっても異なるが、通常１ｍ²当たり０．０１ｍｇ
乃至１０ｇの範囲にあることが好ましく、０．１ｍｇ乃
至１ｇの範囲にあることが特に好ましい。

【００３９】本発明の金属酸化物を用いるＤＮＡ断片の
固定方法においては、ＤＮＡ断片点着時や被覆剤による
被覆時に、塩基が固定化を促進する場合があり、本発明
においても塩基を好ましく用いることができる。本発明
で用いることができる塩基としては、無機または有機の
塩基であることが好ましく、これらを組み合わせて用い
ることも好ましい。無機塩基の例としては、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、水酸化リチウム、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム、
水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムなどが挙げられ
る。有機塩基の例としては、トリメチルアミン、トリエ
チルアミン、水酸化テトラメチルアンモニウム、ジメチ
ルベンジルアミン、ジエチルアニリン、ピリジン、４−
ジメチルアミノピリジン、１，４−ジアザビシクロ
［２．２．２］オクタン、１，８−ジアザビシクロ
［５．４．０］−７−ウンデセン、ナトリウムメトキシ
ド、ナトリウムエトキシド、カリウム−ｔ−ブトキシ
ド、ｎ−ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミ
ド、フッ化テトラブチルアンモニウム、酢酸ナトリウ
ム、酢酸カリウムなどが挙げられる。

【００４０】本発明の金属酸化物を用いる固定方法にお
いては、ＤＮＡ断片点着時、被覆剤による被覆時に、溶
媒として水の他に種々の有機溶媒を用いることができ
る。有機溶媒としてはトルエン、キシレン、ｎ−ヘキサ
ンのような疎水的な溶媒を用いることもできるが、水と
混和する極性の高い溶媒が好ましい。その例としては、
酢酸エチル、酢酸メチル、メタノール、エタノール、イ
ソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノー
ル、スルホラン、１，２−ジメトキシエタン、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセタ
ミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、プロピ
オニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、
エチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，
４−ブタンジオール、グリセリン、２−メトキシエタノ
ール、ジエチレングリコール、ジエチレングリコールジ
メチルエーテル、酢酸、ピリジン、ギ酸、プロピオン
酸、酪酸などが挙げられる。

【００４１】本発明の金属酸化物を用いる固定方法にお
いては、ＤＮＡ断片点着時、被覆剤による被覆時に、室
温付近あるいは冷却して反応することができるが、加熱
することも好ましい。冷却する場合はその温度が５乃至
１０℃の範囲にあることが好ましく、加熱する場合には
その温度が４０乃至１５０℃の範囲にあることが好まし
く、５０乃至１３０℃の範囲にあることがより好まし
く、５０乃至１００℃の範囲にあることが特に好まし
い。また、反応の際には、反応溶媒の揮発、揮散を防ぐ
目的、あるいは調湿やガス状の試薬を供給するためにで
周囲を隔壁で覆って行うことも好ましい。圧力をかける
必要がある反応についてはオートクレーブなどの耐圧力
容器中で反応を行うこともできる。

【００４２】表面処理がされた固相担体表面上には、さ
らに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減するこ
とができる。固相担体の種類によっては、その担体中に
親水性高分子等を含有させることも可能であり、このよ
うな処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。

【００４３】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。

【００４４】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。

【００４５】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１0³乃至１０⁶の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。

【００４６】また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点
着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃
至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。

【００４７】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。

【００４８】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０²乃至１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０¹⁵モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。

【００４９】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。

【００５０】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ²−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。

【００５１】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブ
リッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレー
タを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方
法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチッ
プはこの検出方法に利用することもできる。

【００５２】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。

【００５３】試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調
べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを
含む反応系で標的領域のＰＣＲを行なって調製すること
が好ましい。

【００５４】ハイブリダイゼーション操作は、９６穴も
しくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておい
た、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着するこ
とによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃
至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダ
イゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そ
して６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。

【００５５】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。

【００５６】

【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成
及びＤＮＡ断片の固定量の測定 （１）金属酸化物が薄膜状に施されたスライド（Ｃ）の
作成 スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）上に酸化チタン
を蒸着したものを作製し、スライド（Ｃ）とした。

【００５７】（２）ＤＮＡ断片の点着、被覆剤の付与お
よび蛍光強度の測定 ５'未端が蛍光標織試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ
５ｄＣＴＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック
社製）で修飾されたＤＮＡ断片（CTAGTCTGTGAAGTGTCTGA
TC５'）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散し
てなる水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）とし、上記
（１）で得たスライド（Ｃ）にこれを点着した。直ち
に、それぞれの点着後のスライドを６０℃、湿度９０％
にて１時間放置した後、このスライドを０．１重量％Ｓ
ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×Ｓ
ＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標
準食塩クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×
ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄
後のスライドを０．１Ｍスクアリン酸水溶液（ｐＨ１
０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、室
温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ
１）を得た。このスライド表面の蛍光強度を蛍光スキャ
ニング装置で測定したところ、１６８８であった。本発
明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライド
ガラスに固定されたことが分かる。

【００５８】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片を用
いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固定さ
れた（Ｄ２）を得た。

【００５９】（２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に付与し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、６７０であった。

【００６０】本発明の固定化方法によって作成されたＤ
ＮＡチップを用いることによって、ＤＮＡチップに固定
されているＤＮＡ断片と相補性を有する試料ＤＮＡ断片
を検出できることが分かる。

【００６１】

【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面に本発明の金属酸化物を薄膜状に施し、被覆
剤を用いた場合には、強固にＤＮＡ断片を固定すること
ができるとともに、バックグラウンドを小さく抑制する
ことができる。ＤＮＡ断片の安定な固定は、遺伝子解析
等に有効に利用することができる高い検出限界を有する
ＤＮＡチップの作製を可能にする。その一つの例とし
て、本発明によって作製されたＤＮＡチップを用いて、
試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを行うことに
より、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片に相補
性を有する試料核酸断片を感度よく検出することができ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 2G054 AB07 BA03 BB05 BB11 BB20 CA22 EA03 GA04 GB02 GE03 4B024 AA20 HA14 HA20 4B029 AA23 BB20 CC03 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR55 QR82 QS34 QX01

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面に金属酸化膜が形成された固相担体
   の表面に、ＤＮＡ断片を液相にて接触させ、該ＤＮＡ断
   片を金属酸化膜に結合させることを特徴とするＤＮＡ断
   片の固相担体表面への固定方法。
2. 【請求項２】 金属酸化物が、アルミニウム、チタン、
   ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、亜鉛、イ
   ンジウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオ
   ブ、タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、
   鉄、ニッケルまたは銀の酸化物であることを特徴とする
   請求項１に記載のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方
   法。
3. 【請求項３】 固相担体の表面へのＤＮＡ断片の液相に
   ての接触を行なった後、ｐＫａ値が１２以下の酸素酸で
   処理を行なうことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ
   断片の固相担体表面への固定方法。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３のうちのいずれかの方法
   により得られたＤＮＡチップ。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
   料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
   片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
   らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
   有する核酸断片の検出方法。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレ
   ータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、Ｄ
   ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
   る核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮ
   Ａチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮ
   Ａ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構
   造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から
   発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検
   出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対
   して相補性を有する核酸断片の検出方法。