JP4554110B2 - Ｄｎａチップ用結合剤、ｄｎａチップ、およびｄｎａチップの製造方法 - Google Patents
Ｄｎａチップ用結合剤、ｄｎａチップ、およびｄｎａチップの製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、遺伝子の変異、遺伝子の多型等の解析に特に有用なＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞や組織における遺伝子発現の様態の解析は、これまで種々の細胞や組織からＲＮＡを調製し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の遺伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うノーザンブロット（もしくは、ドットブロット）法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。
【０００３】
一方、遺伝子の研究の進展により解析を必要とする遺伝子の数が急速に増加し、さらに、ゲノムプロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴って、多数の遺伝子を一度に解析する必要性が高まっている。
【０００４】
このような要望に対して、最近、マイクロアレイ法もしくはＤＮＡチップ法が開発されつつある。これらの技術の特徴は、ガラス製の基板上に、互いに異なる数千種類のＤＮＡ断片を固定し（ＤＮＡチップまたはバイオチップという。）、この固定ＤＮＡ断片と極少量の標識されたターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、高感度でターゲットＤＮＡ断片を検出することである。
【０００５】
上記の方法を用いることによって、ヒト等のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を数枚のＤＮＡチップ等を用いて解析することができ、標識ＲＮＡによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行うこともできる。また、ゲノムＤＮＡを標識することによって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
【０００６】
ＤＮＡチップ等の作製において、「オン・チップ」法（基板表面上に固定するＤＮＡ断片を、直接、基板表面上で合成する方法）によらない場合には、ＤＮＡ断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表面に固定する。
【０００７】
図２は、この従来の方法の原理を説明する図である。図２（ａ）に示すように、複数種類のプローブＤＮＡ１が入っているマイクロプレート２を用意する。一方、図２（ｂ）に示すよう、プレート３としてガラス板を用意しておき、図２（ｃ）で示すように、プレート３の表面にpoly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤４をコーティングする。この後、マイクロプレート２に入っているプローブＤＮＡ１をピンに付着させ、表面にＤＮＡとガラスの結合剤（poly-l-Lysine）４がコーテイングしてあるガラスプレート３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡ１を接触させてスポットする。マイクロプレート２に入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すＤＮＡチップを製造していた。このように、従来はプレートに予めＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてＤＮＡチップを製造していた。
【０００８】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合剤でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【０００９】
このとき、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でなければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残留するか、そのごく一部はガラスのプレート上にコーティングされている結合剤と結合し、ガーベージとして残る場合もある。
【００１０】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流すと、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡは排出される。その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行う。
【００１１】
しかし、poly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤は、ＤＮＡに対する結合力が十分でないため、上記水洗い工程の際、基板との結合が外れ、ハイブリダイズした資料まで洗い流されてしまう場合があった。このような、不十分な結合に由来するプローブＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの損失は、多いときには７０％以上にも達し、高価なプローブＤＮＡや、貴重なサンプルＤＮＡを徒に浪費しているのが現状であった。
【００１２】
このような問題を解消すべく、結合材として種々の材料が検討されているが、未だ有効な材料が得られていない。
【００１３】
さらに、プローブＤＮＡと結合しなかったサンプルＤＮＡが必要以外の部分、すなわち、プローブＤＮＡがスポットされていない結合剤部分に張り付き、結合剤と結合しているサンプルＤＮＡは水洗いによってもガラスのプレート上から除去されない。それが検出時ノイズとなって現われ、感度が低くなっていた。つまり、サンプルＤＮＡの一部がプローブＤＮＡとの特異結合ではなく単に結合剤に張り付いた状態でバイオチップ上にガーベージとして残り、そのサンプルＤＮＡに標識されている蛍光物質も励起されて発光するため、ノイズとして検出され、Ｓ／Ｎが悪くなるという問題があった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、水洗い工程等においてプロ−ブＤＮＡ、サンプルＤＮＡの損失が少なく、ＤＮＡサンプルを有効に活用でき、しかもＳ／Ｎを向上させることも可能なＤＮＡチップ用結着剤、ＤＮＡチップ、およびＤＮＡチップの製造方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
すなわち上記目的は、以下の本発明の構成により達成される。
（１） 下記構造式（Ｉ）で表されるＤＮＡチップ用結合剤。
【００１６】
【化４】
【００１７】
〔上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＮＨ2 基である。〕
（２） 少なくとも基板上に下記式（II）で表される構造単位を有する高分子を含有するＤＮＡチップ用結合剤含有層が形成されているＤＮＡチップ。
【００１８】
【化５】
【００１９】
（３） 前記ＤＮＡチップ用結合剤にはプロ−ブＤＮＡが結合している上記（２）または（３）のＤＮＡチップ。
（４） 前記ＤＮＡチップ用結合剤含有層は、蒸着法により形成されている上記（２）〜（３）のいずれかのＤＮＡチップ。
（５） 前記ＤＮＡチップ用結合剤含有層は、マスキングによりパターン形成されている上記（２）〜（４）のいずれかのＤＮＡチップ。
（６） 下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基板上に重合させ結合剤含有層を形成するＤＮＡチップの製造方法。
【００２０】
【化６】
【００２１】
〔上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＮＨ2 基である。〕
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡチップ用結着剤は、下記構造式（Ｉ）で表されるものである。
【００２３】
【化７】
【００２４】
上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は双方とも−ＮＨ2 基であってもよい。
【００２５】
このような本発明の化合物を結着剤として用いることにより、基板とプロ−ブＤＮＡとをより確実に結合させることができ、水洗い工程等でもプローブＤＮＡ、サンプルＤＮＡが基板から流れ落ちることなく、プローブＤＮＡ、サンプルＤＮＡを有効に活用することができる。
【００２６】
構造式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、好ましくは蒸着法、特にＣＶＤ法により、蒸発、分解させて、これを基板上に重合・堆積させることで、ガラス等の基板と良好に接着すると共に、構造式中に存在するアミノ基（ＮＨ2 ）がプローブとなるＤＮＡ断片のリン酸基（ＰＯ4 ）と結合して、プローブＤＮＡを基板上に良好に固定することができる。通常、ＤＮＡ断片は５’末端が本発面化合物と結合する。
【００２７】
本発明の化合物は、以下の方法により製造することができる。
【００２８】
先ず、パラシクロファンを氷酢酸と加熱還流し、所定の温度まで冷却した後、発煙硝酸を滴下し、撹拌する。次いで、反応物を冷水、例えば氷水にあけ、析出した沈殿物を濾過し、アルカリ洗浄後、水洗する。
【００２９】
得られた粗結晶を抽出溶媒、例えばイソプロピルエーテルで抽出後、抽出物からイソプロピルエーテルを留去し、残留物をメタノールで再結晶させて４−ニトロ−パラシクロファンを得る。
【００３０】
次いで、得られた４−ニトロ−パラシクロファンを溶媒、例えばトルエンに溶解し、これに鉄粉、エタノール、および水を加え、加熱還流する。加熱還流しつつ、濃塩酸をエタノールで希釈した塩酸溶液を滴下し、さらに数時間加熱還流する。反応終了後、反応物を濾過し、濾液を塩酸で抽出し、この抽出液を苛性ソーダ等の中和剤で中和する。析出した沈殿物を濾過、乾燥し、得られた粗結晶を昇華し、昇華物をエタノールと加熱還流した後冷却し、得られた結晶を濾別、乾燥して構造式（Ｉ）の４−アミノ−パラシクロファンを得る。
【００３１】
このようにして得られた構造式（Ｉ）の４−アミノ−パラシクロファンは、以下の化学蒸着法を用いて、基板上に結着剤含有層として成膜することができる。
【００３２】
先ず、図１に示すように、蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意する。なお、図１において、蒸発部１１には蒸発材料を導入する開口部シャッタ１１ａを有し、さらに蒸発部１３にはトラップ１４を介して真空ポンプ１５が接続されている。
【００３３】
図示例の蒸着装置において、先ず蒸発部１１に固体状の蒸発材料４−アミノ−パラシクロファンを導入する。蒸発部１１の温度を、４−アミノ−パラシクロファンが気化する温度、好ましくは８０〜２００℃、特に１００〜１８０℃に加熱すると、蒸発材料が気化してダイマーガスとなり、原料ガスが生成する。
【００３４】
次いで、原料のダイマーガスを分解部１２に導入する。この分解部１２では、導入された原料ガスをその分解温度、好ましくは６００〜７５０℃、特に６５０〜７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとする。
【００３５】
次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着室１３内に導入する。蒸着室１３内は、所定の真空度、好ましくは１０〜５０mTorr、特に２０〜３５mTorrに保持されている。そして、導入された原料ガスが基板に接触すると、その界面で重合し、高分子膜が形成される。
【００３６】
このようにして得られた高分子は、下記構造式（II）で表されるものである。
【００３７】
【化８】
【００３８】
上記式（II）において、ｍ、ｎは整数であり、ｎは０であってもよい。
【００３９】
成膜された、高分子膜はその膜厚が１分子分でもよいが、通常０．３〜１０μm 程度である。
【００４０】
また、成膜時に所定パターンのマスクを用い、マスク蒸着を行ってもよい。このように、マスク蒸着を行うことにより、精度よく結合剤含有層パターンを形成することができ、不必要な部分にＤＮＡが付着してガーベージとして残り、Ｓ／Ｎを悪化させることを防止することができる。
【００４１】
本発明で得られたＤＮＡ結合剤含有層を有するＤＮＡチップは、プローブＤＮＡとの結合が良好であり、水洗い工程等においてもＤＮＡが剥がれ落ちることもなく、原料を有効に活用することができる。
【００４２】
基板の材質は、透明なガラス、シリコンまたはポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡ等のポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好ましい。なかでもガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャニング装置による解析の容易さによるものである。シリカ表面層を持つガラスも好ましく用いられる。基板の厚さとしては、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００４３】
プローブとなるＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下「ＰＣＲ産物」という。）。あるいは、ＰＣＲ法によって増幅しないものも使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成すし、これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、既知であることが好ましい。
【００４４】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注された水性液をスポッター装置を用いて基板上に滴下して行うことが好ましい。
【００４５】
点着されるＤＮＡ断片は、基板表面に対して、１０2 〜１０5 種類／ｃｍ2 の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15 モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、基板表面にドットの形状で固定されるが、そのドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、特に１００〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、特に１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。
【００４６】
点着後は、必要に応じてインキュベーションを行うことが好ましい。インキュベート後、点着されなかったＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００４７】
前記記載の基板表面上のドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。
【００４８】
上記のようにして作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸とのハイブリダーゼーションである。
【００４９】
サンプルである標的核酸としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。
【００５０】
標的核酸は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、標的核酸は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００５１】
標的核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ることが好ましい。
【００５２】
標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法とがあるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2 −アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。
【００５３】
ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した標的核酸が溶解あるいは分散してなる水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによって実施することが好ましい。点着の量は、１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００５４】
ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないことである。そのため、基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００５５】
【実施例】
〔実施例１〕
＜４−ニトロ−（２，２）−パラシクロファンの合成＞
先ず、（２，２）−パラシクロファン２０ｇを８００ｇの氷酢酸と加熱還流した（一部不溶）。この溶液を、７５℃まで冷却した後、発煙硝酸（ｄ＝１．５０）を素早く滴下し、滴下終了後５分間撹拌した。この時液温は８５℃まで上昇した。次いで、反応物を氷水にあけ、析出した沈殿物を濾過し、アルカリ洗浄後、水洗した（粗結晶収量：９．２ｇ）。
【００５６】
得られた粗結晶をイソプロピルエーテルで抽出後、抽出物からイソプロピルエーテルを留去し、残留物をメタノールで再結晶させて４−ニトロ−（２，２）−パラシクロファン５．３ｇを得た。
【００５７】
＜４−アミノ−（２，２）−パラシクロファンの合成＞
次いで、得られた４−ニトロ−（２，２）−パラシクロファン５．０ｇをトルエン２００ｇに溶解し、これに鉄粉６ｇ、エタノール７０ml、および水３０mlを加え、加熱還流した。このとき、加熱還流しつつ、濃塩酸５mlを５０％エタノール２０mlで希釈した塩酸溶液を１時間で滴下し、さらに４時間加熱還流した。反応終了後、反応物を濾過し、濾液を塩酸で抽出し、この抽出液を苛性ソーダで中和する。析出した沈殿物を濾過、乾燥した（粗結晶収量：４．１ｇ）。得られた粗結晶を昇華し、昇華物をエタノールと加熱還流した後冷却し、得られた結晶を濾別、乾燥して構造式（Ｉ）の４−アミノ−（２，２）−パラシクロファン３．７ｇを得た。構造は、ガスクロマトグラフ・質量分析にて確認した。
【００５８】
＜結着剤含有層の形成＞
図１に示すように、蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意した。
【００５９】
図示例の蒸着装置において、蒸発部１１に、式（Ｉ）の構造を有する固体状の蒸着材料４−アミノ−（２，２）−パラシクロファンを導入した。蒸発部１１の温度を、１００〜１５０℃に加熱すると、蒸発材料が気化して下記構造のダイマーガスとなり、原料ガスが生成した。
【００６０】
【化９】
【００６１】
上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は、双方とも−ＮＨ2 基であってもよい。
【００６２】
次いで、原料のダイマーガスを分解部１２に導入した。この分解部１２では、下記式に示すように、導入された原料ガスを、その分解温度７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとした。
【００６３】
【化１０】
【００６４】
次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着室１３内に導入した。蒸着室１３内は、最大３０．１mmTorrの真空度に保持されている。そして、導入された原料ガスがガラス基板界面で重合し、下記構造の高分子膜が形成された。得られた高分子膜の赤外吸収スペクトルを図３に示す。
【００６５】
【化１１】
【００６６】
この後、マイクロプレート２２に入っているプローブＤＮＡをピンに付着させ、前記高分子膜が形成されたガラスプレート２３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットした。マイクロプレート２２に入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すようなＤＮＡチップを製造した。
【００６７】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００６８】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流し、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡを排出した。
【００６９】
このとき、基板上に結合しているプローブＤＮＡはほとんど剥がれ落ちることなく残留し、水洗工程でＤＮＡが剥がれ落ちないことが確認できた。
【００７０】
その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行った。
【００７１】
その結果、目的とするハイブリダイゼーションが的確に行われ、Ｓ／Ｎ比も良好であることが確認できた。
【００７２】
〔実施例２〕
実施例１において、結合剤含有層を形成する際に、所定パターンのマスクを用い、スポットパターンと同様なパターンに結合剤含有層を形成した。
【００７３】
その後、マイクロプレート２２内のＤＮＡプローブをスポットすることなく、塗布し、その後蒸留水で洗い流した後、乾燥してＤＮＡチップを作製した。その他は実施例１と同様にしてＤＮＡチップを作製した。
【００７４】
得られた、ＤＮＡチップを実施例１と同様に評価したところ、ガーベージもなくＳ／Ｎが向上していることが解った。
【００７５】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、水洗い工程等においてプロ−ブＤＮＡ、サンプルＤＮＡの損失が少なく、ＤＮＡサンプルを有効に活用でき、しかもＳ／Ｎを向上させることも可能なＤＮＡチップ用結着剤、ＤＮＡチップおよびＤＮＡチップの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡチップの製造工程を示す概略斜視図である。
【図２】ＤＮＡチップの製造装置を示すブロック図である。
【図３】実施例１で形成した高分子膜の赤外吸収スペクトルを示したグラフである。
【符号の説明】
１１ 蒸発部
１２ 分解部
１３ 蒸着部
１４ トラップ
１５ 真空ポンプ
２１ ＤＮＡ
２２ マイクロプレート
２３ 基板
２４ 結合剤含有層
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、遺伝子の変異、遺伝子の多型等の解析に特に有用なＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞や組織における遺伝子発現の様態の解析は、これまで種々の細胞や組織からＲＮＡを調製し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の遺伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うノーザンブロット（もしくは、ドットブロット）法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。
【０００３】
一方、遺伝子の研究の進展により解析を必要とする遺伝子の数が急速に増加し、さらに、ゲノムプロジェクトの進展や、医療分野への応用などの進行に伴って、多数の遺伝子を一度に解析する必要性が高まっている。
【０００４】
このような要望に対して、最近、マイクロアレイ法もしくはＤＮＡチップ法が開発されつつある。これらの技術の特徴は、ガラス製の基板上に、互いに異なる数千種類のＤＮＡ断片を固定し（ＤＮＡチップまたはバイオチップという。）、この固定ＤＮＡ断片と極少量の標識されたターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、高感度でターゲットＤＮＡ断片を検出することである。
【０００５】
上記の方法を用いることによって、ヒト等のほ乳類や数千個の遺伝子を有する微生物の全遺伝子を数枚のＤＮＡチップ等を用いて解析することができ、標識ＲＮＡによる全遺伝子を対象とした発現量の解析を行うこともできる。また、ゲノムＤＮＡを標識することによって遺伝子欠損等の変異の解析も可能である。
【０００６】
ＤＮＡチップ等の作製において、「オン・チップ」法（基板表面上に固定するＤＮＡ断片を、直接、基板表面上で合成する方法）によらない場合には、ＤＮＡ断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表面に固定する。
【０００７】
図２は、この従来の方法の原理を説明する図である。図２（ａ）に示すように、複数種類のプローブＤＮＡ１が入っているマイクロプレート２を用意する。一方、図２（ｂ）に示すよう、プレート３としてガラス板を用意しておき、図２（ｃ）で示すように、プレート３の表面にpoly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤４をコーティングする。この後、マイクロプレート２に入っているプローブＤＮＡ１をピンに付着させ、表面にＤＮＡとガラスの結合剤（poly-l-Lysine）４がコーテイングしてあるガラスプレート３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡ１を接触させてスポットする。マイクロプレート２に入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すＤＮＡチップを製造していた。このように、従来はプレートに予めＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてＤＮＡチップを製造していた。
【０００８】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合剤でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【０００９】
このとき、サンプルＤＮＡとＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でなければ結合することはなく、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡは、そのままハイブリダイゼーション溶液に残留するか、そのごく一部はガラスのプレート上にコーティングされている結合剤と結合し、ガーベージとして残る場合もある。
【００１０】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流すと、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡは排出される。その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行う。
【００１１】
しかし、poly-l-Lysine等のＤＮＡとガラスの結合剤は、ＤＮＡに対する結合力が十分でないため、上記水洗い工程の際、基板との結合が外れ、ハイブリダイズした資料まで洗い流されてしまう場合があった。このような、不十分な結合に由来するプローブＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの損失は、多いときには７０％以上にも達し、高価なプローブＤＮＡや、貴重なサンプルＤＮＡを徒に浪費しているのが現状であった。
【００１２】
このような問題を解消すべく、結合材として種々の材料が検討されているが、未だ有効な材料が得られていない。
【００１３】
さらに、プローブＤＮＡと結合しなかったサンプルＤＮＡが必要以外の部分、すなわち、プローブＤＮＡがスポットされていない結合剤部分に張り付き、結合剤と結合しているサンプルＤＮＡは水洗いによってもガラスのプレート上から除去されない。それが検出時ノイズとなって現われ、感度が低くなっていた。つまり、サンプルＤＮＡの一部がプローブＤＮＡとの特異結合ではなく単に結合剤に張り付いた状態でバイオチップ上にガーベージとして残り、そのサンプルＤＮＡに標識されている蛍光物質も励起されて発光するため、ノイズとして検出され、Ｓ／Ｎが悪くなるという問題があった。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、水洗い工程等においてプロ−ブＤＮＡ、サンプルＤＮＡの損失が少なく、ＤＮＡサンプルを有効に活用でき、しかもＳ／Ｎを向上させることも可能なＤＮＡチップ用結着剤、ＤＮＡチップ、およびＤＮＡチップの製造方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
すなわち上記目的は、以下の本発明の構成により達成される。
（１） 下記構造式（Ｉ）で表されるＤＮＡチップ用結合剤。
【００１６】
【化４】
〔上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＮＨ2 基である。〕
（２） 少なくとも基板上に下記式（II）で表される構造単位を有する高分子を含有するＤＮＡチップ用結合剤含有層が形成されているＤＮＡチップ。
【００１８】
【化５】
（３） 前記ＤＮＡチップ用結合剤にはプロ−ブＤＮＡが結合している上記（２）または（３）のＤＮＡチップ。
（４） 前記ＤＮＡチップ用結合剤含有層は、蒸着法により形成されている上記（２）〜（３）のいずれかのＤＮＡチップ。
（５） 前記ＤＮＡチップ用結合剤含有層は、マスキングによりパターン形成されている上記（２）〜（４）のいずれかのＤＮＡチップ。
（６） 下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基板上に重合させ結合剤含有層を形成するＤＮＡチップの製造方法。
【００２０】
【化６】
〔上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＮＨ2 基である。〕
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡチップ用結着剤は、下記構造式（Ｉ）で表されるものである。
【００２３】
【化７】
上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は双方とも−ＮＨ2 基であってもよい。
【００２５】
このような本発明の化合物を結着剤として用いることにより、基板とプロ−ブＤＮＡとをより確実に結合させることができ、水洗い工程等でもプローブＤＮＡ、サンプルＤＮＡが基板から流れ落ちることなく、プローブＤＮＡ、サンプルＤＮＡを有効に活用することができる。
【００２６】
構造式（Ｉ）で表される本発明の化合物は、好ましくは蒸着法、特にＣＶＤ法により、蒸発、分解させて、これを基板上に重合・堆積させることで、ガラス等の基板と良好に接着すると共に、構造式中に存在するアミノ基（ＮＨ2 ）がプローブとなるＤＮＡ断片のリン酸基（ＰＯ4 ）と結合して、プローブＤＮＡを基板上に良好に固定することができる。通常、ＤＮＡ断片は５’末端が本発面化合物と結合する。
【００２７】
本発明の化合物は、以下の方法により製造することができる。
【００２８】
先ず、パラシクロファンを氷酢酸と加熱還流し、所定の温度まで冷却した後、発煙硝酸を滴下し、撹拌する。次いで、反応物を冷水、例えば氷水にあけ、析出した沈殿物を濾過し、アルカリ洗浄後、水洗する。
【００２９】
得られた粗結晶を抽出溶媒、例えばイソプロピルエーテルで抽出後、抽出物からイソプロピルエーテルを留去し、残留物をメタノールで再結晶させて４−ニトロ−パラシクロファンを得る。
【００３０】
次いで、得られた４−ニトロ−パラシクロファンを溶媒、例えばトルエンに溶解し、これに鉄粉、エタノール、および水を加え、加熱還流する。加熱還流しつつ、濃塩酸をエタノールで希釈した塩酸溶液を滴下し、さらに数時間加熱還流する。反応終了後、反応物を濾過し、濾液を塩酸で抽出し、この抽出液を苛性ソーダ等の中和剤で中和する。析出した沈殿物を濾過、乾燥し、得られた粗結晶を昇華し、昇華物をエタノールと加熱還流した後冷却し、得られた結晶を濾別、乾燥して構造式（Ｉ）の４−アミノ−パラシクロファンを得る。
【００３１】
このようにして得られた構造式（Ｉ）の４−アミノ−パラシクロファンは、以下の化学蒸着法を用いて、基板上に結着剤含有層として成膜することができる。
【００３２】
先ず、図１に示すように、蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意する。なお、図１において、蒸発部１１には蒸発材料を導入する開口部シャッタ１１ａを有し、さらに蒸発部１３にはトラップ１４を介して真空ポンプ１５が接続されている。
【００３３】
図示例の蒸着装置において、先ず蒸発部１１に固体状の蒸発材料４−アミノ−パラシクロファンを導入する。蒸発部１１の温度を、４−アミノ−パラシクロファンが気化する温度、好ましくは８０〜２００℃、特に１００〜１８０℃に加熱すると、蒸発材料が気化してダイマーガスとなり、原料ガスが生成する。
【００３４】
次いで、原料のダイマーガスを分解部１２に導入する。この分解部１２では、導入された原料ガスをその分解温度、好ましくは６００〜７５０℃、特に６５０〜７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとする。
【００３５】
次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着室１３内に導入する。蒸着室１３内は、所定の真空度、好ましくは１０〜５０mTorr、特に２０〜３５mTorrに保持されている。そして、導入された原料ガスが基板に接触すると、その界面で重合し、高分子膜が形成される。
【００３６】
このようにして得られた高分子は、下記構造式（II）で表されるものである。
【００３７】
【化８】
上記式（II）において、ｍ、ｎは整数であり、ｎは０であってもよい。
【００３９】
成膜された、高分子膜はその膜厚が１分子分でもよいが、通常０．３〜１０μm 程度である。
【００４０】
また、成膜時に所定パターンのマスクを用い、マスク蒸着を行ってもよい。このように、マスク蒸着を行うことにより、精度よく結合剤含有層パターンを形成することができ、不必要な部分にＤＮＡが付着してガーベージとして残り、Ｓ／Ｎを悪化させることを防止することができる。
【００４１】
本発明で得られたＤＮＡ結合剤含有層を有するＤＮＡチップは、プローブＤＮＡとの結合が良好であり、水洗い工程等においてもＤＮＡが剥がれ落ちることもなく、原料を有効に活用することができる。
【００４２】
基板の材質は、透明なガラス、シリコンまたはポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡ等のポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマーであることが好ましい。なかでもガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや蛍光スキャニング装置による解析の容易さによるものである。シリカ表面層を持つガラスも好ましく用いられる。基板の厚さとしては、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００４３】
プローブとなるＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下「ＰＣＲ産物」という。）。あるいは、ＰＣＲ法によって増幅しないものも使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成すし、これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、既知であることが好ましい。
【００４４】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注された水性液をスポッター装置を用いて基板上に滴下して行うことが好ましい。
【００４５】
点着されるＤＮＡ断片は、基板表面に対して、１０2 〜１０5 種類／ｃｍ2 の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０-15 モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、基板表面にドットの形状で固定されるが、そのドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、特に１００〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、特に１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。
【００４６】
点着後は、必要に応じてインキュベーションを行うことが好ましい。インキュベート後、点着されなかったＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００４７】
前記記載の基板表面上のドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。
【００４８】
上記のようにして作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されたオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、標識した標的核酸とのハイブリダーゼーションである。
【００４９】
サンプルである標的核酸としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。
【００５０】
標的核酸は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、標的核酸は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００５１】
標的核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ることが好ましい。
【００５２】
標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法とがあるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2 −アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。
【００５３】
ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した標的核酸が溶解あるいは分散してなる水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによって実施することが好ましい。点着の量は、１〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標的核酸を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００５４】
ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸の使用量が非常に少ないことである。そのため、基板に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した標的核酸の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、低い厳密度で長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、高い厳密度で短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的核酸を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００５５】
【実施例】
〔実施例１〕
＜４−ニトロ−（２，２）−パラシクロファンの合成＞
先ず、（２，２）−パラシクロファン２０ｇを８００ｇの氷酢酸と加熱還流した（一部不溶）。この溶液を、７５℃まで冷却した後、発煙硝酸（ｄ＝１．５０）を素早く滴下し、滴下終了後５分間撹拌した。この時液温は８５℃まで上昇した。次いで、反応物を氷水にあけ、析出した沈殿物を濾過し、アルカリ洗浄後、水洗した（粗結晶収量：９．２ｇ）。
【００５６】
得られた粗結晶をイソプロピルエーテルで抽出後、抽出物からイソプロピルエーテルを留去し、残留物をメタノールで再結晶させて４−ニトロ−（２，２）−パラシクロファン５．３ｇを得た。
【００５７】
＜４−アミノ−（２，２）−パラシクロファンの合成＞
次いで、得られた４−ニトロ−（２，２）−パラシクロファン５．０ｇをトルエン２００ｇに溶解し、これに鉄粉６ｇ、エタノール７０ml、および水３０mlを加え、加熱還流した。このとき、加熱還流しつつ、濃塩酸５mlを５０％エタノール２０mlで希釈した塩酸溶液を１時間で滴下し、さらに４時間加熱還流した。反応終了後、反応物を濾過し、濾液を塩酸で抽出し、この抽出液を苛性ソーダで中和する。析出した沈殿物を濾過、乾燥した（粗結晶収量：４．１ｇ）。得られた粗結晶を昇華し、昇華物をエタノールと加熱還流した後冷却し、得られた結晶を濾別、乾燥して構造式（Ｉ）の４−アミノ−（２，２）−パラシクロファン３．７ｇを得た。構造は、ガスクロマトグラフ・質量分析にて確認した。
【００５８】
＜結着剤含有層の形成＞
図１に示すように、蒸発部１１、分解部１２、蒸着部１３とを有する蒸着装置を用意した。
【００５９】
図示例の蒸着装置において、蒸発部１１に、式（Ｉ）の構造を有する固体状の蒸着材料４−アミノ−（２，２）−パラシクロファンを導入した。蒸発部１１の温度を、１００〜１５０℃に加熱すると、蒸発材料が気化して下記構造のダイマーガスとなり、原料ガスが生成した。
【００６０】
【化９】
上記式（Ｉ）において、Ｒ1 ，Ｒ2 は、−ＮＨ2 基、またはＨを表し、少なくともＲ1 ，Ｒ2 のいずれかは−ＮＨ2 基である。Ｒ1 ，Ｒ2 は、双方とも−ＮＨ2 基であってもよい。
【００６２】
次いで、原料のダイマーガスを分解部１２に導入した。この分解部１２では、下記式に示すように、導入された原料ガスを、その分解温度７００℃まで加熱し、原料ガスを熱分解してモノマーガスとした。
【００６３】
【化１０】
次に、得られた原料モノマーガスを、蒸着室１３内に導入した。蒸着室１３内は、最大３０．１mmTorrの真空度に保持されている。そして、導入された原料ガスがガラス基板界面で重合し、下記構造の高分子膜が形成された。得られた高分子膜の赤外吸収スペクトルを図３に示す。
【００６５】
【化１１】
この後、マイクロプレート２２に入っているプローブＤＮＡをピンに付着させ、前記高分子膜が形成されたガラスプレート２３の上に、ピンに付着させたプローブＤＮＡを接触させてスポットした。マイクロプレート２２に入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図２（ｄ）に示すようなＤＮＡチップを製造した。
【００６７】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション工程は、プローブＤＮＡが結合でガラスのプレートにスポットされているＤＮＡチップと、蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, trisodiumcitrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００６８】
その後、ガラスのプレート上に残った蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡを水槽等の中に入れて洗い流し、プローブＤＮＡと結合していないサンプルＤＮＡを排出した。
【００６９】
このとき、基板上に結合しているプローブＤＮＡはほとんど剥がれ落ちることなく残留し、水洗工程でＤＮＡが剥がれ落ちないことが確認できた。
【００７０】
その後、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出することでハイブリダイゼーションの検出を行った。
【００７１】
その結果、目的とするハイブリダイゼーションが的確に行われ、Ｓ／Ｎ比も良好であることが確認できた。
【００７２】
〔実施例２〕
実施例１において、結合剤含有層を形成する際に、所定パターンのマスクを用い、スポットパターンと同様なパターンに結合剤含有層を形成した。
【００７３】
その後、マイクロプレート２２内のＤＮＡプローブをスポットすることなく、塗布し、その後蒸留水で洗い流した後、乾燥してＤＮＡチップを作製した。その他は実施例１と同様にしてＤＮＡチップを作製した。
【００７４】
得られた、ＤＮＡチップを実施例１と同様に評価したところ、ガーベージもなくＳ／Ｎが向上していることが解った。
【００７５】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、水洗い工程等においてプロ−ブＤＮＡ、サンプルＤＮＡの損失が少なく、ＤＮＡサンプルを有効に活用でき、しかもＳ／Ｎを向上させることも可能なＤＮＡチップ用結着剤、ＤＮＡチップおよびＤＮＡチップの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡチップの製造工程を示す概略斜視図である。
【図２】ＤＮＡチップの製造装置を示すブロック図である。
【図３】実施例１で形成した高分子膜の赤外吸収スペクトルを示したグラフである。
【符号の説明】
１１ 蒸発部
１２ 分解部
１３ 蒸着部
１４ トラップ
１５ 真空ポンプ
２１ ＤＮＡ
２２ マイクロプレート
２３ 基板
２４ 結合剤含有層
Claims (6)
- 下記構造式（Ｉ）で表されるＤＮＡチップ用結合剤。
- 少なくとも基板上に下記式（II）で表される構造単位を有する高分子を含有するＤＮＡチップ用結合剤含有層が形成されているＤＮＡチップ。
- 前記ＤＮＡチップ用結合剤にはプロ−ブＤＮＡが結合している請求項２のＤＮＡチップ。
- 前記ＤＮＡチップ用結合剤含有層は、蒸着法により形成されている請求項２〜３のいずれかのＤＮＡチップ。
- 前記ＤＮＡチップ用結合剤含有層は、マスキングによりパターン形成されている請求項２〜４のいずれかのＤＮＡチップ。
- 下記構造式（Ｉ）で表される原料を蒸発させ、加熱してモノマーとした後、所定の真空度の蒸着室に導入して基板上に重合させ結合剤含有層を形成するＤＮＡチップの製造方法。
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