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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung hat ein Parallelherstellungsverfahren einer
Matrix aus chemischen oder biologischen Molekülsequenzen für eine chemische
oder biologische Analysevorrichtung zum Gegenstand.
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Die
chemischen oder biologischen Moleküle können insbesondere Aminosäuren oder
Nukloetide sein, wobei die Sequenzen dann Peptide oder Oligonukloetide
sind.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere die Realisierung einer Matrix von
Oligonukloetiden unterschiedlicher Sequenzen für die Analyse oder die Diagnostik
oder die genetische Forschung (Mutationen, Polymorphismen, Transkriptome).
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Stand der
Technik
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Zur
Sequenzierung und Untersuchung der Gen-Expression werden neue chemische
oder biologische Analysesysteme oder -vorrichtungen verwendet. Sie
werden gebildet durch ein System von Molekularsonden (Oligonukloetiden),
fixiert auf der minaturisierten Oberfläche eines Substrats, um einen
Biochip oder DNA-Chip zu realisieren.
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Im
Laufe der Analyse einer Probe werden die extrahierten Zielnukleinsäuren markiert
und auf der Sondenmatrix abgeschieden. Die Hybridisierung (Paarung
zwischen den komplementären
Strängen
der DNA-Doppelhelix) zwischen den Sonden und den markierten Zielen
ermöglicht,
die Sequenzen der DNA-Probe zu orten und zu identifizieren.
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Zahlreiche
Realisierungsverfahren wurden beschrieben und entwickelt, um die
Miniaturisierung und die Dichtekapazität der Analyseplätze auf
dem Chip zu verbessern.
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Diverse
Techniken zur Pfropfung und Immobilisierung der Sonden (durch kovalente
oder elektrostatische Bindung) auf verschiedenen Substraten (Silicium,
Glas, Polymer, Goldelektroden ...) waren Gegenstand industrieller
Forschungen und Entwicklungen.
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Die
Sondenmatrizen werden demnach realisiert:
- – entweder
durch Immobilisierung von vorsynthetisierten Oligonukloetiden durch
Pfropfung von diesen auf einem funktionalisierten Substrat oder
auf einem leitfähigen
Polymer,
- – oder
durch In-situ-Synthese der Sonden-Oligonukloetide auf einem Substrat.
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Die
bis heute angewendeten In-situ-Syntheseverfahren greifen auf zwei
unterschiedliche Adressierungsarten der Analyseplätze zurück, nämlich die
manuelle Adressierung durch Mikroroboter, wie beschrieben in US-A-5
474 796 [1], und die photochemische Adressierung, wie beschrieben
in WO-A-97/39 151 [2].
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In
dem Dokument US-A-5 474 796 [1] bildet man zunächst auf dem Substrat funktionalisierte
Plätze aus,
indem man Photoresists oder Masken verwendet, um die verschiedenen
Analyseplätze
des Substrats zu definieren. Dann bildet man die Oligonukloetidsequenzen
auf den funktionalisierten Plätzen
durch Injektion der Reagenzien in die gewünschten Plätze mittels einer piezoelektrischen
Pumpe.
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In
dem Dokument WO-A-97/39151 [2] unterzieht man das Substrat zunächst einer
Behandlung, um es mit Funktionsgruppen, geschützt durch eine photolabile
Schutzgruppe, auszustatten, und befreit dann durch selektive Bestrahlung
durch eine Maske hindurch bestimmte Gruppen des Substrats, um die
Plätze
zu definieren, und lässt
anschließend
in diesen Plätzen
ein Nukloetid reagieren, um die erwünschte Sequenz zu konstruieren.
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In
beiden Fällen
greift die In-situ-Synthese auf die klassischen Kupplungsreaktionen
mittels der Phosphoramidite, der Phosphite oder der Phosphonate
zurück,
zur sukzessiven Kondensation der vernünftig bzw. gut geschützten Nukloetide.
Der Synthesezyklus umfasst die Befreiungs-, Kupplungs-, Blockierungs-
und Oxidierungsschritte und ermöglicht
das Wachstum der Oligonukloetide auf der Oberfläche jedes Analyseplatzes.
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Bei
der photochemischen Adressierung realisiert man die Befreiungsschritte
der Nukloetide durch das Licht. Die Adressierung der Plätze erfolgt
durch einen Lithographieschritt (Bestrahlung durch eine Maske hindurch).
Die photolabile Schutzgruppe wird durch das Licht eliminiert, was
dann durch das Eintauchen des Substrats in eine Lösung eines
aktivierten Nukloetids das spätere
Koppeln (zum Beispiel eines Phosphoramidits) unter Präsenz eines
Katalysators, zum Beispiel Tetrazol, ermöglicht.
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Dieses
kombinatorische Analyseverfahren, gesteuert durch Licht, erfordert
die Realisierung einer Anzahl von Masken gleich der Anzahl der das
Oligonukloetid bildenden Nukloetide und ist eine teure und langwierige
Operation. Zwar hat dieses Verfahren den Vorteil, Chips mit sehr
hoher Dichte zu ermöglichen
(Auflösung
des Photolithographieverfahrens), jedoch erreicht der Wirkungsgrad
der photochemischen Reaktionen (Eliminierung der photolabilen Gruppen)
niemals 100%, und die Reinheit der auf dem Chip realisierten Oligonukloetidsequenz
ist nicht gewährleistet.
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Im
Falle des Dokuments US-A-5 474 796 [1], wo die Strahldrucktechnik
angewendet wird (piezoelektrische Köpfe), um die 4 aktivierten
DNA-Basisnukloetide sowie die Kupplungsreagenzien auf den verschiedenen
Plätzen
des Chips anzubringen, erfordert die Festphasensynthese auf Plätzen von
ungefähr
100 μm2
mit Reagenzienmengen von ungefähr
einem Nanoliter kontrollierte atmosphärische Bedingungen (Empfindlichkeit gegenüber Feuchtigkeit
und Sauerstoff), die in der Umgebung einer Mikrospendevorrichtung
und der dazugehörenden
Geräte
nur schwer zu verwirklichen sind. Sie erfordert außerdem Lösungsmittel
mit hohem Siedepunkt und nur wenig flüchtige Reagenzien.
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Bekannt
sind noch Verfahren zur In-situ-Oligonukleotidsynthese, in denen
Masken benutzt werden, um die Zonen des Substrats zu definieren,
die den sukzessiven Synthesezyklen ausgesetzt werden müssen.
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So
beschreibt das Dokument EP-A-0 728 520 [3] ein Verfahren zur Herstellung
von Matrizen aus Oligonukleotid-Sonden, bei dem ein Substrat verwendet
wird, das auf seiner gesamten Oberfläche geschützte Funktionsgruppen, die
zur Befestigung der Nukloetide bestimmt sind, und ein Barrierematerial
zur Definition der Zonen des Substrats umfasst, die zu modifizieren
sind. Dieses Material kann ausgewählt werden unter den Lacken,
den flüssigen Ölen, den
Polyestern, den Polyurethanen und den Expoxydharzen, die generell
flüssige Prepolymere
sind. Sie werden mittels diverser Drucktechniken abgeschieden. Nach
der Abscheidung der Barriere schreitet man zur Dampfphasenbefreiung
der nicht mit Barrierematerial überzogenen
Funktionsgruppen. Die Benutzung einer Dampfphase ist notwendig,
denn das verwendete Barrierematerial ist löslich oder fortschwemmbar in
den Befreiungslösungsmitteln.
Aber der Dampfphasenschutz verursacht Umgebungstoxizitäts- und
-angriffsprobleme durch Materialdiffusion.
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Das
Dokument US-A-5 658 734 [4] beschreibt ein vollständig funktionalisiertes
Substrat und die Lithographietechniken mit Anwendung eines Photoresists
zur Definition der zu modifizierenden Zonen des Substrats, wobei
zwischen dem Substrat und dem Photoresist ein Polymer eingefügt wird,
das die Rolle des Puffers spielt. Dieses Verfahren benutzt also
ein Photoresist, das bei jedem zusätzlichen Zyklus eines Nukloetids
mit der Schleuder auf die auf dem Substrat abgeschiedene Polymerschicht
aufgebracht wird, was bei jedem Zyklus einen Lithographieschritt
erforderlich macht (zwei Abscheidungen mit der Schleuder, Tempern,
Bestrahlung durch eine Maske, Entwicklung des Resists, sodann Entwicklung
des Pufferpolymers). Nach den Schritten zur Befreiung der Funktionsgruppen
des Substrats und Hinzufügung
eines Nukloetids durch die in dem Polymer angebrachten Öffnungen
hindurch, werden die beiden Schichten in einem Lösungsmittel eliminiert. Bei diesem
Verfahren ermöglicht
das Polymer, den Photoresist von der biologischen Nukloetidschicht
zu isolieren. Dieses System erfordert also zusätzlich zu den Abscheidungsschritten
mittels Schleuder und Lithographie die Realisierung einer großen Anzahl
von Masken.
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Ein
weiterer Nachteil dieses Verfahrens beruht auf der Gefahr des "lift off" der Schutzschicht
im Laufe der Entwicklung des Schutzpolymers. Durch Diffusion des
Lösungsmittels
unter die Photoresistschicht kann es nämlich zu einer Ablösung des
Polymers auf den geschützten
Plätzen
kommen.
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Die
vorliegende Erfindung hat genau ein Verfahren zur Herstellung einer
Matrix aus chemischen oder biologischen Molekülsequenzen wie zum Beispiel
Oligonukloetiden zum Gegenstand, das ermöglicht, die Nachteile der oben
beschriebenen Verfahren zu beseitigen.
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Darstellung
der Erfindung
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
benutzt eine selektive lokalisierte Abscheidung eines Schutzpolymers
auf einem mit funktionalisierten Mikroküvetten strukturierten Substrat.
Das Schutzpolymer kann die ausgewählten Mikroküvetten momentan
schützen
während
einer chemischen Reaktion, die zur Kupplung mit dem nächsten Verkettungsmolekühl führt. Eine
mechanische Adressierung durch Mikroabscheidung auf den ausgewählten Mikroküvetten ersetzt
die photochemische oder elektrische Adressierung und die Lithographie-
oder Drucktechniken, die in den anderen kombinatorischen Syntheseverfahren
benutzt werden, zum Beispiel zur Herstellung von Oligonukleotid-Sonden.
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Nach
der Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Matrix
aus chemischen oder biologischen Molekülsequenzen, gebildet durch
verschiedene Verkettungen von chemischen Molekülen – oder M1, M2, ... Mn – durch
In-situ-Synthese auf einem mit Mikroküvetten strukturierten Substrat,
die folgenden Schritte:
- 1) Funktionalisierung
der Mikroküvetten
des Substrats durch Funktionsgruppen, die mit den Molekülen M1, M2,
... Mn eine kovalente Bindung bilden können;
- 2) Abscheidung eines Schutzpolymers auf mindestens einer der
Mikroküvetten
durch Mikroabscheidung von Tropfen des Polymers zur Bildung von
Abdeckungen (Überzügen) aus
dem festen Polymer in der (den) ausgewählten Mikroküvette(n);
- 3) Durchführung
einer oder mehrerer chemischer Reaktionen in flüssiger Phase, um die Kupplung
eines ersten Moleküls
M1 an die Funktionsgruppen der Mikroküvetten, die nicht von dem Schutzpolymer
bedeckt sind, zu gewährleisten;
- 4) Eliminierung des Schutzpolymers auf den Mikroküvetten,
die von diesem Polymer bedeckt sind, nach der ersten Reaktion oder
einer der nachfolgenden Reaktionen, die in dem Schritt 3) durchgeführt werden;
und
- 5) Wiederholung der Schritte 2), 3) und 4) zur Erzielung der
gewünschten
Verkettungssequenzen in jeder der funktionalisierten Mikroküvetten,
wobei
in dem Verfahren der Schritt 1) darin besteht, dass man: - a) die gesamte Oberfläche des Substrats und der Mikroküvetten mit
Funktionsgruppen funktionalisiert, dann diese Funktionsgruppen durch
eine labile Schutzgruppe schützt;
- b) ein Schutzpolymer auf allen Mikroküvetten durch Mikroabscheidung
von Tropfen des Polymers abscheidet zur Bildung von Überzügen aus
dem festen Polymer auf allen Mikroküvetten;
- c) die auf dem Substrat um die Mikroküvetten herum vorhandenen Funktionsgruppen
von der Schutzgruppe befreit, dann mit einer nicht-labilen blockierenden
Gruppe reagieren lässt
unter den Bedingungen, wie sie für
die chemischen Reaktionen zur Kupplung und zur Eliminierung des
Schutzpolymers angewendet worden sind; und
- d) das Schutz-Polymer aus allen Mikroküvetten eliminiert;
und
bei dem Schutz-Polymer, das ausgehend von einer Lösung in
einem Lösungsmittel
abgeschieden worden ist, den gebildeten Polymer-Film tempert durch
Erwärmen
des Substrats auf eine Temperatur von 50 bis 100°C, bevor der Schritt 3) oder
der Schritt c) durchgeführt
wird.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
also, durch eine gute Wahl des Schutzpolymers und eines Lösungsmittels
zur Auflösung
des Polymers, das kompatibel ist mit den Protokollen eines Syntheseautomaten,
die Synthese von Oligonukleotid-Matrizen in den in ein Substrat
geätzten
Mikroküvetten
oder Mikroreaktoren durchzuführen.
Zu diesem Zweck ordnet man einer mechanischen Adressierungsvorrichtung
(Mikroabscheidungsroboter oder Tintenstrahldruck) eines Schutzpolymers
einen automatischen Oligonukleotid-Synthetisator zu.
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Die
mechanische Adressierung besteht dann, selektiv eine Polymerabscheidung
auf den ausgewählten
Mikroküvetten
durchzuführen,
die auf den Mikroküvetten
eine angepasst feste und dichte Abdeckung bilden, um Zonen abzugrenzen
und zu selektieren, die aktiv sind gegenüber Reagenzien, die benutzt
werden für die
Addition der monomeren Einheiten der nächsten Verkettung.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
bietet die Möglichkeit
einer Auswahl von Schutzpolymeren, deren Schutz-, Unlöslichkeits-,
Dichtheits- und Abscheidungseigenschaften (kontrollierte Form und
Dicke) kompatibel und angepasst sind bezüglich eines oder mehrerer Schritte
des Synthesezyklus.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht,
das Schutzpolymer zu eliminieren, entweder nach der ersten Reaktion
des Kupplungszyklus oder nach einem vollständigen Kupplungszyklus.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht,
die Eliminierung dieser Polymerabdeckung einzuschließen in den
klassischen automatischen Oligonukleotid-Synthesezyklus, entweder in einem zusätzlichen
Spülschritt
in einem Lösungsmittel,
das kompatibel ist mit den üblicherweise
in dem automatischen Oligonukleotid-Synthetisator verwendeten (Acetonnitril,
Dichlormethan, Tetrahydrofuran).
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Vorzugsweise
realisiert man während
der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
einen Schutz der Funktionsgruppen der Mikroküvetten. In diesem Fall schützt man
die Funktionsgruppen der Mikroküvetten
durch eine labile Schutzgruppe, und der Schritt 3) umfasst eine
erste Befreiungsreaktion der Funktionsgruppen.
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Nach
der Erfindung können
die Moleküle
M1, M2, ..., Mn von verschiedener Art sein. Es kann sich zum Beispiel
um natürliche
oder synthetische Aminosäuren
handeln, L- oder
D-, um Nukleotide (RNA oder DNA), um Pentose oder Hexose. Im Falle
der Aminosäuren
kann die Anzahl der Moleküle
M1, M2, ..., Mn groß sein. Im
Falle der Nukleotide ist die Anzahl der Moleküle beschränkter, da sie A, T (oder U),
G und C einschließt.
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In
diesem Fall können
die Nukleotide die Form von Phosphoramiditen, von Phosphotriestern
oder von H-Phosphonaten haben, je nach Art der angewendeten Nukleotid-Synthese. Diese Moleküle umfassen
zwei reaktive Funktionen (mit Hydroxyl und mit Phosphor), von denen
eine, nämlich
die Hydroxylfunktion durch eine Schutzgruppe geschützt ist,
die vorzugsweise identisch ist mit der Schutzgruppe der funktionalisierten
Analyseplätze.
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Eine
entsprechende Schutzgruppe kann insbesondere eine Trytil- oder Tritylderivatgruppe
sein, zum Beispiel eine Dimethoxytritylgruppe.
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Wenn
man das erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung von Oligonukleotidsequenzen durch Phosphoramiditsynthese
anwendet, entspricht der Schritt 3) einem Synthesezyklus und umfasst
die Eliminierung der Trityl-Schutzgruppen, die Kupplung mit einem
Nukleotid, die Reaktion der Funktionsgruppen, die nicht mit dem
Nukleotid gekuppelt worden sind, mit einer blockierenden Gruppe,
und die Oxidation der Phosphoramidit-Gruppe des Nukleotids zu einem
Phosphat.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
erfolgen die Schritte zur Befreiung (Detritylierung), Kupplung, Blockierung,
Oxidierung und Eliminierung des Schutzpolymers in einem automatischen
Oligonukleotid-Synthetisator, wobei die Reaktionskammer so modifiziert
wurde, dass Substrate unterschiedlicher Größe behandelt werden können.
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Die
in dem Blockierungsschritt verwendete blockierende Gruppe ist nicht-labile
Gruppe unter den Eliminierungsbedingungen der Schutzgruppen der
Funktionsgruppen der Mikroküvetten.
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Zum
Beispiel kann man für
diese Blockierungsreaktion eine Lösung aus Dimethylaminopyridin
(DMPA) in Tetrahydrofuran und Lutidin benutzen.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
werden die Befreiungs-, Kupplungs-, Schutzmaterialeliminierungs-
und eventuell Oxidationsschritte durch Eintauchen des Substrats
in entweder der Reaktionskammer des Synthetisators oder in die entsprechenden
Reagenzienbäder
durchgeführt.
Nur der Adressierungsschritt der Mikroküvetten, der einem selektiven
Schutz der ausgewählten
Mikroküvetten
durch das Schutzpolymer entspricht, wird mit Hilfe der Mikroabscheidungstechnik
durchgeführt.
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Vorteilhafterweise
wird das Schutzpolymer in den ausgewählten Mikroküvetten durch
mechanische Adressierung im flüssigen
Zustand abgeschieden, indem man selektive Mikroabscheidungstechniken
des Typs piezoelektrischer Aktor, "pin and ring", Tintenstrahldruck, Archimedesschnecke
und Mikropipettierung benutzt.
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Die
Adressierung des Polymers durch Mikroabscheidung ermöglicht,
Mikroküvetten
während
einer oder mehrerer der vier Synthesereaktionen selektiv zu schützen, die
der Kupplung einer Nukleotid-Einheit entsprechen. Sie ermöglicht,
lokal auf die ausgewählten
Mikroküvetten
kalibrierte Tröpfchen
eines Polymers im gelösten
Zustand zu verteilen. Nach Verdampfung des Lösungsmittels bildet es auf
den Mikroküvetten
angepasste dichte Abdeckungen. Diese Adressierung erfolgt vorzugsweise
vor dem Detritylierungsschritt oder vor dem Kupplungsschritt, in
dem Oligonukleotid-Syntheseschritt.
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Die
Neuartigkeit des Verfahrens beruht auf den großen Möglichkeiten, die Wahl des Polymers
und seiner Schutzrolle an die verschiedenen Schritte der Oligonukleotidsynthese
anzupassen.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist die Wahl des Schutzpolymers sehr wichtig und muss einer bestimmten
Anzahl von Kriterien entsprechen.
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Zunächst muss
es möglich
sein, dieses Polymer, aufgelöst
in einem Lösungsmittel,
mit den weiter oben erwähnten
Mikroabscheidungstechniken abzuscheiden, um in den Mikroküvetten kalibrierte
und justierte Tröpfchen
zu bilden. Generell ist ein Tempern bei einer Temperatur von 50
bis 80°C
notwendig, um das Lösungsmittel
zu eliminieren und die Haftung auf dem Substrat zu verbessern.
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Im
Idealfall, wo das Polymer während
der vier Synthesezyklen schützt,
muss es inert sein und vorzugsweise ohne reaktive Funktionen, fähig zur
Kupplung mit den Synthesemolekülen
und -reagenzien. Es darf nicht löslich
sein in den in den Zyklusschritten verwendeten Lösungsmitteln und muss gegenüber diesen
Lösungsmitteln
eine Impermeabilität
aufweisen.
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In
Wirklichkeit genügt
es, wenn das Polymer seine Rolle als Schutzabdeckung im Wesentlichen
in dem Detritylierungsschritt oder in dem Kupplungsschritt spielt.
Es ist dann möglich,
das Polymer-Lösungsmittel-Paar
für den
gewählten
Schritt anzupassen und zu optimieren.
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Es
ist vorzuziehen, wenn das Schutzpolymer keine Funktionen mit freien
Wasserstoffen des Typs OH, NH2 oder COOH umfasst, die fähig wären, sich
mit den Molekülen
M1, M2, ..., Mn – zum
Beispiel Nukleotiden – zu
koppeln, um zu vermeiden, nutzlos Reagenzien zu verbrauchen, die
anschließend
mit dem Schutzpolymer eliminiert werden.
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Das
Polymer muss eliminiert werden mit einem gegenüber den Nukleotiden inerten
Lösungsmittel
und es muss in Lösung
zudem physikalisch-chemische Eigenschaften wie etwa eine Viskosität und eine
Oberflächenspannung
aufweisen, die seine Abscheidung in den Mikroküvetten durch die gewählte Mikroabscheidungstechnik
ermöglicht.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
erfolgt die Wahl des Schutzpolymers in Abhängigkeit von dem (den) Schritt(en),
in denen es die Mikroküvetten
schützen
muss, wobei seine Löslichkeit
in den Lösungsmitteln berücksichtigt
werden muss, die für
die Oligonukleotidsynthese benutzt werden können.
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Wenn
man den Schutz durch das Polymer nur während des Eliminierungsschritts
der Schutzgruppen der Funktionsgruppen sicherstellen will, etwa
während
des Detritylierungsschritts, genügt
es, ein Polymer zu wählen,
das unlöslich
ist in den Detritylierungsreagenzien, die im Allgemeinen gebildet
werden durch Dichloressigsäure
oder Trichloressigsäure
oder Lewis-Säure
des Typs ZnBr2 mit ungefähr
2–5% in
einem Lösungsmittel
wie Dichlormethan, Acetonitril oder Toluol.
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Als
Beispiele solcher Polymere kann nennen: die in Dichlormethan unlöslichen
Polyvinylalkohole, das Acetonnitril und das Toluol; die in Dichlormethan
unlöslichen
Polyhydroxystyrole; die Polystyrole, die in Acetonitrile unlösbaren Polyvinylcarbazole
und Polyimide; und die in Toluol unlöslichen Polyethylenoxide.
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Wenn
man einen Schutz der Mikroküvetten
durch das Polymer nur während
des Kupplungsschritts sicherstellen will, eignet sich ein Polymer,
das unlöslich
ist in dem zur Kupplung gewählten
Lösungsmittel,
im Allgemeinen Acetonitril.
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Zu
diesem Zweck kann man ein Polymer verwenden, das ausgewählt wird
aus der Gruppe, die gebildet durch Polymere und ihre Derivate vom
Typ der Polyvinylalkohole, der Polystryrole, der Polyvinylcarbazole und
der Polyimide, die in diesem Lösungsmittel
löslich
sind.
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Das
Schutzpolymer wird ebenfalls in Abhängigkeit von Lösungsmitteln
ausgewählt,
die seine Eliminierung durch Auflösung gewährleisten können. Vorzugsweise wählt man
Polymere, die löslich
sind in Lösungsmitteln,
die kompatibel sind mit denen, die üblicherweise in den automatischen
Oligonukleotid-Synthetisatoren verwendet werden, etwa Dichlormethan
(für die
Detritylisierung), Acetonitril (für die eigentliche Kupplung)
und Tetrahydrofuran (für
die Blockierung und die Oxidation). Jedoch können für die Detritylierung anstelle
des Dichlormethan andere Lösungsmittel
verwendet werden, zum Beispiel Acetonitril oder Toluol, ohne Leistungsverlust.
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In
der nachfolgenden Tabelle 1 werden verwendbare Polymere angegeben,
die geeignet sind aufgrund ihrer Eigenschaften der Löslichkeit
in diversen Lösungsmitteln,
ihrer Verwendbarkeit in einem oder mehreren Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens
und der Art ihrer Eliminierung.
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Unter
den Polymeren der Tabelle 1 ist der Polyvinylalkohol interessant
bzw. vorteilhaft, denn er kann in allen Schritten der Oligonukleotidsynthese
einen Schutz der Mikroküvetten
sicherstellen. Zudem ist er leicht verwendbar in den Mikroabscheidungsrobotern.
Jedoch ist seine Eliminierung weniger leicht, denn das Wasser und
das DMSO sind nicht Teil der Synthese-Lösungsmittel und erfordern daher
einen zusätzlichen
Schritt sowie eine Trocknung.
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Im
Falle der Herstellung der Sonden mittels eines Synthetisatorautomaten
(angepasster Probenträger),
gekoppelt mit einem Mikrospenderoboter (durch Kapillarität, piezo-elektrisch
oder vom "pin and
ring"-Typ, ist es
vorzuziehen, kein in Wasser lösliches
Polymer zu verwenden, das zugleich eine Abscheidung und einen Eliminierungsschritt
im gasförmigen
Milieu erfordern würde;
dies kann störend
sein für
die Fortsetzung der Synthese, die im wasserfreien Milieu durchgeführt wird.
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Um
jede zusätzliche
Trocknungsbehandlung zu vermeiden, ist es vernünftiger, zum selektiven Schutze der
Mikroküvetten
ein Polymer zu wählen,
das in einem wasserfreien Lösungsmittel
eliminierbar und mit dem Zyklus der in dem Synthetisatorautomaten
verwendeten Lösungsmittel
kompatibel ist.
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Das
Polystyrol kann zum Beispiel als selektives Schutzpolymer dienen
in dem in Acetonitrile (TCA 2%) durchgeführten Detritylierungsschritt,
in dem es unlöslich
ist; der nachfolgende bzw. nächste
Kupplungsschritt erfolgt in Acetonitril (Tetrazol); das Polymer
kann dann durch einen Spülzyklus
in Dichlormethan eliminiert werden, in dem es sehr löslich ist.
Zudem ist das Polystyrol inert und hat keine OH-Funktionen, fähig aktive
Nukleotide zu fixieren, und es kann auch seine Schutzrolle in dem
Kupplungsschritt spielen (in Acetonitil).
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Das
Polyhydrostyrol ist auch interessant bzw. vorteilhaft, denn es ist
leichter abzuscheiden als das Polystyrol und in einem klassischen
Lösungsmittel
des Synthetisators leicht zu eliminieren. Es kann jedoch nur den
Schutz in dem Detritylierungsschritt in Dichlormethan sicherstellen,
kann aber durch einen Spülzyklus
in Acetonitril vor dem Kupplungsschritt in diesem Lösungsmittel
eliminiert werden.
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Das
Polyethyloxid eignet sich auch nur zur Detritylierung unter der
Bedingung, dass diese in Toluol stattfindet, aber ist ist leicht
in CH3CN oder CH3Cl2 eliminierbar.
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Das
Polyvinylcarbazol und das Polyimid können einen Schutz während der
Detritylierungs- und Kupplungsschritte in CH3CN
sicherstellen und dann mittels CJ2Cl2 eliminiert werden, das eines der in dem
Synthetisator verwendeten Lösungsmittel
ist. Jedoch ist die Abscheidung dieser Polymere schwieriger.
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Die
Eliminierung des Schutzpolymers kann direkt in dem Synthetisator
erfolgen, in einem in das Protokoll des Zyklus des Synthetisatorautomaten
integrierten Spülschritt.
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Zum
Beispiel kann das in dem Detritylierungsschritt verwendete klassische
Lösungsmittel,
das Dichlormethan, ersetzt werden durch Lösungsmittel wie Acetonitril,
Toluol, Xylen oder auch ein halogeniertes aromatisches Lösungsmittel,
ohne Wirksamkeitsverlust bei der Detritylierungsreaktion durch das üblicherweise
benutzte saure Reagenz (TCA oder DCA).
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
hat zahlreiche Vorteile im Verhältnis
zu den Verfahren aus dem Stand der Technik.
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In
Bezug auf das Verfahren der Referenz [2], in dem für die In-situ-Synthese
eine photochemische Adressierung benutzt wird, oder der Referenz
[4], in dem ein Lithographieverfahren benutzt wird, vermeidet das
erfindungsgemäße Verfahren
die Notwendigkeit, Masken herzustellen, das heißt viele teure und langwierige
Operationen, denn die Anzahl der Masken ist gleich der Anzahl der
Moleküle
M1, M2, ..., Mn, welche die Sequenzen bilden. Zudem – im Falle
der photochemischen Adressierung – ist die Befreiung nicht total,
und je länger
die Sequenz ist, umso kleiner ist die Wahrscheinlichkeit, die gewünschte Sequenz
zu erhalten. Daher bildet man auf dem Substrat redundante Sequenzen,
was bei der Erfindung, in der die Befreiung total ist, nicht notwendig
ist.
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Im
Verhältnis
zu dem Verfahren der Referenz [1] ist das erfindungsgemäße Verfahren
leichter anwendbar, denn die Kupplungsreaktionen können mit
einem Überschuss
an Reagenzien durchgeführt
werden, während
gemäß Referenz
[1] die Kupplungsreaktionen mit einigen nl Reagenzien direkt auf
dem zu modifizierenden Analyseplatz unter speziellen Bedingungen
durchgeführt
werden, nämlich
in einer Stickstoff- oder Argonatmosphäre.
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Im
Verhältnis
zu der Referenz [3] ist das erfindungsgemäße Verfahren leichter anwendbar,
da die Mikroküvetten
oder Syntheseplätze
vorher definiert werden, der Schutz dichter ist durch das Anbringen
von festen Polymerabdeckungen, und die Befreiungsreaktionen nicht
in einer Dampfphase sondern einer flüssigen Phase direkt in einem
automatischen Synthetisator durchgeführt werden.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
erfordert die Polymer-Schutzabscheidung in Form einer Mikroabscheidung
auf den ausgewählten
Mikroküvetten
keine speziellen Vorkehrungen. Die einzige Bedingung besteht darin,
dass das Polymertröpfchen
die zu schützende
Mikroküvette überdeckt.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen besser aus der nachfolgenden
Beschreibung hervor, die selbstverständlich rein erläuternd und
keinesfalls einschränkend
ist und sich auf die beigefügten
Zeichnungen bezieht.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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Die 1A bis 1G zeigen
die verschiedenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung
einer Matrix aus Oligonukleotid-Sonden.
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Die 2 zeigt
das Profil einer mit Polymer gefüllten
Mikroküvette
(650 × 650 × 24 μm3).
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Die 3 und 4 sind
Draufsichten von Mikroküvetten,
mit Polymer gefüllt
oder nicht.
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Detaillierte
Darstellung der Realisierungsarten
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Um
das erfindungsgemäße Verfahren
anzuwenden, geht man von einem Substrat aus Glas oder vorzugsweise
Silicium aus, strukturiert durch Mikroküvetten mit einer Teilung von
150 μm bis
mehrere mm aber vorzugsweise einigen hundert μm, und einer Tiefe von ungefähr 10 μm. Diese
kalibrierten Mikroküvetten
werden durch klassische Methoden der Photolithographie und Ätzung hergestellt.
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In
der 1A sieht man das Substrat 1 mit den Mikroküvetten 3.
Die Mikroküvetten 3 werden
funktionalisiert durch hydrophile Funktionsgruppen 5 wie
etwa Hydroxylgruppen, die durch Schutzgruppen 7 geschützt werden.
Diese Schutzgruppen können
Dimethoxytritylgruppen sein, wie sie üblicherweise bei der Oligonukleotidsynthese
benutzt werden.
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Wenn
das Substrat eine Siliciumscheibe ist, kann die Funktionalisierung
der Analyseplätze
wie folgt realisiert werden.
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Die
Oberfläche
der Siliciumscheibe wird zunächst
auf thermischem Wege – zum
Beispiel über
eine Dicke von 5000 Å – zu SiO2 oxidiert, dann durch oxidierende Reinigung
im alkalischen oder sauren Milieu zu Si-OH aktiviert. Anschließend bewirkt
man eine Funktionalisierung der Gesamtoberfläche des Substrats durch Behandlung
mit einem funktionalisierten Silanisierungsmittel des Typs Aminosilan
oder Epoxysilan mit einem Bindungsmolekül oder Abstandhalter des Typs
Glykol, zum Beispiel ein Silan mit einer N(Bishydroxylmethyl)-Gruppe
und einen Abstandshalter zum Beispiel des Typs Polyethylengglycol.
Die Einführung
eines solchen Abstandhalters zwischen dem Silan des Substrats und
dem Oligonukleotid, das in der Folge synthetisiert wird, ist vorteilhaft,
denn es ermöglicht,
während
der Verwendung die Hybridisierungsleistung zu erhöhen. Man schützt die
reaktiven Funktionen durch eine Gruppe wie die Dimethoxytrityl-Gruppe
(DMT).
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Man
realisiert dann einen Schutz der gesamten Mikroküvetten durch Polymer- Abdeckungen, die
man durch einen Mikroabscheidungsroboter in Form eines Strahls kalibrierter
Tröpfchen
abscheidet.
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Nach
dem Trocknen der Tröpfen
befreit man die ODMT-Funktionen der nicht durch das Polymer geschützten Oberfläche des
Substrats durch Detritylierung im sauren Milieu. Man blockiert (capping)
diese reaktiven Funktionen der Oberfläche außerhalb der Mikroküvetten,
um die In-situ-Synthese der Oligonukleotide nur auf die Mikroküvetten zu
beschränken
und eliminiert dann das Polymer auf dem gesamten Substrat durch
Spülung
in einem Lösungsmittel.
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Anschließend führt man
Schritt 2) durch, bestehend aus dem Abscheiden eines Schutzpolymers 9 auf wenigstens
einer der funktionalisierten Mikroküvetten der Scheibe mit Hilfe
einer Mikropipette 11, etwa eines Spenderoboters oder durch
Druck mittels Strahl, wie dargestellt in der 1A.
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In
der 1B ist der nächste
Schritt dargestellt, darin bestehend, die Schutzgruppen 7 der
Funktionsgruppen 5 in den Mikroküvetten 3 der nicht
durch Schutzpolymer 9 geschützten Mikroküvetten zu
eliminieren. Man erhält
dann eine Scheibe, deren nicht durch das Schutzpolymer 9 geschützten Mikroküvetten 3 befreite funktionelle
Hydroxylgruppen 5 enthalten. Dieser Schritt kann durchgeführt werden,
indem man die Scheibe in eine saure Lösung taucht, zum Beispiel eine
Lösung
aus Trichloracetonsäure
(acide trichloroacétique)
in Dichlormethan CH2Cl2,
um die Tritylgruppen zu eliminieren.
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In
der 1C ist der nächste
Schritt 3) dargestellt, nämlich
die Kupplung eines Moleküls
M1 mit den funktionellen Hydroxylgruppen 5 in den nicht
durch das Schutzpolymer 9 geschützten Mikroküvetten 3 durch Reaktion.
Falls man eine Matrix aus Oligonukleotidsonden realisieren will,
werden die Moleküle
M1 durch Nukleotide wie Phosphoramidite, Phosphonate oder Phosphite
gebildet, je nach Art der zur Herstellung der Sonde benutzten Synthese.
In diesem Schritt realisiert man die Kupplung des ersten Nukleotids
M1-(Phosphoramidit) mit den Hydroxylgruppen 5, indem man
die Scheibe eintaucht in eine Lösung
des aktivierten Nukleotids M1 in Acetonitril unter Präsenz von
Tetrazol. Auf diese Weise erhält
man die in der 1C dargestellte Struktur.
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In
der 1D ist der nächste
Schritt dargestellt, in dem man die restlichen freien Hydroxylgruppen
blockiert, die nicht mit dem Molekül M1 reagiert haben, damit
sie nicht anschließend
mit den anderen Nukleotiden reagieren können, die für die verschiedenen sukzessiven
Kupplungen verwendet werden. Diese Reaktion kann bewirkt werden
durch das Anbringen einer blockierenden Gruppe 11, zum
Beispiel durch das Eintauchen der Scheibe in eine Lösung aus
Demethylaminopyridin (DMPA) in Tetrahydrofuran THF.
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Im
Falle der Herstellung einer Oligonukleotidsequenz durch die Phosphoramidite
benutzende Methode, schreitet man anschließend zu einer Oxidierung des
während
der Kupplung des vorhergehenden Schritts (1C) eingeführten dreiwertigen
Phosphors in stabileren fünfwertigen
Phosphor. Dies kann realisiert werden durch das Eintauchen der Scheibe
in eine oxidierende Lösung
aus Jod in einer Mischung aus Wasser, Pyridin und Tetrahydrofuran
(THF).
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Nach
diesem Oxidierschritt führt
man den Schritt 4) durch, in dem das Schutzpolymer 9 auf
den nicht-modifizierten Mikroküvetten
eliminiert wird. So erhält
man die in der 1E dargestellte Struktur. Diese Eliminierung
des Schutzpolymers 9 kann durch Auflösung in einem entsprechenden
Lösungsmittel
realisiert werden, indem man die Scheibe in dieses Lösungsmittel
eintaucht.
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Die
Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden also mit Ausnahme des Schritts zum Aufbringen des Schutzpolymers
durch das Eintauchen der Scheibe in die entsprechenden Reagenzien
und Lösungsmittel
gebildet, wenn notwendig gefolgt von Spülungen in verschiedenen Lösungsmitteln.
Diese Operationen können
in Rezipienten mit kontrollierter Atmosphäre stattfinden. Diese verschiedenen
Schritte des Eintauchens in die Bäder mit den verschiedenen Reagenzien
können
vorteilhaft in einer Reaktionszelle durchgeführt werden, die mit einem automatischen
Oligonukleotid-Synthetisator verbunden ist.
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Zudem
ist ein großer Überschuss
an Reagenzien in Bezug auf die Moleküle auf dem festen Substrat vorhanden,
was den Vorteil hat, dass Reaktionen mit einem Umwandlungsgrad von
praktisch 100% erzielt werden, was bei dem Verfahren der Referenz
[1] nicht der Fall ist, bei dem die Reaktionen durch Mikropipettierung der
Reagenzien auf die ausgewählten
Analyseplätze
bewirkt werden.
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Nach
diesem ersten Schritt zur Modifizierung der ausgewählten Mikroküvetten durch
das Nukleotid M1 kann man andere Mikroküvetten mit einem Molekül M2, ...
oder Mn modifizieren. In diesem Fall schützt man zunächst die schon modifizierten
Mikroküvetten
mit dem Schutzpolymer 9. So erhält man in der 1F dargestellte
Struktur. Selbstverständlich
können
weitere Mikroküvetten
des Substrats ebenfalls mit Schutzpolymer 9 überdeckt
werden, auch dann, wenn sie in den vorhergehenden Schritten nicht
durch das Molekül
M1 modifiziert worden sind. Nach dieser Operation eliminiert man
die Schutzgruppen 7 der hydrophilen Funktionsgruppen 5 der
nicht mit Schutzpolymer 9 überdeckten Mikroküvetten und
kuppelt mit diesen Funktionsgruppen 5 ein anderes Nukleotid
M2, indem man in gleicher Weise wie weiter oben vorgeht (1B und 1C).
Die 1G zeigt die hergestellte Struktur. Nach dieser
Operation kann man die Blockierung der Hydroxylgruppen, die nicht
reagiert haben, und dann eine Oxidierung des dreiwertigen Phosphors
in fünfwertigen
Phosphor durchführen.
Danach eliminiert man das Schutzpolymer in den nicht durch das Molekül M2 modifizierten
Mikroküvetten.
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Anschließend wiederholt
man diese verschiedenen Operationen bei den ausgewählten Mikroküvetten, um
die erwünschte
Verkettung der Moleküle
M1, M2, ..., Mn herzustellen, also Oligonukleotide verschiedener Verkettungen
in verschiedenen Mikroküvetten
des Substrats 1.
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Zum
Beispiel stellt man eine Matrix aus Oligonukleotidsonden auf einem
Siliciumsubstrat her, das Mikroküvetten
mit 100 × 100 × 30 μm umfasst,
eingeätzt
in das Silicium. Die Funktionalisierung der Mikroküvetten erfolgte
mit einem Silanierungsmittel, gebildet durch N,N-(Bis-hydroxyethyl)aminopropyltrimethoxysilan,
dessen OH-Gruppen geschützt
werden durch Dimethoxy- oder Monomethoxytritylgruppe.
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In
der Folge wird ein Realisierungsbeispiel einer Matrix aus zwei Oligonukleotidsequenzen
beschrieben.
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Man
geht von einem Substrat aus, das strukturiert wurde durch die Anwendung
klassischer Methoden der Mikroelektronik, nämlich Abscheidung, Photolithographie
und Ätzung.
Die 2 zeigt ein Mikroküvettenprofil 3.
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Nach
dem Zerschneiden des Siliciumsubstrats in Chips mit 2 × 2 cm2 werden die Protokolle zur Reinigung (1),
Silanisierung (2) und Bildung eines Hexaethylenglycolzweigs
(3) folgendermaßen
ausgeführt:
- – 1)
Das Substrat wird 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur in einer
NaOh-Lösung
(1 g NaOH, 3 ml entionisiertes DI-Wasser, 4 ml EtOH 95%) inkubiert,
dann mit DI-Wasser
gespült
und mittels Gebläse
bzw. Luftstrahl getrocknet.
- – 2)
Das Substrat wird eine Nacht lang bei 80°C in einer Lösung inkubiert, die 1 ml 3-Glycidoxypropyltrimethoxisilan,
3,5 ml Toluol und 0,3 ml Triethylamin umfasst. Es wird mit Aceton
gespült,
mittels Gebläse
bzw. Luftstrahl getrocknet und dann für 3 Stunden auf 110°C gebracht.
- – 3)
Das Substrat wird eine Nacht bei 80°C in einer Lösung inkubiert, die 15 μl Schwefelsäure enthält, dann in
Aceton gespült
und mittels Gebläse
bzw. Luftstrahl getrocknet.
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Das
Substrat wird anschließend
in einem speziellen Raum positioniert, das mit einem automatischen Oligonukleotid-Synthetisator
EXPEDITE 8909 verbunden ist. Das Syntheseprotokoll benutzt die Phosphoramidit-Chemie
und umfasst vier Schritte:
Detritylierung, Kupplung, Capping,
Oxidation. Das benutzte Protokoll arbeitet mit der 1 μmol-Skala.
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Die
sieben ersten Mütter
erfolgen in dem automatischen Synthetisator 3' ATC TCA C 5'. Das Substrat wird aus dem Synthetisator
genommen und in einen Polymerabscheidungsroboter gegeben (Cam/alot)
oder das Polymer wird auf der Hälfte
der Küvetten
aufgebracht bzw. wo das Polymer auf der Hälfte der Küvetten aufgebracht wird. Das
Füllprofil
des Polymers 9 in der Mikroküvette 3 ist in der 2 dargestellt.
Eine Draufsicht der Mikroküvetten 3 im
optischen Mikroskop zeigt die 3 für Größen von
300 μm mit
einer Teilung von 600 μm
und die 4 für Größen von 200 μm mit einer
Teilung von 400 μm.
Einige Mikroküvetten
sind leer.
-
Das
Substrat wird bei 85°C
neunzig Sekunden lang auf einer Heizplatte getempert. Das Substrat
wird wieder in den Synthetisator gegeben, um die Kupplung einer
Base C in der nicht mit Polymer bedeckten Hälfte der Küvetten zu bewirken. Das Polymer
wird in Wasser mit 85°C
eliminiert. Auf diesen letzteren Küvetten erfolgt eine neue Polymerabscheidung.
Nach dem Tempern wird das Substrat in dem Synthetisator positioniert, um
die Kupplung einer Base T in den anderen Küvetten zu bewirken. Nach dieser
Kupplung wird das Polymer eliminiert und das Substrat wird in dem
Synthetisator positioniert, wo die Gesamtheit der Küvetten die
folgenden Kupplungen erhält:
C AAA TAG. Am Ende dieses Schritts enthält die Hälfte der Mikroküvetten die
Sequenz NO 1: -3' ATC
TCA CTC AAA TAG 5'-
und die andere Hälfte
die Sequenz NO 2: -3' ATC
TCA CCC AAA TAG 5'-.
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Diese
beiden Sequenzen unterscheiden sich nur durch eine einzige Base.
Das Substrat wird aus dem Synthetisator entnommen und in während 45
min bei 60°C
in einer NH4OH-Lösung inkubiert, dann mit DI-Wasser
gespült
und mittels Gebläse
bzw. Luftstrahl getrocknet, um die Schutzgruppen der Nukleotidbasen
zu eliminieren.
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Die
Hybridisierung erfolgt mit dem komplementären Ziel der Sonde Nr.2: -3'CA TAG AGT GGG TTT ATC
CA 5' mit einer
Biotingruppe in 5'.
Das Substrat wird in eine Lösung
gegeben, die 690 μl
Hybridisierungspuffer H-7140 von Sigma und 10 μl des Ziels mit 1 OD (Menge
der Oligonukleotie, die – wenn
aufgelöst
in 1 ml Wasser – einen
Absorptionskoeffizienten von 1 aufweist, gemessen bei 260 nm in
einem Behälter
mit einem optischen Weg gleich 1 cm) enthält, und es wird bei 40°C während einer
Stunde mit leichtem Umrühren
inkubiert, dann zwei Spülungen
in einem Pufferbad SCC 2 × während 1
Minute und einem Pufferbad SCC 0,2 × während 1 Minute unterzogen,
um die nicht-hybridisierten Ziele zu eliminieren. Dann wird das
Substrat mittels Gebläse
bzw. Luftstrahl getrocknet. Die Kupplung des Biotins mit der die
Fluorophor-Gruppe Cy3 umfassenden Streptavidin-Gruppe erfolgt 10
bis 15 Minuten lang in einer Lösung
mit 5 μl
Streptavidin-Puffer Cy3 und 700 μl
Puffer PBS, TW, NaCl 0,5 M bei Umgebungstemperatur und Dunkelheit.
Das Substrat wird anschließend
in einem PBS, TW, NaCl 0,5 M umfassenden Pufferbad und dann in einem
PBS-Pufferbad gespült
und mittels Gebläse
bzw. Luftstrahl getrocknet.
-
Das
nach der Hybridisierung in dem Fluoreszenz-Konfokal-Mikroskop-System
GS 3000 erhaltene Fluoreszenzbild zeigt, dass die Hybridisierung
nur mit der komplementären
Sonde stattfindet.
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Genannte Referenzen
-
- [1]: US-A-5 474 796
- [2]: WO-A-97/39 151
- [3]: EP-A-0 728 520
- [4]: US-A-5 658 734