DE60218568T2

DE60218568T2 - Dünne Polymer-Schicht, Herstellungsverfahren, Bindemittel für Bio-Chip, Bio-Chip und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE60218568T2
Application number: DE2002618568
Authority: DE
Inventors: Eiichi Nakamura; Kenichi Shibayama; Hiroshi Ichihara-shi Maruyama; Takashi Ichihara-shi Inoue
Original assignee: Kishimoto Sangyo Co Ltd
Current assignee: Kisco Ltd
Priority date: 2001-05-16
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2022-05-17
Also published as: DE60218568D1; US6855419B2; US20030012956A1; EP1260542B1; EP1260542A1

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung einer dünnen Polymerschicht in den Bereichen der Laborversuche und der Medizin, und insbesondere einen Biochip, welcher eine solche dünne Polymerschicht verwendet und für Versuchsreihen zur Genexpression, zur Genmutation, zu Gen-Polymorphismen und für Ähnliches geeignet ist.
Einige Vorrichtungen wie etwa ein Katheter, der im Bereich der Medizin eingesetzt wird, werden derart verwendet, dass sie in einen Körper eingeführt werden. Das Einführen einer medizinischen Vorrichtung, die für den Körper einen Fremdkörper darstellt, ist mit dem Problem der Verträglichkeit mit den biologischen Systemen im Körper, wie etwa den Immun- und Abwehrmechanismen des Körpers, verbunden.
Zum Beispiel ist Thrombose eines der schwerwiegendsten Probleme, die in Verbindung mit der Entwicklung und Verwendung von medizinischen Vorrichtungen wie etwa Blutabnahme und -behandlungssystemen auftreten. Wenn das Blut mit der Oberfläche eines Fremdkörpers in Kontakt kommt, erfahren die Blutzellen sowie die Flüssigkeit, die im Blut erhalten ist, einige Veränderungen. Um die Bioverträglichkeit solcher Vorrichtungen zu verbessern, ist es erforderlich, ein gerinnungshemmendes Mittel oder ein biologisch aktives antithrombogenes Mittel auf der Polymeroberfläche zu verankern.
Die Genexpression in Zellen und Geweben ist Versuchsreihen mit Northern Blotting (oder Dot Blotting) unterzogen worden, wobei RNA aus verschiedenartigen Zellen oder Geweben auf der Membran verankert wird und die RNA unter Verwendung einer Sonde, die für das zu untersuchende Gen spezifisch ist, hybridisiert wird; sowie mit RT-PCR unter Verwendung eines Primers, die für das zu untersuchende Gen spezifisch ist; oder Ähnliches.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an einer Versuchsreihe, bei welcher gleichzeitig eine große Anzahl an Genen untersucht wird, um dem Fortschritt in der Genforschung und der damit verbundenen Zunahme der Anzahl an zu untersuchenden Genen ebenso wie dem Fortschritt des Genomprojektes und der Anwendung seiner Ergebnisse im Bereich der Medizin Rechnung zu tragen.
Im Hinblick auf einen solchen Bedarf sind verschiedenartige Techniken entwickelt worden, bei denen Mikroarrays, DNA-Chips und Ähnliches zum Einsatz kommen. Derartige Techniken haben als gemeinsames Merkmal, dass mehrere Tausend DNA-Fragmente verschiedener Art auf einem Glassubstrat verankert werden, (wobei dies als DNA-Chip oder Biochip bezeichnet wird) und dass das Ziel-DNA-Fragment mit hoher Empfindlichkeit detektiert wird, und zwar mittels einer Reaktion zwischen dem verankerten DNA-Fragment und der sehr geringen Menge eines markierten Ziel-DNA-Fragments.
Solche Verfahren haben es ermöglicht, eine große Anzahl an Genen des Menschen oder anderer Säugetiere oder sogar die Gesamtheit der Gene eines Mikroorganismus mit mehreren tausend Genen auf mehreren Biochips einer Versuchsreihe zu unterziehen. Weiterhin werden Versuchsreihen zur mengenmäßigen Genexpression für die Gesamtheit der Gene ermöglicht, und zwar durch Verwendung markierter RNAs. Versuchsreihen zu Mutationen wie etwa der Gen-Deletion wurde durch Markierung der genomischen DNA ebenfalls ermöglicht.
Wenn ein Biochip mittels eines anderen Verfahrens als desjenigen der "on Chip"-Synthese (d.h. des Verfahrens, bei welchem die DNA-Fragmente, die auf der Oberfläche des Substrats verankert werden sollen, direkt auf der Oberfläche des Substrats synthetisiert werden), hergestellt wird, werden die Fragmente, die im Vorfeld hergestellt wurden, punktförmig auf die Oberfläche des Substrats aufgebracht und unter Einsatz elektrostatischer Wechselwirkungen oder kovalenter Bindungen verankert.
2 ist eine Ansicht, welche das Prinzip dieses Verfahrens zeigt. 2 SCHRITT (A) zeigt eine Mikroplatte 22, wobei Sonden DNA 21 unterschiedlicher Art in die Mikroplatte gegeben wird. Währenddessen wird eine Glasplatte wie sie in 2 SCHRITT (B) dargestellt ist, vorbereitet, um als Platte 23 verwendet zu werden und, wobei, wie in 2 SCHRITT (C) dargestellt ist, die Oberfläche der Platte 23 mit einem Bindemittel 24 wie etwa Poly-1-Lysin beschichtet wird, welches die DNA an das Glas bindet. Anschließend wird die Sonden-DNA 21 in der Mikroplatte 22 an einem Stift befestigt und die an dem Stift befestigte DNA wird mit der Glasplatte 23 in Kontakt gebracht, welche mit dem Mittel 24 (Poly-1-Lysin) zum Verbinden von DNA und Glas beschichtet wurde, um die DNA punktförmig auf das beschichtete Glas aufzubringen. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis sämtliche Sonden-DNAs punktförmig in der Mikroplatte 22 enthalten sind, wodurch ein Biochip wie er in 2 SCHRITT (D) dargestellt ist, hergestellt wird. Wie oben beschrieben wurde, sind Biochips hergestellt worden, indem zunächst die gesamte Oberfläche der Platte mit dem DNA-Bindemittel beschichtet wurde, woraufhin die DNA punktförmig auf die Platte, die mit dem Bindemittel beschichtet war, aufgebracht wurde.
Die Hybridisierung des Biochips wird erzielt, indem der Biochip, auf welchem die Sonden-DNAs mittels des Bindemittels punktförmig auf die Glasplatte aufgebracht wurden, wobei die Proben-DNA mit einer fluoreszierenden Substanz markiert wurde, in eine Hybridisierungslösung gegeben wird, um die Hybridisierung zu fördern. Bei der Hybridisierungslösung handelt es sich um eine gemischte Lösung, die Formaldehyd, SSC (NaCl, Trinatriumcitrat), SDS (Natriumlaurylsulfat), EDTA (Ethylendiamidtetraessigsäure), destilliertes Wasser und Ähnliches umfasst, wobei das Mischungsverhältnis in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der eingesetzten DNA variieren kann.
Bei diesem Schritt verbinden sich die Proben-DNA und die Sonden-DNA auf dem Biochip, indem sie eine Doppelhelixstruktur bilden, falls diese DNAs komplementäre Stränge aufweisen. Andererseits werden die DNAs nicht aneinander binden, wenn die DNAs nicht komplementär zueinander sind, und die Proben-DNA, die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert wurde, verbleibt entweder in der Hybridisierungslösung oder bindet an das Bindemittel, mit welchem die Glasplatte beschichtet wurde, um dort als Abfall zu verbleiben.
Wenn die Glasplatte in einem Wasserbehälter oder Ähnlichem gewaschen wird, um auf diese Weise die Proben-DNA, die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert wurde und die auf der Glasplatte verbleibt, zu entfernen, wird die Proben-DNA, die nicht an die Sonden-DNA gebunden hat, abgespült. Die Hybridisierung wird anschließend detektiert, indem die fluoreszierende Substanz, die dazu verwendet wurde, die Proben-DNA zu markieren, und die an die Sonden-DNA gebunden wurde, mittels der Lichtenergie, die von der zuvor festgelegten Lichtquelle ausgesendet wird, angeregt wird, um das Licht, welches durch die Anregung der fluoreszierenden Substanz ausgesendet wird unter Verwendung eines Photosensors wie etwa eines CCD zu scannen.
Das Mittel zum Verbinden der DNA und des Glases, wie etwa Poly-1-Lysin, weist indes eine unzureichende Bindungsfestigkeit gegenüber der DNA auf, und die Sonden-DNA hat sich oftmals zusammen mit der hybridisierten Probe vom Substrat abgelöst. Die Verluste an Sonden-DNA und an Proben-DNA, die auf die unzureichende Bindung zurückzuführen sind, betragen oftmals bis zu 70%, bezogen auf das Gewicht, und nach dem Stand der Technik kommt es zu einer Verschwendung der teuren Sonden-DNA und der kostbaren Proben-DNA.
Um ein derartiges Problem zu umgehen, sind verschiedenar tige Materialien hinsichtlich ihrer Verwendung als Bindemittel untersucht worden. Trotz dieser Versuche hat sich bislang kein Material als wirkungsvoll erwiesen.
In EP-A-0312025 wird eine Polymerschicht auf p-Xylelenbasis offenbart, die durch Vakuumabscheidung unter Einsatz von (2,2)-Paracyclophan, bei welchem die Wasserstoffatome am Benzolring durch Substituenten wie etwa Aminoalkylgruppen ersetzt werden können, erhalten wird. Diese Veröffentlichung betrifft indes das Verfestigen einer niedrigschmelzenden Substanz und enthält, im Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung, keinerlei Verlautbarungen zur Verankerung der DNA oder beliebiger anderer bioaktiver Substanzen.
LAHANN J., KLEE D. UND HOCKER H.: MACROMOLECULAR RAPID COMMUNICATION, vol. 19, 1998, Seiten 441–444 und LAHNN J. ET AL: BIOMATERIALS, vol. 22, April 2001 (2001–04), Seiten 817–826 lehren die Bildung von funktionellen Schichten wie Schichten aus Poly[o-amino-p-xylylen-co-p-xylylen] auf Metallsubstraten wie etwa einem Substrat aus Edelstahl oder aus Ni-Ti-Legierung mittels CVD-Polymerisation von 4-Amino[2,2]-Paracyclophan. Die erstere Veröffentlichung zeigt lediglich, dass die Auswahl der Substituenten für die Verankerung bioaktiver Verbindungen vorteilhaft ist, und die letztere Veröffentlichung zeigt die Verankerung von r-Hirudin (Peptid), wobei gelehrt wird, dass r-Hirudin mit einem Bindemittel wie einem Isocyanat kovalent an eine Aminogruppe gebunden ist, um auf diese Weise die Bindung zu verbessern.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine dünne Polymerschicht bereitzustellen, die als Bindemittel für einen Biochip von Nutzen ist, wobei die Verluste an Sonden- und Probensubstanzen beim Waschschritt verringert wurden, um einen effizienten Einsatz derartiger Sonden und Proben zu erzielen; sowie darin, ein Herstellungsverfahren für einen solchen Biochip bereitzustellen.
Die Aufgabe gemäß der obigen Beschreibung wird durch die vorliegende Erfindung entsprechend der beigefügten Ansprüche gelöst.
I. In den beigefügten Zeichnungen zeigen:
1 ein Blockdiagramm, in welchem das System zur Herstellung des Biochips der vorliegenden Erfindung schematisch dargestellt ist,
2 eine schematische Ansicht, welche das Verfahren zur Biochipherstellung erläutert, und
3 einen Graphen, welcher das Infrarot-Absorptionsspektrum der Polymerschicht zeigt, die in Beispiel A-1 hergestellt wurde.
Die dünne Polymerschicht, die in der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommt, wird hergestellt, indem ein Ausgangsstoff, welcher der folgenden Strukturformel (A-1) entspricht, verdampft und erhitzt wird:
sodass der Stoff in seine Monomerform überführt wird; und indem der erhitzte Stoff in eine Vakuumabscheidungskammer eingeleitet wird, die bei einer zuvor festgelegten Vakuumstärke gehalten wird, um das Monomer auf einem Substrat abzuscheiden und zu polymerisieren, wodurch eine dünne Polymerschicht hergestellt wird.
In der Formel (A-I) können R₁₁ und R₁₂ unabhängig voneinander für eine -CH₂NH₂-Gruppe oder für H stehen, und bei mindestens einer der Einheiten R₁₁ und R₁₂ handelt es sich um eine -CH₂NH₂-Gruppe. Sowohl R₁₁ als auch R₁₂ können für eine -CH₂NH₂-Gruppe stehen.
Wenn eine solche Verbindung als Ausgangsstoff eingesetzt wird und dieser Ausgangsstoff verdampft wird, um auf dem Substrat abgeschieden und polymerisiert zu werden, wird eine dünne Polymerschicht erhalten, die Struktureinheiten aufweist, welche der folgenden Strukturformel (A-II) entsprechen:
In der Formel (A-II) sind n und m unabhängig voneinander eine ganze Zahl, und n kann gleich 0 sein, wenn m nicht gleich 0 ist. m/m + n ist vorzugsweise annähernd gleich 1, da der Anteil an -CH₂NH₂-Gruppen in der Schicht zunimmt, wenn m/m + n sich 1 annähert. Der Wert für m/m + n unterliegt indes keinen besonderen Einschränkungen.
Wenn eine solche dünne Polymerschicht auf einem geeigneten Basismaterial und Substrat gebildet wird, kann ein Biochip erhalten werden, wobei die Verluste an Sonden- und Probensubstanzen beim Waschschritt verringert wurden, um einen effizienten Einsatz derartiger Sonden und Proben zu erzielen.
Bei diesen Biochip kann eine zuverlässigere Bindung zwischen dem Substrat und der Sonde und insbesondere zwischen dem Substrat und der DNA erzielt werden, sodass die Sonde und die Probe auf dem Substrat über den Waschschritt hinaus zurückgehalten werden, um einen effizienten Einsatz der Sonde und der Probe zu ermöglichen.
Die Verbindung, die in dieser Erfindung verwendet wird und in der Strukturformel (A-I) dargestellt ist, wird vorzugsweise durch Gasphasenabscheidung und insbesondere durch CVD verdampft/zersetzt sowie auf dem Substrat polymerisiert/abgeschieden. Somit wird eine feste Bindung zwischen der Verbindung und dem Substrat, welches einen Glasbestandteil oder Ähnliches umfasst, hergestellt, wobei gleichzeitig die Verankerung der Sonde auf dem Substrat verbessert wird, indem die Aminogruppe (NH₂) in der Strukturformel an die Sonde bindet. Wenn die Sonde eine DNA umfasst, wird eine in besonderer Weise verbesserte Verankerung der Sonden-DNA auf dem Substrat hergestellt, indem die Aminogruppe an die Phosphatgruppe (PO₄) des Sonden-DNA-Fragments bindet.
Darüber hinaus ist die Aminogruppe über eine zwischengeschaltete Methylengruppe (-CH₂-) an das Xylylengerüst gebunden, und infolgedessen wird, verglichen mit dem Fall einer direkten Bindung der Aminogruppe an das Gerüst, eine höhere Basizität erzielt. Dadurch wird eine stärkere elekrostatische Bindung zwischen der Verbindung, die in dieser Erfindung verwendet wird, und der DNA oder Ähnlichem hergestellt.
Die Verbindung nach Formel (A-I) kann, zum Beispiel, mittels der unten beschriebenen Vorgehensweise hergestellt werden.
Zuerst wird (2,2)-Paracyclophan in einem Lösemittel wie etwa Dichlormethan bromiert, indem in Gegenwart eines Katalysators wie etwa Eisen oder Iod tropfenweise Brom hinzugegeben wird, wobei wahlweise gekühlt wird. Die Reaktion wird mit Hilfe der Gaschromatographie verfolgt, und die Reaktion ist beendet, wenn die zuvor festgelegte Zusammensetzung erreicht ist, woraufhin das überschüssige Brom mit einer wässrigen Natriumsulfitlösung oder Ähnlichem neutralisiert wird. Anschließend wird das Lösemittel abdestilliert, und die zurückbleibenden Kristalle werden durch Umkristallisation aufgereinigt, um Brom-[2,2]-Paracyclophan zu erhalten.
Das erhaltene Brom-[2,2]-Paracyclophan wird mit einem leichten Überschuss (einer Menge, die geringfügig über der Äquivalentmenge liegt) an Kupfercyanid umgesetzt, und zwar in einem Lösemittel, wobei auf 200 bis 250°C erhitzt wird. Anschließend wird wässriger Ammoniak hinzugefügt, um die Kupferverbindung zu lösen und um das Zielprodukt auszufällen. Die Rohkristalle, die auf diese Weise erhalten werden, werden durch Umkristallisation und/oder Sublimation aufgereinigt, wodurch Cyano-[2,2]-Paracyclophan hergestellt wird.
Anschließend wird das Cyano-[2,2]-Paracyclophan durch katalytische Reduktion oder durch Reduktion in Tetrahydrofuran oder in einem anderen Lösemittel in Gegenwart von Lithiumaluminiumhydrid reduziert, wodurch Aminomethyl-[2,2]-Paracyclophan hergestellt wird.
Das erhaltene Aminomethyl-[2,2]-Paracyclophan, welches in der Strukturformel (A-I) dargestellt ist, kann auf einem Substrat in Form einer Polymerschicht abgeschieden werden, zum Beispiel mittels chemischer Gasphasenabscheidung gemäß der untenstehenden Beschreibung.
Zuerst wird ein Gasphasenabscheidungssystem vorbereitet, welches einen Verdampfungsabschnitt 11, einen Zersetzungsabschnitt 12 und einen Abscheidungsabschnitt 13 gemäß der Darstellung in 1 umfasst. In 1 weist der Verdampfungsabschnitt 11 eine Einlassklappe 11a zum Einleiten des Verdampfungsstoffes auf, und der Abscheidungsabschnitt 13 ist über eine Falle 14 mit einer Vakuumpumpe 15 verbunden.
In einem solchen Gasphasenabscheidungssystem wie es in 1 dargestellt ist, wird zunächst der Verdampfungsabschnitt 11 mit Monoaminomethyl-[2,2]-paracyclophan in fester Form (als Verdampfungsstoff) beschickt. Wenn die Temperatur des Verdampfungsabschnittes 11 auf die Verdampfungstemperatur von Monoaminomethyl-[2,2]-paracyclophan und vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich von 80 bis 200°C und insbesondere von 100 bis 180°C erhöht wird, geht der Verdampfungsstoff in ein gasförmiges Dimer über, wodurch das Ausgangsmaterial als Gas vorliegt.
Anschließend wird dieses gasförmige Dimer des Ausgangsmaterials in den Zersetzungsabschnitt 12 eingeleitet. Im Zersetzungsabschnitt 12 wird das gasförmige Ausgangsmaterial, das auf diese Weise eingeleitet wurde, auf seine Zersetzungstemperatur erhitzt und vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich von 600 bis 750°C und insbesondere von 650 bis 700°C, wodurch das gasförmige Ausgangsmaterial zu einem gasförmigen Monomer zersetzt wird.
Das gasförmige Monomer des Ausgangsmaterials, das auf diese Weise hergestellt wurde, wird anschließend in die Abscheidungskammer 13 eingeleitet, welche bei einer zuvor festgelegten Vakuumstärke gehalten wird, und zwar vorzugsweise bei 10 bis 50 mTorr und insbesondere bei 20 bis 35 mTorr. Wenn das eingeleitete gasförmige Ausgangsmaterial mit dem Substrat in Kontakt kommt, erfolgt an der Grenzfläche eine Polymerisation des Ausgangsmaterials, wodurch die Polymerschicht entsteht.
Bei dem Polymer, welches gemäß der obigen Beschreibung erhalten wird, handelt es sich um eines, das der folgenden Strukturformel (A-II) entspricht:
wobei m und n unabhängig voneinander für eine ganze Zahl stehen und n gleich 0 sein kann.
Die Polymerschicht, die auf diese Weise gebildet wurde, kann eine Dicke aufweisen, die einem Molekül entspricht. Typischerweise kann die Polymerschicht indes eine Dicke von 0,05 bis 10 μm sowie vorzugsweise von ungefähr 0,1 bis 1 μm aufweisen. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Dünnschicht auf einer Schicht abgeschieden werden kann, die aus [2,2]-Paracyclophan oder Chlor-[2,2]-Paracyclophan gebildet ist.
Bei der Gasphasenabscheidung der Polymerschicht kann die Polymerschicht auch in einem zuvor festgelegten Muster gebildet werden, indem eine Maske verwendet wird, die einem solchen zuvor festgelegten Muster entspricht. Die Verwendung einer derartigen Maske ermöglicht es, die Schicht, welche das Bindemittel enthält, mit hoher Genauigkeit nach dem zuvor festgelegten Muster zu bilden, sodass ein Anhaften der Sonde oder der Probe, zum Beispiel der DNA, an unerwünschten Stellen sowie ein Verbleiben solcher Substanzen als Abfall verhindert werden kann. Auf diese Weise wird eine Verringerung des S/N-Verhältnisses aufgrund derartiger Abfälle vermieden.
Die Polymerschicht, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in einem Biochip als Substrat zur Verankerung einer DNA oder einer anderen Sondensubstanz von Nutzen. Zu den Beispielen für Sonden gehören Proteine, Antigenen, Rezeptoren, DNA-Fragmente und RNA-Fragmente. Der erhaltene Biochip wird sich insbesondere durch eine hervorragende Leistungsfähigkeit auszeichnen, wenn DNA oder andere genetische Substanz verankert wird.
Ein Biochip, welcher die Polymerschicht, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, insbesondere als Bindeschicht aufweist, zeigt eine gute Bindungsfähigkeit gegenüber der Sonde, und dementsprechend ist es weniger wahrscheinlich, dass sich die Sonde beim Waschschritt oder Ähnlichem von diesem Biochip ablöst, wodurch ein effizienter Einsatz der Substanzen ermöglicht wird.
Bei dem Bindemittel für einen Biochip gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eines, das der folgenden Strukturformel (B-I) entspricht:
In der Formel (B-I) stehen R₂₁ und R₂₂ unabhängig voneinander für eine -NH₂-Gruppe oder für H, und bei mindestens einer der Einheiten R₂₁ und R₂₂ handelt es sich um eine -NH₂-Gruppe. Sowohl R₂₁ als auch R₂₂ können für eine -NH₂-Gruppe stehen.
Wenn eine solche Verbindung als Bindemittel zum Einsatz kommt, wird eine zuverlässige Bindung zwischen dem Substrat und der Sonden-DNA erzielt, und es wird eine effiziente Verwendung der Sonden-DNA und der Proben-DNA ermöglicht, da ein Abspülen der Sonden-DNA und der Proben-DNA beim Waschschritt mit Wasser oder Ähnlichem vermieden wird.
Die Verbindung, die in dieser Erfindung verwendet wird und die der Strukturformel (B-I) entspricht, wird vorzugsweise durch Gasphasenabscheidung und insbesondere durch CVD verdampft/zersetzt und auf dem Substrat polymerisiert/abgeschieden, um auf diese Weise eine feste Bindung mit dem Substrat, welches einen Glasbestandteil oder Ähnliches umfasst, herzustellen und gleichzeitig eine verbesserte Verankerung der Sonden-DNA auf dem Substrat zu erzie len, indem eine Bindung zwischen der Aminogruppe (NH₂) in der Strukturformel und der Phosphatgruppe (PO₄) des Sonden-DNA-Fragments hergestellt wird. Im Allgemeinen geht das 5'-Ende des DNA-Fragments mit der Verbindung der vorliegenden Erfindung eine Bindung ein.
Die Verbindung, die in dieser Erfindung verwendet wird, kann beispielsweise mittels der unten beschriebenen Vorgehensweise hergestellt werden.
Zuerst wird Paracyclophan unter Rückfluss mit Eisessig erwärmt, und nachdem das Reaktionssystem auf eine zuvor festgelegte Temperatur abgekühlt ist, wird rauchende Salpetersäure unter Rühren tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wird anschließend in eine Vorlage aus kaltem Wasser, beispielsweise aus Eiswasser, gegeben. Der Niederschlag wird anschließend durch Filtration gewonnen und zunächst mit einer alkalischen Lösung und dann mit Wasser gewaschen.
Die erhaltenen Rohkristalle werden mit Isopropylether oder einem anderen Extraktionslösemittel extrahiert und das Lösemittel wird vom Extrakt abdestilliert. Der Rückstand wird anschließend aus Methanol umkristallisiert, um 4-Nitroparacyclophan zu erhalten.
Anschließend wird das erhaltene 4-Nitroparacyclophan in einem Lösemittel wie etwa Toluol gelöst, und nach der Zugabe von Eisenpulver, Ethanol und Wasser wird die Mischung unter Rückfluss erhitzt. Durch Verdünnen von konzentrierter Salzsäure mit Ethanol wird eine Salzsäurelösung hergestellt und anschließend tropfenweise der Mischung zugesetzt, wobei die Mischung unter Rückfluss erhitzt wird, woraufhin das Erhitzen unter Rückfluss mehrere Stunden lang fortgesetzt wird. Nach dem vollständigen Ablauf der Reaktion wird das Reaktionsprodukt abfiltriert und das Filtrat mit Salzsäure extrahiert. Der Extrakt wird mit einem Neut ralisierungsmittel wie etwa Natriumhydroxid neutralisiert. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gewonnen, getrocknet, und die erhaltenen Rohkristalle werden sublimiert. Das Sublimat wird mit Ethanol gemischt, und die Mischung wird unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen werden die erhaltenen Kristalle durch Filtration gewonnen und getrocknet, um 4-Aminoparacyclophan erhalten, welches in der Strukturformel (B-I) dargestellt ist.
Das erhaltene 4-Aminoparacyclophan, das in der Strukturformel (B-1) dargestellt ist, kann auf einem Substrat als bindemittelhaltige Schicht abgeschieden werden, beispielsweise mittels chemischer Gasphasenabscheidung gemäß der untenstehenden Beschreibung.
Zunächst wird ein Gasphasenabscheidungssystem vorbereitet, welches einen Verdampfungsabschnitt 11, einen Zersetzungsabschnitt 12 und einen Abscheidungsabschnitt 13 gemäß der Darstellung in 1 umfasst. In 1 weist der Verdampfungsabschnitt 11 eine Einlassklappe 11a zum Einleiten des Verdampfungsstoffes auf, und der Abscheidungsabschnitt 13 ist über eine Falle 14 mit einer Vakuumpumpe 15 verbunden.
In einem solchen Gasphasenabscheidungssystem wie es in 1 dargestellt ist, wird zunächst der Verdampfungsabschnitt 11 mit 4-Amino-paracyclophan in fester Form (als Verdampfungsstoff) beschickt. Wenn die Temperatur des Verdampfungsabschnittes 11 auf die Verdampfungstemperatur von 4-Amino-paracyclophan und vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich von 60 bis 200°C und insbesondere von 100 bis 180°C erhöht wird, geht der Verdampfungsstoff in ein gasförmiges Dimer über, wodurch das Ausgangsmaterial als Gas vorliegt.
Anschließend wird dieses gasförmige Dimer des Ausgangsmaterials in den Zersetzungsabschnitt 12 eingeleitet. Im Zersetzungsabschnitt 12 wird das gasförmige Ausgangsmaterial, das auf diese Weise eingeleitet wurde, auf seine Zersetzungstemperatur erhitzt und vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich von 600 bis 750°C und insbesondere von 650 bis 700°C, wodurch das gasförmige Ausgangsmaterial zu einem gasförmigen Monomer zersetzt wird.
Das gasförmige Monomer des Ausgangsmaterials, das auf diese Weise hergestellt wurde, wird anschließend in die Abscheidungskammer 13 eingeleitet, welche bei einer zuvor festgelegten Vakuumstärke gehalten wird, und zwar vorzugsweise bei 10 bis 50 mTorr und insbesondere bei 20 bis 35 mTorr. Wenn das eingeleitete gasförmige Ausgangsmaterial mit dem Substrat in Kontakt kommt, erfolgt an der Grenzfläche eine Polymerisation des Ausgangsmaterials, wodurch die Polymerschicht entsteht.
Bei dem Polymer, welches gemäß der obigen Beschreibung erhalten wird, handelt es sich um eines, das der folgenden Strukturformel (B-II) entspricht:
wobei m und n unabhängig voneinander für eine ganze Zahl stehen und n gleich 0 sein kann.
Die Polymerschicht, die auf diese Weise gebildet wurde, kann eine Dicke aufweisen, die einem Molekül entspricht. Typischerweise kann die Polymerschicht indes eine Dicke von ungefähr 0,3 bis 10 μm aufweisen.
Bei der Gasphasenabscheidung kann die bindemittelhaltige Schicht auch in einem zuvor festgelegten Muster gebildet werden, indem eine Maske verwendet wird, die einem solchen zuvor festgelegten Muster entspricht. Die Verwendung einer derartigen Maske ermöglicht es, die bindemittelhaltige Schicht mit hoher Genauigkeit nach dem zuvor festgelegten Muster zu bilden, sodass ein Anhaften der Sonde oder der Probe, zum Beispiel der DNA, an unerwünschten Stellen sowie ein Verbleiben solcher Substanzen als Abfall verhindert werden kann. Auf diese Weise wird eine Verringerung des S/N-Verhältnisses aufgrund derartiger Abfälle vermieden.
Ein Biochip, welcher die Schicht aufweist, die Bindemittel für DNA enthält und die gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, zeigt eine gute Bindungsfähigkeit gegenüber der Sonden-DNA, und dementsprechend ist es weniger wahrscheinlich, dass sich die Sonde beim Waschschritt oder Ähnlichem von diesem Biochip ablöst, wodurch ein effizienter Einsatz der Substanzen ermöglicht wird.
Biochip
Das Substrat umfasst vorzugsweise ein durchsichtiges Glas, Silikon, Polyethylenterephthalat, Celluloseacetate, Bisphenol-A-polycarbonat oder Polycarbonat, Polystyrol, Polymethylmethacrylat oder ein anderes Polymer. Von diesen Bestandteilen wird die Verwendung eines Glases oder Silikons bevorzugt, und zwar unter dem Gesichtspunkt der Einfachheit der Oberflächenbehandlung und der Einfachheit der Untersuchung mittels eines Fluoreszenz-Scansystems. Ebenfalls wird die Verwendung einer Glasplatte mit einer Oberflächenschicht aus Siliziumdioxid bevorzugt. Vorzugsweise kann das Substrat eine Dicke im Bereich von 100 bis 2.000 μm aufweisen. Es darauf hingewiesen, dass die Verwendung eines Harzmaterials wie etwa eines der oben genannten Polymere auch unter dem Gesichtspunkt der Bindung zwischen der Bindeschicht der vorliegenden Erfindung und dem Substrat zu bevorzugen ist, und weiterhin wird vorzugsweise ein Kupplungsmittel zwischen der Bindeschicht der vorliegenden Erfindung und dem Substrat vorgesehen.
In Abhängigkeit vom Zweck der Versuchsreihe können zwei Arten von DNA-Fragmenten für die Sonde verwendet werden. Wenn die Versuchsreihe auf die Genexpression abzielt, wird vorzugsweise ein Polynukleotid wie etwa cDNA, ein Teil der cDNA oder EST verwendet. Diese Polynukleotide können bekannte Funktionen aufweisen. Im Allgemeinen wird das Polynukleotid mittels PCR unter Verwendung einer cDNA-Bank, einer genomischen Bank oder des gesamten Genoms als Template hergestellt, und zwar auf der Grundlage der Sequenz, die in der Datenbank verzeichnet ist (nachstehend wird es als "PCR-Produkt" bezeichnet). Bei dem Polynukleotid kann es sich um eines handeln, das nicht durch PCR vervielfältigt wird. Um die Mutation oder den Polymorphismus eines Gens einer Versuchreihe zu unterziehen, werden verschiedenartige Oligonukleotide, die einer Mutation oder einem Polymorphismus entsprechen, vorzugsweise auf der Grundlage bekannter Referenzsequenzen synthetisiert. Zu Verwendung der Nukleotidsequenz in Versuchsreihen werden vorzugsweise 4n-Typen (n: Länge des Nukleotids) des Oligonukleotids synthetisiert. Das DNA-Fragment kann vorzugsweise eine bekannte Nukleotidsequenz aufweisen.
Das punktförmige Aufbringen der DNA-Fragmente erfolgt vorzugsweise indem die wässrigen Lösungen der DNA-Fragmente in einem Kunststoffteller in einem wässrigen Medium verteilt werden, woraufhin die verteilte wässrige Lösung unter Verwendung einer Punktaufgabevorrichtung auf das Substrat getropft wird.
Die Anzahl der punktförmig aufgebrachten DNA-Fragmente liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 10² bis 10⁵ Arten/cm² der Substratoberfläche. Die Menge an DNA-Fragmenten liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 1 bis 10–15 mol und beträgt nach Gewicht bis zu mehreren ng. Ein solches punktförmiges Aufbringen führt dazu, dass die wässrigen Lösungen des DNA-Fragments in Form von Punkten auf der Oberfläche des Substrats verankert sind, wobei die Punkte in Abständen von 0 bis 1,5 mm, mit dem größten Vorzug von 100 bis 300 μm, angeordnet sind. Die Größe eines Punktes ist vorzugsweise derart bemessen, dass der Durchmesser im Bereich von 50 bis 300 μm liegt. Die Menge an punktförmig aufgebrachtem DNA-Fragment liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 100 pL bis 1 μL und mit dem größten Vorzug im Bereich von 1 bis 100 nL.
In der vorliegenden Erfindung kann die Verankerung der DNA an der Aminogruppe mittels eines beliebigen Verfahrens erfolgen, beispielsweise unter Einsatz elektrostatischer Wechselwirkungen oder durch Verwendung eines UV-Quervernetzers.
Nach dem punktförmigen Aufbringen und dem wahlweisen Trocknen wird der Chip vorzugsweise gewaschen, um DNA, die nicht verankert wurde, zu entfernen.
Die Punkte, die gemäß der obigen Beschreibung auf der Oberfläche des Substrats gebildet werden, sind im Wesentlichen von runder Form. Die Stabilität der Punktform ist insbesondere im Falle einer quantitativen Untersuchung der Genexpression oder Einbasenmutation von Bedeutung.
Die Chips, die auf diese Weise hergestellt werden, haben eine beträchtliche Lebensdauer. Im Falle eines cDNA-Chips, auf welchem cDNAs verankert sind, beträgt die Lebensdauer des Chips mehrere Wochen, während die Lebensdauer des Chips im Falle eines Oligodesoxynukleotidchips, auf welchem Oligodesoxynukleotide verankert sind, sogar noch länger sein kann. Ein derartiger Biochip wird zum Verfolgen der Genexpression, zur Bestimmung der Nukleotidsequenz sowie zu Versuchsreihen zur Mutation, Versuchsreihen zum Polymorphismus und zu Ähnlichem verwendet. Das Prinzip der Detektion besteht in der Hybridisierung der verankerten Sonde mit der markierten Ziel-Nukleinsäure.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Ziel-Nukleinsäure, die für die Probe verwendet wird, um eine DNA-Fragment- oder RNA-Fragmentprobe mit einer unbekannten Sequenz und einer unbekannten Funktion.
Im Falle der Durchführung einer Versuchsreihe zur Genexpression handelt es sich bei der Ziel-Nukleinsäure vorzugsweise um diejenige, welche aus einer eukaryotischen Zelle oder einer Gewebeprobe isoliert wurde. Wenn das Genom das Ziel darstellt, handelt es sich bei der Ziel-Nukleinsäure vorzugsweise um diejenige, welche aus einem Nicht-Erythrozyten-Gewebe isoliert wurde. Bei dem Nicht-Erythrozyten-Gewebe kann es sich vorzugsweise um periphere Blutlymphozyten, Haut, Haar, Sperma oder Ähnliches handeln. Wenn es sich bei dem Ziel um mRNA handelt, wird die Probe vorzugsweise aus einer Gewebeprobe extrahiert, in welcher die mRNA exprimiert wird. Aus der mRNA wird vorzugsweise eine markierte cDNA hergestellt, indem mittels reverser Transkription das markierte dNTP ("dNTP" bezeichnet ein Desoxyribonukleotid, wobei es sich bei dem Nukleotid um Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) oder Thymin (T) handelt) eingebaut wird. Unter dem Gesichtspunkt der chemischen Stabilität wird vorzugsweise dCTP als dNTP eingesetzt. Die Menge an mRNA, die für eine Hybridisierung erforderlich ist, beträgt vorzugsweise bis zu mehreren μg, obgleich eine solche Menge gemäß der Flüssigkeitsmenge und dem Markierungsverfahren unterschiedlich sein kann. Es sei darauf hingewiesen, dass, wenn es sich bei den DNA-Fragmenten auf dem Biochip um Oligodesoxynukleotide handelt, das Molekulargewicht der Ziel-Nukleinsäure vorzugsweise vor der Versuchsreihe verringert wird. Im Falle einer prokaryotischen Zelle ist es angesichts der Schwierigkeit der selektiven Extraktion der mRNA vorzuziehen, die gesamte RNA zu markieren.
Um die Mutation oder den Polymorphismus einer Versuchsreihe zu unterziehen, wird die Ziel-Nukleinsäure vorzugsweise hergestellt, indem eine PCR der Zielregion durchgeführt wird, und zwar in dem Reaktionssystem, das den markierten Primer oder das markierte dNTP enthält.
Zu den Markierungsverfahren gehören diejenigen, bei denen RI zum Einsatz kommt, und diejenigen, die ohne RI auskommen, wobei die Nicht-RI-Verfahren bevorzugt werden. Zu den Nicht-RI-Verfahren gehören die Fluoreszenz-Markierung, die Biotin-Markierung und Chemilumineszenz-Markierungsverfahren, wobei das Fluoreszenz-Markierungsverfahren bevorzugt wird. Es kann eine beliebige fluoreszierende Substanz verwendet werden, mit der Maßgabe, dass die Substanz an die Basis-Untereinheit einer Nukleinsäure binden kann. Die Verwendung von Cyaninfarbstoff (zum Beispiel Cy3 und Cy5 aus der Cy-Farbstoffreihe TM), Rhodamin-6G-Reagens, N-Acetoxy-N₂-acetylaminofluoren (AAF) sowie AAIF (Iodderivat von AAF) wird indes bevorzugt.
Die Hybridisierung erfolgt vorzugsweise indem eine wässrige Lösung hergestellt wird, in welcher die markierte Ziel-Nukleinsäure gelöst oder dispergiert ist, woraufhin die wässrige Lösung in einem Kunststoffteller verteilt wird, um die wässrige Lösung punktförmig auf den Biochip, der gemäß der obigen Beschreibung hergestellt wurde, aufzubringen. Die punktförmig aufgebrachte Menge liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 nL. Die Hybridisierung wird vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich zwischen der Raumtemperatur und 70°C sowie für eine Zeitdauer von 6 bis 20 Stunden durchgeführt. Nach Abschluss der Hybridisierung wird der Biochip vorzugsweise mit einer Mischung aus einem Tensid und einer Pufferlösung gewaschen, um die Ziel-Nukleinsäure, die keine Hybridisierung erfahren hat, zu entfernen. Zu den beispielhaften Tensiden gehören Natriumlaurylsulfat (SDS). Zu den beispielhaften Pufferlösungen gehören Citratpufferlösung, Phosphatpufferlösung, Boratpufferlösung, TRIS-Pufferlösung und Good's Pufferlösung, wobei die Verwendung von Citratpufferlösung bevorzugt wird.
Das kennzeichnende Merkmal der Hybridisierung unter Verwendung eines Biochips ist die drastisch verringerte Menge an markierter Nukleinsäure. Infolgedessen ist eine sorgfältige Wahl der optimalen Bedingung für die Hybridisierung erforderlich, wobei diese von der Länge des DNA-Fragments, das auf dem Substrat verankert ist, sowie von der Art der markierten Ziel-Nukleinsäure abhängen. Im Falle einer Versuchsreihe zur Genexpression wird die Hybridisierung vorzugsweise bei niedriger Stringenz für eine lange Zeitdauer durchgeführt, um auf diese Weise die Detektion eines Gens, welches auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird, zu ermöglichen. Im Falle einer Versuchsreihe zur Einbasen-Mutation wird die Hybridisierung vorzugsweise bei hoher Stringenz für eine kurze Zeitdauer durchgeführt. Bei der Hybridisierung unter Verwendung eines Biochips können auch zwei Arten von Ziel-Nukleinsäuren, die mit verschiedenen fluoreszierenden Substanzen markiert sind, gleichzeitig auf einem Biochip verwendet werden, um dadurch einen Vergleich oder eine quantitative Auswertung der exprimierten Menge zu ermöglichen.
BEISPIELE
Beispiel A-1
<Synthese von Monobrom-[2,2]-paracyclophan>
Einer Lösung von 75 g [2,2]-Paracyclophan und 3,7 L Dichlormethan wurden 3,0 g an reduziertem Eisen und 0,3 g an Wasser zugesetzt, woraufhin dieser Mischung unter Rühren bei einer Temperatur von bis zu 30°C 73,5 g an Brom zugesetzt wurden. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Gaschromatographie verfolgt, und eine Lösung von 80 g Natriumthiosulfat in 1,5 L Wasser wurde hinzugefügt, als der Anteil des nicht umgesetzten [2,2]-Paracyclophan auf 3,0% gesunken war.
Anschließend wurde die Dichlormethanschicht abgetrennt, und nach Zugabe von wässrigem Natriumhydroxid wurde das Dichlormethan durch Destillation entfernt. Der Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt, gewaschen und getrocknet, um 105,5 g an Rohkristallen zu erhalten. Die Kristalle wurden in 320 g Toluol unter Erwärmen gelöst, und die Lösung wurde in noch heißem Zustand filtriert, um auf diese Weise unlösliche Inhaltsstoffe zu entfernen. Die Toluollösung wurde aufkonzentriert und abgekühlt. Der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und getrocknet, um 81,0 g an Monobrom-[2,2]-Paracyclophan zu erhalten.
Diese Verbindung wies die unten beschriebene Zusammensetzung auf, wobei die Analyse mittels Gaschromatographie durchgeführt wurde.

[2,2]-Paracyclophan 4,0%

Monobrom-[2,2]-paracyclophan 94,9%

Dibrom-[2,2]-paracyclophan 1,0%
<Synthese von Monocyano-[2,2]-paracyclophan>
Zu 35 der Verbindung, die auf diese Weise erhalten wurde, wurden 16,9 g an Kupfercyanid und 200 ml an N-Methylpyrrolidon gegeben, und die Mischung wurde bei 195 bis 205°C 20 Minuten lang gerührt. Dieser Mischung wurden anschließend 1,0 L an 10 %igem wässrigen Ammoniak zugesetzt, und der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen, gewaschen und getrocknet, um 38,9 g an Rohkristallen zu erhalten. Die Kristalle wurden in 30 g Aceton unter Erwärmen gelöst, und die Lösung wurde in noch heißem Zustand filtriert, um auf diese Weise unlösliche Inhaltsstoffe zu entfernen. Die Lösung wurde bis zur Trockene eingedampft, um auf diese Weise 26,4 g an Rohkristallen zu erhalten. Die Kristalle wurden durch Sublimation und Umkristallisation in 60 g Ethanol aufgereinigt, um 22,3 g einer Verbindung zu erhalten, die hauptsächlich Monocyano-[2,2]-paracyclophan um fasst.
Diese Verbindung wies die unten beschriebene Zusammensetzung auf, wobei die Analyse mittels Gaschromatographie durchgeführt wurde.

[2,2]-Paracyclophan 3,0%

Monocyano-[2,2]-paracyclophan 94,5%

Dicyano-[2,2]-paracyclophan 1,8%
Synthese von Monoaminomethyl-[2,2]-paracyclophan
Zu 500 g an Tetrahydrofuran, welches in einem Eisbad gekühlt worden war, wurden 15 g an Lithiumaluminiumhydrid gegeben, woraufhin dieser Mischung eine Lösung von 15 g der Verbindung, die in 2 erhalten wurde, in 100 g Tetrahydrofuran bei einer Temperatur von bis zu 20°C tropfenweise zugesetzt wurde.
Es wurde bei Raumtemperatur weitergerührt, bis der Gehalt an nicht umgesetztem Monocyano-[2,2]-paracyclophan gemäß der gaschromatographischen Analyse auf 1% oder weniger gesunken war. Nach dem vollständigen Ablauf der Reaktion wurde die Lösung in einem Eisbad gekühlt, und 100 g Wasser wurden der Lösung zugesetzt. Die ausgefallenen unlöslichen Inhaltsstoffe wurden durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde bis zur Trockene eingedampft. Zu den erhaltenen Rohkristallen wurden 300 g an Methanol hinzugefügt, und die Mischung wurde erwärmt, um das Inlösunggehen zu bewirken. Anschließend wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, und die unlöslichen Inhaltstoffe wurden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde bis zur Trockene eingedampft, um 13,8 g einer Verbindung zu erhalten, die hauptsächlich Monoaminomethyl-[2,2]-paracyclophan umfasste.
Diese Verbindung wies die unten beschriebene Zusammensetzung auf, wobei die Analyse mittels Gaschromatographie durchgeführt wurde.

[2,2]-Paracyclophan 3,0%

Monoaminomethyl-[2,2]-paracyclophan 94,1%

Diaminomethyl-[2,2]-paracyclophan 1,1%
<Bildung der dünnen Polymerschicht>
Ein Gasphasenabscheidungssystem gemäß der Darstellung in 1, welches einen Verdampfungsabschnitt 11, einen Zersetzungsabschnitt 12 und einen Abscheidungsschnitt 13 umfasst, wurde vorbereitet.
In dem Gasphasenabscheidungssystem wie es in 1 dargestellt ist, wurde der Verdampfungsabschnitt 11 mit Monoaminomethyl-[2,2]-paracyclophan, welches den feststofflichen Verdampfungsstoff nach Formel (A-I) bildet, beschickt. Als die Temperatur des Verdampfungsabschnittes 11 auf 100 bis 150°C erhöht wurde, ging der Verdampfungsstoff in ein gasförmiges Dimer über, welches die unten dargestellte Struktur aufwies. Auf diese Weise wurde bewirkt, dass das Ausgangsmaterial in Gasform vorliegt.
In der Formel A-I stehen R₁₁ und R₁₂ unabhängig voneinander für eine -CH₂NH₂-Gruppe oder für H, und bei mindestens einer der Einheiten R₁₁ und R₁₂ handelt es sich um eine -CH₂NH₂-Gruppe. Es ist ebenfalls akzeptabel, dass es sich sowohl bei R₁₁ als auch bei R₁₂ um -CH₂NH₂ handelt.
Anschließend wird das Ausgangsmaterial in Form eines gas förmigen Dimers in den Zersetzungsabschnitt 12 eingeleitet. In diesem Zersetzungsabschnitt 12 wird das eingeleitete gasförmige Ausgangsmaterial auf seine Zersetzungstemperatur von 700°C erhitzt, wodurch das gasförmige Ausgangsmaterial zu einem gasförmigen Monomer, das im folgenden Schema dargestellt ist, zersetzt wird.
Das erhaltene gasförmige Monomer des Ausgangsmaterials wird anschließend in die Abscheidungskammer 13 eingeleitet, welche bei einer Vakuumstärke von höchstens 30,1 mmTorr gehalten wird. Das gasförmige Ausgangsmaterial polymerisierte auf der Oberfläche des Glassubstrats, und die Polymerschicht, die in der Strukturformel gemäß der untenstehenden Beschreibung dargestellt ist, wurde gebildet. Es sei darauf hingewiesen, dass die Oberfläche des Glassubstrats mit einem Silan-Kupplungsmittel behandelt werden kann, um auf diese Weise die Bindung zwischen der Polymerschicht und dem Glassubstrat zu verbessern.
m und n stehen unabhängig voneinander für eine ganze Zahl
Anschließend wurde eine wässrige Lösung (100 μM) einer synthetischen 30-mer DNA, die am 5'-Ende mit Cy3 oder Cy5 markiert war, hergestellt, um als Sonden-DNA eingesetzt zu werden. Die Sonden-DNA wurde in der Mikroplatte 22 am Stift befestigt, und diese Sonden-DNA am Stift wurde mit der Glasplatte 23, auf welcher die Polymerschicht gebildet wurde, in Kontakt gebracht, um das punktförmige Aufbringen durchzuführen. Diese Vorgehensweise wurde wiederholt, bis das punktförmige Aufbringen der Sonden-DNA abgeschlossen war, um auf diese Weise den Biochip, der in 2 SCHRITT (D) dargestellt ist, herzustellen.
Zur Verankerung der DNA an der Aminogruppe wurde versucht, die Verankerung einerseits unter Einsatz elektrostatischer Wechselwirkungen sowie andererseits unter Verwendung eines UV-Quervernetzungsmittels zu erzielen. Im Falle des Verfahrens, bei welchem die elektrostatischen Wechselwirkungen eingesetzt werden, wurde das Substrat über Nacht in einer Humidistat-Kammer belassen und anschließend über Nacht bei 80°C getrocknet. Im Falle des Verfahrens, bei welchem das UV-Quervernetzungsmittel verwendet wird, wurde das Substrat 2 Minuten lang in dem UV-Quervernetzungsmittel belassen. Anschließend wurde die Probe über Nacht mit destilliertem Wasser gewaschen.
Die erhaltene Probe wurde vor der DNA-Verankerung (unmittelbar nach dem punktförmigen Aufbringen) und nach der Verankerung und dem Waschen auf Fluoreszenz überprüft, um auf diese Weise den Verankerungszustand der Sonde zu bewerten.
Im Falle der Proben der vorliegenden Erfindung wurde die Bildung gleichförmiger Punkte nach dem punktförmigen Aufbringen sowie nach der UV-Bestrahlung bestätigt. Nach dem Waschen wurde gelegentlich außerhalb der aufgebrachten Punkte überschüssige DNA gefunden, was darauf hindeutete, dass diese Bindemittelschicht mit der DNA ohne Schwierigkeiten eine feste Bindung eingeht. Im Hinblick auf eine solche Situation ist es bei der praktischen Anwendung des Biochips der vorliegenden Erfindung erstrebenswert, das Hintergrundrauschen durch Maskierung des Bereiches des Biochips, der außerhalb der aufgebrachten Punkte liegt, zu entfernen, und zwar indem die Bindeschicht unter Verwendung einer Maske mit zuvor festgelegtem Muster abgeschieden wird oder indem die die Fluoreszenzauswertung auf den Bereich der aufgebrachten Punkte beschränkt wird.
Beispiel B-1
<Synthese von 4-Nitro-(2,2)-paracyclophan>
Zunächst wurden 20 g an (2,2)-Paracyclophan mit 800 g Eisessig unter Rückfluss erhitzt (teilweise unlöslich). Unmittelbar nach dem Abkühlen der Lösung auf 75°C wurde rauchende Salpetersäure (d = 1,50) tropfenweise hinzugefügt, und die Mischung wurde nach der Beendigung der Zugabe 5 Minuten lang gerührt. Zu diesem Zeitpunkt stieg die Temperatur der Lösung auf 85°C an. Die Reaktionsmischung wurde anschließend in eine Vorlage aus Eiswasser gegeben, und der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen, mit alkalischer Lösung und anschließend mit Wasser gewaschen (Ausbeute an Rohkristallen: 9,2 g).
Die erhaltenen Rohkristalle wurden mit Isopropylether extrahiert, und der Isopropylether wurde vom Extrakt abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Methanol umkristallisiert, um 5,3 g an 4-Nitro-(2,2)-paracyclophan zu erhalten.
<Synthese von 4-Amino-(2,2)-paracyclophan>
Anschließend wurden 5,0 des erhaltenen 4-Nitro-(2,2)-paracyclophans in 200 g Toluol gelöst, und der Lösung wurden 6 g an Eisenpulver, 70 mL an Ethanol und 30 mL an Wasser zugesetzt. Die Mischung wurde unter Rückfluss erhitzt, und es wurde eine Salzsäurelösung, die durch Verdünnung von 5 ml konzentrierter Salzsäure mit 20 ml an 50 %igem Ethanol hergestellt wurde, tropfenweise über einen Zeitraum von 1 Stunde zugesetzt, wobei unter Rückfluss erhitzt wurde und das Erhitzen unter Rückfluss weitere 4 Stunden lang fortgesetzt wurde. Nach dem vollständigen Ablauf der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt filtriert, und das Filtrat wurde mit Salzsäure extrahiert. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und getrocknet (Ausbeute an Rohkristallen: 4,1 g). Der erhaltene Niederschlag wurde sublimiert. Das Sublimat wurde mit Ethanol gemischt, und die Mischung wurde unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden die erhaltenen Kristalle durch Filtration gewonnen und getrocknet, um 4-Amino-(2,2)-paracyclophan erhalten, welches in der Strukturformel (B-I) dargestellt ist. Die Struktur wurde mittels Gaschromatographie und Massenspektroskopie bestätigt.
<Bildung der bindemittelhaltigen Schicht>
Ein Gasphasenabscheidungssystem gemäß der Darstellung in 1, welches einen Verdampfungsabschnitt 11, einen Zersetzungsabschnitt 12 und einen Abscheidungsschnitt 13 umfasst, wurde vorbereitet.
In dem Gasphasenabscheidungssystem, das in 1 dargestellt ist, wurde der Verdampfungsabschnitt 11 mit 4-Amino-(2,2)-paracyclophan, welches die Struktur nach Formel (B-I) aufweist (als Verdampfungsstoff) beschickt. Als die Temperatur des Verdampfungsabschnittes 11 auf 100 bis 150°C erhöht wurde, verdampfte der Verdampfungsstoff, wobei ein gasförmiges Dimer mit der unten dargestellten Struktur entstand. Dieses Gas wurde als gasförmiges Ausgangsmaterial eingesetzt.
In der Formel B-I stehen R₂₁ und R₂₂ unabhängig voneinander für eine -NH₂-Gruppe oder für H, und bei mindestens einer der Einheiten R₂₁ und R₂₂ handelt es sich um eine -NH₂-Gruppe. Es ist ebenfalls akzeptabel, dass es sich sowohl bei R₂₁ als auch bei R₂₂ um -NH₂ handelt.
Anschließend wird das Ausgangsmaterial in Form eines gasförmigen Dimers in die Zersetzungskammer 12 eingeleitet. In dieser Zersetzungskammer 12 wird das eingeleitete gasförmige Ausgangsmaterial auf seine Zersetzungstemperatur von 700°C erhitzt, um das gasförmige Ausgangsmaterial zu einem gasförmigen Monomer zu zersetzen.
Das erhaltene gasförmige Monomer des Ausgangsmaterials wird anschließend in die Abscheidungskammer 13 eingeleitet, welche bei einer Vakuumstärke von höchstens 30,1 mmTorr gehalten wird. Das gasförmige Ausgangsmaterial polymeri sierte auf der Oberfläche des Glassubstrats, und die Polymerschicht, die in der Strukturformel gemäß der untenstehenden Beschreibung dargestellt ist, wurde gebildet. Das Infrarot-Absorptionsspektrum der erhaltenen Polymerschicht in 3 dargestellt.
m und n stehen unabhängig voneinander für eine ganze Zahl
Die Sonden-DNA wurde anschließend in der Mikroplatte 22 am Stift befestigt, und diese Sonden-DNA am Stift wurde mit der Glasplatte 23, auf welcher die Polymerschicht gebildet wurde, in Kontakt gebracht, um das punktförmige Aufbringen durchzuführen. Diese Vorgehensweise wurde wiederholt, bis sämtliche Sonden-DNAs in den Mikroplatte 22 punktförmig aufgebracht worden waren, wodurch der Biochip wie er in 2 SCHRITT (D) gezeigt ist, hergestellt wurde.
Die Hybridisierung des Biochips wurde erzielt, indem sowohl der Biochip mit der Sonden-DNA, die an die Glasplatte gebunden war, als auch die Proben-DNA, die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert war, zur Hybridisierung in eine Hybridisierungslösung gegeben wurde. Bei der Hybridisierungslösung handelte es sich um eine gemischte Lösung, die Formaldehyd, SSC (NaCl, Trinatriumcitrat), SDS (Natriumlaurylsulfat), EDTA (Ethylendiamidtetraessigsäure), destilliertes Wasser und Ähnliches umfasste, wobei das Mischungsverhältnis in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der eingesetzten DNA variieren konnte.
Anschließend wurde die Proben-DNA, die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert worden war und die auf der Glasplatte verblieb, in einem Wasserbehälter oder Ähnlichem gewaschen, um die Proben-DNA, die nicht an die Sonden-DNA gebunden wurde, zu entfernen.
Bei diesem Vorgang verblieb beinahe die gesamte Sonden-DNA, die an das Substrat gebunden worden war, auf dem Substrat, ohne sich abzulösen, und es wurde bestätigt, dass die DNA bei dem Waschvorgang nicht von dem Biochip ablöst wird.
Die Hybridisierung wurde anschließend detektiert, indem die fluoreszierende Markierung an der Proben-DNA, wobei letztere die an die Sonden-DNA gebunden worden war, mittels der Lichtenergie der zuvor festgelegten Lichtquelle angeregt wurde, um das Licht, welches durch die Anregung der fluoreszierenden Markierung ausgesendet wurde, mit einem Photosensors wie etwa CCD detektieren.
Es wurde daraufhin bestätigt, dass die gewünschte Hybridisierung ordnungsgemäß erfolgt war, und das S/N-Verhältnis lag auf einem ausreichenden Niveau.
Beispiel B-2
In Beispiel B-1 wurde die bindemittelhaltige Schicht gebildet, indem eine Maske mit einem zuvor festgelegten Muster verwendet wurde, um auf diese Weise eine bindemittelhaltige Schicht mit einem Muster, welches dem Muster der aufgebrachten Punkte entspricht, zu bilden.
Der Biochip wurde hergestellt, indem die Vorgehensweise des Beispiels 1 wiederholt wurde, mit der Ausnahme, dass die DNA-Sonde in der Mikroplatte 22 als Schicht und nicht punktförmig aufgebracht wurde, woraufhin der Chip mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet wurde.
Der erhaltene Biochip wurde wie im Falle des Beispiels 1 bewertet, und es wurde festgestellt, dass das S/N-Verhältnis verbessert wurde, und zwar ohne Entstehen von Abfall.
Wie oben beschrieben ist, stellt die vorliegende Erfindung eine dünne Polymerschicht bereit, die als Bindemittel für einen Biochip von Nutzen ist, wobei die Verluste an Sonden- und Probensubstanzen beim Waschen verringert wurden, um einen effizienten Einsatz derartiger Sonden und Proben zu erzielen.

Claims

Biochip, umfassend ein Substrat und eine dünne Polymer-Schicht, die auf dem Substrat gebildet ist, wobei die dünne Polymer-Schicht mindestens eine Verbindung mit der folgenden Struktureinheit (A-II):
umfasst, wobei m und n unabhängig voneinander eine ganze Zahl darstellen oder die folgende Struktureinheit (B-II) aufweisen:
wobei m und n unabhängig voneinander eine ganze Zahl darstellen, als eine Bindemittel-enthaltende Lage, wobei das Bindemittel der Lage eine daran gebundene Sonden-DNA aufweist.
Biochip, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Bindemittel-enthaltende Lage durch Vakuumablagerung gebildet wurde.
Biochip, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, wobei die Bindemittel-enthaltende Lage mittels Maskierung mit einem Muster gebildet ist.
Biochip, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei das Substrat ein transparentes Glas, ein Silikon oder ein Polymer ist.
Verfahren zur Herstellung eines Biochips, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, umfassend die Schritte: Abdampfen und Erhitzen eines Ausgangsmaterials, dargestellt durch die folgende Strukturformel (A-I):
wobei R₁₁ und R₁₂ unabhängig voneinander die CH₂NH₂-Gruppe oder H darstellen, und mindestens einer von R₁₁ und R₁₂ die CH₂NH₂-Gruppe oder (B-I) ist:
wobei R₂₁ und R₂₂ unabhängig voneinander die NH₂-Gruppe oder H darstellen und mindestens einer von R₂₁ und R₂₂ die NH₂-Gruppe ist, um das Material in die Form eines Monomers zu bringen; Einführen des erhitzten Materials in eine Vakuumablagerungskammer, die auf einer vorher bestimmten Vakuumstufe gehalten wird, um das Monomer auf dem Substrat abzulagern und zu polymerisieren, wodurch die Bindemittel-enthaltende Lage gebildet wird, und Binden einer DNA-Sonde an die Bindemittel-enthaltende Lage, um einen Biochip zu bilden.